基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶i的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于离子束生物技术和分子生物学领域，具体涉及离子束介导基因生产辅 酶I方法。
【背景技术】
[0002] 在酶的六大类型中，有百分之三十左右是氧化还原酶，氧化还原酶在在制药、食 品、精细化工、农药等领域具有重要的用途，它的应用也越来越受到人们的重视，而大部分 氧化还原酶催化作用的发挥需要烟酰型辅酶的参与，辅酶I在生物氧化过程中起递氢作用， 活化各种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，增加物质转运和调节控制，改善代 谢功能。NAD+和NADH的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多，每克辅酶I大约要700 元左右，由于氧化还原酶应用广泛而辅酶价格昂贵，使得辅酶工业化生产逐渐成为研究热 点。
[0003] 1986年，受离子注入材料表面改性研究的启发，中国科学院等离子体物理研究所 与安徽省农科院水稻所合作将低能离子注入应用于水稻的品种改良，获得极大的成功。随 后离子注入被用于微生物和农作物的基因组改良，大量研究表明低能离子与生物体之间具 有动量传递、能量沉积、粒子注入和电荷交换的过程。离子束介导是通过一定剂量和能量的 离子束对细胞壁的溅射作用在破坏细胞壁或细胞膜上产生微孔通道，促进外源遗传物质进 入细胞;其次，用于注入的带正离子降低了细胞表面的负电性，从而减弱了对带负电的外源 DNA的排斥力，从而促进了外源DNA的吸附和进入。再者，离子束可以直接和间接的打断细胞 内的双链DNA，以便外源DNA的整合和重组。
[0004] 众所周知，很多疾病的起因大多是因为体内糖、脂肪和蛋白质代谢不良而引起，而 辅酶I是参与体内乙酰化反应、氧化还原反应和能量代谢的关键辅酶，对体内糖、脂肪和蛋 白质代谢起重要作用。如何强化上述糖、脂肪和蛋白质代谢已成为药物研发主攻方向之一。
[0005] 现在国内外主要通过提取法、发酵法、生物合成法、强化法、和有机合成法等方法 制备辅酶I。国内一直利用离子交换树脂从酵母中生产辅酶I，但是产品得率和纯度较低，虽 然工艺成熟，但是耗费大量能源和材料，以及原料的昂贵，使得辅酶I的生产和后续产品研 发收到了极大限制，大肠杆菌因培养条件简单、遗传背景清楚、生长快、发酵周期短、等诸多 优点，在基因工程领域成为使用最广泛的宿主菌，基因工程菌株大量表达合成原本在野生 菌株中不能或微量表达的蛋白和不能合成的有机化学品。而实现产品的工业化生产与成熟 的重组菌发酵工艺是紧密相关，不可逾越的，因此实现基因工程技术和工程菌的发酵工艺 的有机结合，无疑会为重组产品实现大规模生产奠定基础。
[0006] 尽管许多微生物在自然状态下都能产辅酶I，但绝大多数的辅酶产量极低，而通过 常规育种技术耗时费力，难以筛选到产辅酶I的高产菌株，这就造成了生产成本居高不下， 限制了其工业化生产。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生 产辅酶I的方法，以克服现有技术的不足，提供一种新的辅酶I生产技术，可大幅提高发酵液 中辅酶I的含量，其含量可以稳定在l〇g/L。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为： 一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，包括如下步骤： 1)将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体； a) 将步骤1)的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌； b) 利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆 菌； c) 将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。
[0009]步骤1)所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhiziumrobertsii)ARSEF23的NRK基因片段MAA_05394,所述载体为pet28a。
[0010] 步骤2)中离子束介导的能量为14~18KeV，剂量(80~200)X1014ions/cm2,靶室真空 度为（1.0~2.0)X10_3Pa。优选为离子束介导的能量为18KeV，剂量170X1014ions/cm2,靶室 真空度为1.6X10-3Pa。
[0011]步骤3)选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。
