一种利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌的构建方法。
【背景技术】
[0002] 异丁醇作为未来能源的战略重点之一，也是我们国家生物质能源发展的内容之 一。目前国内外工业化生产异丁醇主要釆用化学合成法，例如由低碳醇合成异丁醇，由合成 气生产异丁醇，由丙烯羰基合成异丁醇等。化学方法合成的异丁醇工艺繁琐，催化剂价格 高。同时，随着近年来石油价格的高涨与持续减少和异丁醇需求的增长，再加之羰基合成醇 装置的盈利利润不高，一些生产商关停部分装置，而转向其他产品发展，使得异丁醇供应形 势十分紧张。虽然近年来，国内的羰基醇装置的建成和调整装置，使异丁醇供需矛盾将有一 定改善，但由于生产异丁醇原料的严重不足和催化剂价格昂贵，导致异丁醇供应不能满足 当前的需要，市场缺口仍然很大。生产异丁醇的原料供应对化学法大量合成异丁醇形成了 严重制约，并且在合成过程中造成的严重环境问题，使人们不得不寻找新的异丁醇合成方 法，同时更加意识到生物合成异丁醇具有良好的发展前景。但生物合成法生产的异丁醇主 要是通过粮食发酵生产正丁醇中的少量副产物。因此，利用生物合成法直接发酵生产异丁 醇被视为未来发展的重要方向。
[0003] 燃料乙醇和丁醇已经通过酿酒酵母和丙酮丁醇梭菌发酵生产达到了工业化的程 度，而到目前为止，一直没有发现有原始菌株可以直接合成异丁醇。随着合成生物学的发 展，利用合成生物学的方法改造其他不产异丁醇的微生物来生产异丁醇已经成为可能。 2008年James教授等利用代谢工程手段对大肠杆菌进行了改造，使其能够利用葡萄糖生产 异丁醇，为构建高产异丁醇基因工程菌提供了新的思路，开启了生物合成异丁醇的大门。此 后，通过人工构建工程菌株生产异丁醇的方法得到广泛关注。虽然利用代谢工程手段可以 实现异丁醇的直接生物发酵，但是，现有构建的异丁醇生产菌株所利用的基质主要集中在 一些简单碳水化合物如葡萄糖、蔗糖等，致使产异丁醇成本居高不下，严重阻碍了生物异丁 醇技术的规模化生产。纤维原料是世界上最丰富、最廉价的有机碳水化合物。纤维原料直接 生物转化产异丁醇是一个具有巨大潜力的新领域，它是指仅利用一种微生物产生的纤维素 酶降解纤维素后产生的糖仍由同一株菌来完成发酵的过程，此方法不仅实现了废物资源 化、无害化，同时也实现了发酵过程的简单化、经济化，可谓是生物转化纤维废弃物产异丁 醇最为理想的一种形式。但由于纤维原料结构的复杂性和异质性，所以，迄今为止以纤维素 为底物发酵生产异丁醇的基因工程菌鲜有报道。2011年美国学者Liao等对能够降解纤维素 的解纤梭菌进行基因改造构建非发酵途径生产异丁醇的工程菌株，但由于转入基因与宿主 菌株基因GC含量差异较大、好氧与厌氧环境的差异造成异丁醇的产量只有0.66g/L。因此， 如何能够在具有高效降解纤维素能力的基因工程宿主菌中合理构建异丁醇合成途径，找到 人工合成途径中影响异丁醇合成的关键基因，明确相关调控机制，并通过基因工程技术手 段形成高效纤维异丁醇发酵生产具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌的构建方法。
[0005]本发明一种利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌的构建方法，是按照以下步骤进行 的：
[0006] -、提取酿酒酵母(S. cerevi s iae)的总RNA进行反转录获得cDNA，根据苯丙酮酸脱 羧酶基因和乙醇脱氢酶基因设计引物aroF/R和adhF/R，然后PCR得到苯丙酮酸脱羧酶基因arolO和乙醇脱氢酶基因adh2;
[0007] 二、将苯丙酮酸脱羧酶基因arolO和乙醇脱氢酶基因adh2利用引物aroF和adhR进 行PCR扩增，并插入BamH I、Bgl II、Xho I和Nhe I四个酶切位点，连接形成融合片段BamH I-Bgl II-arol〇-Xho I-adh2-Nhe I，然后用BamH I和Nhe I对上述融合片段进行双酶切， 同时对表达载体PMA5进行双酶切;将双酶切后的苯丙酮酸脱羧酶基因arolO和乙醇脱氢酶 基因adh2的融合片段与双酶切后的表达载体pMA5连接，再热激转入大肠杆菌ToplO菌株中， 鉴定正确后，获得重组质粒PMA5-RD;
[0008] 三、根据蜡样芽孢杆菌(B.cereus)全基因组序列，设计引物alsF/alsR，然后以蜡 样芽孢杆菌(B.cereus)全基因组DNA为模板扩增得到两端含有酶切位点BamHΙ/BglII的 alsS基因片段，并通过BamHI和BglII分别酶切alsS基因片段和步骤二得到的重组质粒 PMA5-RD，然后将酶切后的alsS基因片段与重组质粒pMA5-RD连接，构建表达质粒pMA5-SRD; 将表达质粒PMA5-SRD电击转入錯样芽孢杆菌(B·cereus)菌株中，涂布于含有50yg/mL卡那 霉素抗性LB平板进行筛选，经验证正确的阳性转化子即为工程菌株；
