具有黄瓜CsMADS09基因的表达载体及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜MADS-box基因CsMADS09过表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它所编码的MADS-box蛋白因子为转录因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录反应。MADS-box转录因子是通过二聚体的形式以其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因的表达。
[0003]在植物中，MADS_box基因的分布几乎遍布整个植物界，除在双子叶植物拟南芥、金鱼草、葡萄、矮牵牛和杨树等植物中广泛存在外，在单子叶的水稻、玉米、小麦、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生长发育不同阶段如苗期、花期、在植物的不同部位，如营养器官根、茎、叶和生殖器官花、果实、种子中MADS-box基因都有不同程度的表达，并在其中起重要的调控作用。
[0004]MADS-box基因最显著的作用是参与花器官的形态建成。研究表明，双子叶拟南芥花器官的发育可以归纳为花发育的AB⑶E模型。该模型认为，花器官是A、B、C、D和E五类基因共同表达的结果，这五类基因基本上都为MADS-box基因。A类基因(APETALA1，API；APETALA2, AP2)单独决定萼片，A类基因和B类基因(APETALA3 , AP3 ; PISTILLATA, PI)共同决定花瓣，B类基因和C类基因(AGAM0US，AG)共同决定雄蕊，C类基因单独决定心皮，同时，C基因还参与分生组织决定性的调控。D类基因SEEDSTICK(STK)的功能与C基因部分重叠，影响胚珠的发育。E基因SEPALLATA1-SEPALLATA4(SEP1-SEP4)在全局上对花瓣、雄蕊和雌蕊进行调控。
[0005]MADS-box基因还参与其它生长发育过程，在拟南芥中分尚出了与开花早晚相关的△61^0^61^4^054略、50(:1、？0:、？1^、？1?1和5￥?等。在番茄中分离出一个与其成熟相关的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分离出一个在香蕉后熟过程中起重要作用的MuMADS 1基因。耧斗菜的FRUITFULL-like参与叶的发育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制茎的分生组织的生长。MADS-box基因通常以基因家族的形式存在，目前仅对极少部分的成员进行克隆的功能的鉴定分析，大多数的成员需要进行深入的研究，这也暗示MADS-box可能还参与许多我们还不清楚的发育和调控过程。
[0006]黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。2009年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。
[0007]MADS-box基因在植物的各个生长发育阶段起着重要的作用，但其在黄瓜中的功能还知之甚少，值得进一步的研究。我们的研究发现，黄瓜中的CsMADS09基因的过量表达的拟南芥顶端的果荚数明显增加，利用这一特性可运用到其它物种上来增加产量。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADS09基因花特异表达载体及及其增加果荚数量中的应用，该载体含有黄瓜CsMADS09，基因的上游连有双35S启动子。
[0009]本发明的上述植物表达载体为PHB_CsMADS09，由下述方法构建而成:
(1)根据CuGI(http://cucumber.genomics.0rg.cn/page/cucumber/index.jsp)上公布的黄瓜CsMADS09的序列(Csa013130)，设计两端引物- CsMADSOg-Fd’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-S ’(含Hind IlHi *)CsMADS09-R: 5 ’ -aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3’(含Xbal位点)。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS09全长。
[0010](2)回收CSMADS09的cDNA全长，将其连接至ljpMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS09。
[0011](3)使用Hind III和Xbal酶切pMD18_CsMADS09，回收CsMADS09片段，同时用HindIII和Xba頂每切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB_CsMADS09。
[0012]本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADS09在遗传改良中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS09转基因植株的果荚数量增加，萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官，可以应用在生产实践中改造花卉的形状和提高作物的产量。
[0013]
【附图说明】
[0014]图1为本发明中CsMADS09全长扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体PHB_CsMADS09的Hind III和Xbal双酶切电泳检测图；
图3为转基因植株的PCR鉴定图；
图4为过量表达CsMADS09的转基因拟南芥植株的表达分析，其中A为野生型;B-C为转基因植株株系。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0016]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于Τ0Υ0Β0公司，DNaseI购于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯;仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0017]实施例1:表达载体PHB_CsMADS09的构建 (1)引物设计:
根据CuGI(http://cucumber.genomics.0rg.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黄瓜 CsMADS09 的序列(Csa013130)，设计两端引物- CsMADSOg-Fd’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-S ’(含Hind IlHi *)CsMADS09-R: 5 ’ -aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3 ’ (含Xbal位点)。
[0018](2)黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾lmg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol(Invitrogen，USA)试剂法提取总RNA:加1.5 ml Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。12，000rpm离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混勾后室温放置15 min04°C12,000g离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30min04°C 12，000g离心10 min，弃上清。用lml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4°C 8，000g离心5min，弃上清。室温瞭干 10 min。用50uL H20(Rnase free)溶解RNA。
[0019](3)黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNasel处理后用于以01igo(dT)18为引物的反转录:取RNA 15 uL，加01igo(dT)i8 luL，混匀，70°C保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (10mM) 1 uL、RNasin (40U/uL) 1 uL、M_MLV (200U/uL) luL，总体积20 uL，混匀，42°C保温60min，95°C lOmin 灭活M-MLV酶活性，_20°C保存。
[0020](4)CsMADS09 基因的扩增
设计特异性引物:CsMADS09-F和CsMADS09-R为引物，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-Plus进行PCR扩增，PCR 反应条件为:94°C 5 min；94°C 30 s；55°C 30 s；68°C 1.0 11^11，40个循环;681 5 minoPCR产物用1.5%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小与预期大小基本一致(图1)。
[0021 ] (5)CsMADS09片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0022](6)CsMADS09 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μ1、10Χ Taq DNA聚合酶缓冲液2yl、10mM dNTP 2yl、Taq DNA聚合酶2μ1;72°C处理45 min;先加0.18 mL无菌水，再加20μ1 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀2hr ,12, OOOrpm，4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20yL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20°C保存备用