[0012]步骤4)中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分:碳源2-6%、氮源0.5-1%，无 机盐0.01-0.1%，生长因子0.1-0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、蔗糖和甘 油中的至少一种;氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种;无机盐为氯化钠、 硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种;生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至少一 种。
[0013] 步骤4)中发酵采用高密度发酵，接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34°C， 摇床转速为200_250r/min。接种后检测0D在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG诱导培养 12-16h后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h。其中表面活性剂为十二烷基 苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。
[0014] 有益效果： 本发明将烟酰胺核苷激酶基因基因片段，经分子生物学手段构建表达载体，通过离子 束介导方法将表达载体导入大肠杆菌，得到遗传稳定性良好的高产辅酶I的重组大肠杆菌， 可以大幅提高发酵过程中辅酶I的含量;相对于传统技术，由于离子束射程的可控性和可聚 束的特点，可精确控制被刻蚀受体表面形成转基因通道的直径和深度，有利于外源基因转 移、整合和表达而且离子束的溅射属于冷加工范畴，与传统转到技术相比，加工精度高，可 以不伤及邻近组织和细胞器。
[0015]本发明所导入的烟酰胺核苷激酶可以高效的将底物腺嘌呤和烟酰胺转化成产物 辅酶I，在发酵后期添加阴离子表面活性剂，可以将胞内的辅酶I泄露到细胞外，这样可以省 去传统方法中需要使用昂贵破壁设备，大大节约了生产成本，易于后期的分离提取。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施实例对本发明做进一步描述，可以更好地理解本发明。然而，本 领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说 明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017]实施例1本实施例说明基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法 1、设计合成带有EcoR頂每切位点的上游引物和带有BamHI酶切位点的下游引物(下 划线部分为相应的酶切位点）， Primer1 上游引物：5'-CGGAATTCATGCCCAAATCCCTCATAATAGG-3' ； Primer2下游引物：5'-CGGGATTCCTATGGGTGCTTCCTCAGTT-3'〇
[0018] 2、以MetarhiziumrobertsiiARSEF23基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段 MAA_05394(GeneID: 19259680)，反应条件为：95°C，5min; (95°C30s，60°C60s，72°C 1.5min，30个循环）；72°C，10min。纯化扩增出的MAA_05394基因（参照TakaraDNA片段纯化 试剂盒说明书)和克隆质粒pet28a(购自Takara公司）分别用EcoRI和bamHI双酶切、连接转 化至DH5a感受态细胞(购自Takara公司），使用EcoRI和bamHI双酶切鉴定重组质粒pet28a-phzM，得到大小为1000bp左右的条带，酶切结果表明，重组质粒pet28a_phzM构建成功，获 得重组质粒pet28a_phzM。
[0019] 3、将步骤2)的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌:取已培养好的大 肠杆菌BL21用无菌水制成浓度大约为1X106个/mL孢子悬浮液;取100yL孢子悬浮液加入 50yL步骤2)构建的重组质粒pet28a-phzM，均勾涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在能 量为18Kev，注入剂量为170X1014ions/cm2，靶室真空度为1.6X10_3Pa进行氮离子注入介 导，注入完毕后，在无菌环境下用lml无菌水进行洗脱;取洗脱液50yL在无菌条件下均匀涂 布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培养基上，在37°C下培养12-24小时，即可获得重组大肠 杆菌。
[0020] 实施例2 从实施例1选择性培养基上挑取三个单菌落，分别记为S1~S3,其形态学及生理化学特 性： 菌落形态:光滑、圆润、有光泽、乳白色、圆形或椭圆形；需氧方式:异养兼性厌氧型；菌 落大小：0.5~3μπι;生长温度:28-37°C;最适pH为7.0-7.2;菌落形态:短杆;革兰氏染色为 阴性。
[0021 ]传代发酵试验结果见表1 表1重组大肠杆菌的遗传稳定性
从遗传稳定性实验结果分析可知，经过6次传代试验，重组大肠杆菌发酵产辅酶I基本