[0009] 四、通过同源重组法敲除步骤三得到的工程菌株中丙酮酸代谢旁支途径上的两个 关键酶基因pflB及pta，最终得到利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌。
[0010] 本发明优点：①蜡样芽孢杆菌对于异丁醇有较高的耐受能力，而在异丁醇的生产 过程中异丁醇对于细胞的毒性限制了异丁醇的产量一直以来都是关键问题，因此利用蜡样 芽孢杆菌产异丁醇具有重要意义;②本发明在蜡样芽孢杆菌里构建了合成异丁醇的代谢途 径，引入了外源基因adh2和arolO,过表达内源基因alsS，并敲除了竞争途径关键基因pflB 与pta，构建的利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌能够高效生产异丁醇，最终产量可达到 1.310g/L;③本发明得到的基因工程菌株可以分解纤维素生物合成异丁醇，运用能够降解 纤维素的菌株发酵产生异丁醇，使得发酵过程中底物成本大大降低，显示了蜡样芽孢杆菌 在发酵产生异丁醇方面巨大潜力与价值，在能源和环境领域具有重大意义。
【附图说明】
[0011] 图1为基因arolO核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，1、2为基因arolO;
[0012] 图2为基因adh2核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，3、4为基因adh2;
[0013] 图3为基因arolO与adh2融合片段RD的核酸电泳图，其中Μ为DL10000DNAMaker，RD 为融合片段；
[0014] 图4为基因alsS核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，l、2为基因alsS;
[0015] 图5为基因pflB上下游序列核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，l、2为上有片段 pflU，3、4为下游片段pflD;
[0016] 图6为融合片段pflUD核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，l~3为融合片段 pflUD；
[0017] 图7为氯霉素抗性基因cam核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，1、2为氯霉素抗 性基因cam;
[0018] 图8为基因pta上游序列的核酸电泳图，其中Ml为DL2000DNAMaker，ptaU为上游片 段；
[0019] 图9为基因pta下游序列的核酸电泳图，其中Ml为DL2000DNAMaker，ptaD为下游片 段;及融合片段ptaUD;
[0020] 图10为融合片段ptaUD的核酸电泳图，其中M2为DL5000DNAMaker，ptaUD为融合片 段；
[0021] 图11为四环素抗性基因tet核酸电泳图，其中Μ为DL2000DNAMaker，l、2为四环素抗 性基因tet;
[0022] 图12为实施例一构建的纤维素发酵生产异丁醇工程菌和蜡样芽孢杆菌降解纤维 素发酵生产异丁醇过程中生物量的测定结果;其中a为蜡样芽孢杆菌，b为纤维素发酵生产 异丁醇工程菌；
[0023]图13为实施例一构建的纤维素发酵生产异丁醇工程菌和蜡样芽孢杆菌降解纤维 素发酵生产异丁醇过程中底物利用的测定结果;其中a为蜡样芽孢杆菌，b为纤维素发酵生 产异丁醇工程菌；
[0024]图14为实施例一构建的纤维素发酵生产异丁醇工程菌和蜡样芽孢杆菌降解纤维 素发酵生产异丁醇过程中还原糖积累的测定结果;其中a为蜡样芽孢杆菌，b为纤维素发酵 生产异丁醇工程菌；
[0025]图15为实施例一构建的纤维素发酵生产异丁醇工程菌和蜡样芽孢杆菌降解纤维 素发酵生产异丁醇过程中异丁醇产量的测定结果;其中a为蜡样芽孢杆菌，b为纤维素发酵 生产异丁醇工程菌。
【具体实施方式】
[0026]【具体实施方式】一：本实施方式一种利用纤维素发酵生产异丁醇工程菌的构建方 法，是按照以下步骤进行的：
[0027] -、提取酿酒酵母(S. cerevi s iae)的总RNA进行反转录获得cDNA，根据苯丙酮酸脱 羧酶基因和乙醇脱氢酶基因设计引物aroF/R和adhF/R，然后PCR得到苯丙酮酸脱羧酶基因arolO和乙醇脱氢酶基因adh2;
[0028] 二、将苯丙酮酸脱羧酶基因arolO和乙醇脱氢酶基因adh2利用引物aroF和adhR进 行PCR扩增，并插入BamHI、Bg