用于预防或治疗宫颈癌的、包含人乳头瘤病毒变形体及免疫增强剂的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于预防或治疗宫颈癌的、包含人乳头瘤病毒（human papillomavirus;HPV)变形体及免疫增强剂的组合物。更具体地，融合蛋白通过诱导HPV16 和18型抗原特异性免疫应答治疗由HPV引起的肿瘤。所述融合蛋白包括融合多肽 (Polypeptide)、信号肽及免疫增强肽，所述融合多肽被重组，以使作为人乳头瘤病毒16和 18型的抗原E6、E7的三维结构变形。
【背景技术】
[0002] 众所周知，宫颈癌（cervicalcancer)是由于受人乳头瘤病毒16和18型等的高危 型人乳头瘤病毒的感染而引起的疾病（zurHausen，Hetal.BiochemBiophysActa1996，1288;F55-F78,MarkHetal.JNatlCancerInst1993,85;958-964)。在HPV蛋白 中E6、E7蛋白对宫颈癌的发病起主要作用，而且已确认在宫颈癌患者的肿瘤组织中表达 99%，从而成为制备用于治疗和预防宫颈癌的疫苗的主要祀物质（vonKnebelDoeberitz etal.Int.J.Cancer1992,51 ;831_834)J6与已知用作肿瘤抑制蛋白p53结合，通过促进 P53的分解，用细胞凋亡(apoptosis)途径阻止细胞周期的进行。E7与作为肿瘤抑制因子的 视网膜母细胞瘤蛋白pRb(retinoblastomaprotein)结合，通过使之失活并促进其分解，诱 导细胞周期进入S期（Cobriniketal.，TrendsBiochemSci1992,17:312-5)。
[0003]然而，为治疗宫颈癌，在使用通过同时表达HPV16的E6、E7蛋白的核酸序列的组合 物的临床试验中，其疗效并不显著（GarciaFetal.ObstetGynecol2004,103;317_ 326)。此结果表明，仅施用HPV抗原是无法发生足以治疗或抑制宫颈癌的抗原特异性免疫应 答的。
[0004]因此，为治疗子宫癌，需增强E6、E7的免疫原性（immunogenicity)，并且需消除所 述蛋白的致癌能力。
【发明内容】
[0005]技术问题 本发明的目的在于，提供用于预防或治疗由HPV引起的疾病的新型融合蛋白及编码所 述融合蛋白的多核苷酸(polynucleotide)。所述融合蛋白可抑制HPVE6、E7蛋白的致癌能 力并展现增强的免疫原性。
[0006]本发明的另一个目的在于，提供表达所述融合蛋白的重组载体（recombinant vector)、包含所述载体的宿主细胞以及用所述宿主细胞表达融合蛋白的方法。
[0007]本发明的另一个目的在于，提供用所述融合蛋白的、用于预防或治疗由HPV引起的 疾病的组合物。
[0008]本发明的另一个目的在于，提供用所述组合物的、用于预防或治疗由HPV引起的疾 病的方法。
[0009] 技术方案 为达到上述目的，一方面，本发明提供融合蛋白，该融合蛋白包括:融合多肽，即三维结 构变形的、源于人乳头瘤病毒16和18型并包含SEQIDNO: 1氨基酸序列的E6、E7;用于分泌 所述融合多肽的信号肽;和免疫增强肽。
[0010] 另一方面，本发明提供多核苷酸，该多核苷酸用于编码本发明的融合蛋白。
[0011] 另一方面，本发明提供重组载体，该重组载体包括本发明的多核苷酸。
[0012] 另一方面，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞由本发明的重组载体转化而成。
[0013]另一方面，本发明提供用于表达本发明的融合蛋白的方法，该方法是通过培养本 发明的经转化的宿主细胞完成的。
[0014]另一方面，本发明提供用于预防或治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的组合物，该 组合物包括作为活性成分的、选自本发明的融合蛋白、由表达所述融合蛋白的重组载体转 化而成的宿主细胞及其均楽Xhomogenate)中的一种或多种的物质。
[0015]另一方面，本发明提供用于预防或治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法，该方 法包括向需要者施用有效剂量的本发明的组合物的步骤。
[0016]有益效果 本发明所制备的融合蛋白通过诱导高的HPV16和18型抗原特异性免疫应答来治疗由HPV引起的肿瘤，所述融合蛋白包括为改变源于HPV16和18型E6、E7蛋白的三维结构而被重 组的融合蛋白、用于向细胞外分泌该融合蛋白的信号肽及免疫增强肽。
【附图说明】
[0017]图1展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本发明 的GX-188E治疗后展示的HPV16的E6特异性⑶8+T细胞应答的图。
[0018] 图2展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本发明 的GX-188E治疗后展示的HPV16的E7特异性⑶8+T细胞应答的图。
[0019]图3展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本发明 的GX-188E治疗后展示的HPV18的E6特异性⑶8+T细胞应答的图。
[0020]图4展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本发明 的GX-188E治疗后展示的HPV18的E7特异性⑶8+T细胞应答的图。
[0021 ]图5展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本发明 的GX-188E治疗后展示的抗癌效果的图。
【具体实施方式】
[0022]下面将详细地说明本发明的内容。
[0023]本发明涉及融合蛋白，该融合蛋白包括:源于人乳头瘤病毒16及18型并包含SEQ IDNO: 1氨基酸序列的三维结构变形的E6、E7融合多肽；用于分泌所述融合多肽的信号肽； 和免疫增强肽。
[0024]本发明的融合蛋白包括融合多肽，该融合多肽被重组以使源于人乳头瘤病毒16及 18型的E6、E7的三维结构变形。更具体地，所述融合多肽由源于人乳头瘤病毒16型的E6蛋白 的第1~85位的氨基酸、E7蛋白的第1~65位的氨基酸、E6蛋白的第71~158位的氨基酸、E7 蛋白的第51~98位的氨基酸和源于人乳头瘤病毒18型的E6蛋白的第1~85位的氨基酸、E7 蛋白的第1~65位氨基酸、E6蛋白的第71~158位的氨基酸、E7蛋白的第51~105位的氨基酸 组成。
[0025]最为具体地，融合多肽可包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
[0026]此外，所述信号肽指包括约20~30个氨基酸的肽，所述肽能将在细胞内表达的蛋 白，尤其将包含E6、E7融合多肽的蛋白分泌至细胞外。而且，用于编码所述肽的核酸序列被 称为"分泌信号序列"。由于本发明的E6、E7融合多肽是在受病毒感染的细胞的核内表达的 蛋白（nucleusprotein)，其免疫力弱。因此，由分泌信号序列表达的信号肽诱导三维结构 变形的E6、E7分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答（humoralimmune response)及细胞免疫应答(cellularimmuneresponse)。
[0027]所述信号肽可使用包括哺乳动物等的高等真核细胞内的信号肽，如tPA(组织型纤 溶酶原激活物）、HSVgDs，或可使用生长激素等的分泌信号序列。优选地，可使用tPA。更优 选地，可包含SEQID N0:2的氨基酸序列。
[0028]此外，免疫增强肽指激活与免疫应答相关的细胞(如，树突状细胞等）以增强免疫 应答的肽。
[0029]所述免疫增强肽可使用CD40配体、Flt3配体(fms样酪氨酸激酶3配体）、鞭毛蛋白 或0X40等。优选地，可使用Flt3配体。所述Flt3配体是能够诱导树突状细胞（dendritic cell，DC)的增殖与成熟的因子，经抗原可增强免疫应答，而且在与肿瘤抗原融合时具有能 非常有效地减少肿瘤的效果。更优选地，所述Flt3配体包含SEQIDN0:3的氨基酸序列。
[0030]另一方面，本发明涉及用于编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。
[0031] 所述多核苷酸用于编码本发明的融合蛋白，所述E6、E7融合多肽可由SEQIDN0:4 的碱基序列编码而成，但不限于此。此外，所述信号肽可由SEQIDNO:5的碱基序列编码而 成，但不限于此。此外，所述免疫增强肽可由SEQIDN0:6的碱基序列编码而成，但不限于 此。
[0032]此外，本发明的多核苷酸可通过化学合成方法或遗传工程技术而制备。化学合成 方法为本领域技术人员所熟知的，可使用任何方法。此外，也可通过委托商业核酸合成及制 造商购买。当通过遗传工程技术制备时，例如，通过分别制得用于编码已知的E6和E7融合多 肽、信号肽和免疫增强肽的核酸片段，连接这些片段以符合读框来制备。所述制得核酸片段 的方法为本领域已知的，本领域技术人员可通过适当的限制酶容易将其连接。在本发明的
【具体实施方式】中，将公开通过化学合成法制备的方法。
[0033]另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的重组载体。
[0034]在本发明中，"载体"指包括外源DNA的遗传结构，所述外源DNA被插入于编码