一种宽壳全海笋线粒体coi基因扩增引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记筛选技术领域，具体涉及一种宽壳全海笋线粒体coi基因扩 增引物。
【背景技术】
[0002] 宽壳全海舆（Barneadilatata)隶属于软体动物门（Mo1lusca)，双壳纲 (Bivalvia)，海螂目（Myoida)，海舆科(Pholadidae)，全海舆属(GenreBarneaLeach)，分 布于菲律宾、日本及我国沿海；多在河口附近的软泥底中潜伏生活，可潜入泥中很深。宽壳 全海笋作为分布中国沿海的贝类，富含蛋白质和维生素，肉味鲜美。在我国福建、浙江等地 均有人工养殖。关于宽壳全海笋人工繁殖、生殖生长、生理生化方面的研究已经很多，但是 基于分子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状对宽壳全海笋种质资源的开发利用 和保护极其不利。线粒体脱氧核糖核酸(MitochondrialDNA即mtDNA)具有单亲遗传、无重 组、中性进化等特性，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。mtDNA中的C0I基因是进化速率 相对快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性蛤分子进化方面得到广 泛的应用。由于F〇lmer(1994)设计的通用引物C0IL1490和C0IL2198在宽壳全海笋中的扩增 结果不理想，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示大部分个体无扩增条带。目前海笋科线粒体C0I 基因片段扩增出来的较少，在美国国立生物技术信息中心仅有12条序列，而宽壳全海笋仅2 条序列。开发实用性较好的C0I基因扩增引物可有效的解决这些问题，也可为宽壳全海笋的 多样性评估、资源保护和利用、遗传育种等方面奠定基础。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种宽壳全海笋线粒体C0I基因适用性好的引物及其鉴别方法，从 而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供一种宽壳全海笋C0I基因，其核苷酸序列为SEQIDNO: 1;
[0005]上述的基因序列用于设计检测宽壳全海笋的扩增引物；
[0006]本发明另一个方面提供一种宽壳全海笋线粒体C0I基因扩增引物，引物的序列信 息如下：
[0007]上游引物C0IBF:5'-CGACGAATCATAAGGACAT-3'(SEQ ID N0:2)、
[0008]下游引物C0IBR:5'-GCCCGAGGGATCAAAG-3'(SEQ ID N0:5);
[0009] 上述的上游引物，其序列还可以是SEQIDNO:3或SEQIDNO:4;
[0010] 上述的下游引物，其序列还可以是SEQIDN0:6或SEQIDN0:7;
[0011] 上述的引物用于宽壳全海笋的种群遗传多样性的检测。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0013] (1)特异性强，该引物是针对宽壳全海笋线粒体C0I基因片段设计的，相对软体动 物通用的C0I基因引物，具有绝对的特异性优势。
[0014] (2)效率高，该引物的扩增效率高达90%以上，扩增效率高，大大降低了扩增的时 间和费用。
[0015] (3)操作简便，且成本不高。相对克隆测序来说，利用特异性引物进行扩增的方法， 操作简单，节省时间和费用。适合需要大规模扩增C0I基因的实验研究。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0017]实施例1:宽壳全海笋⑶I基因片段与其他几种贝类基因组⑶I基因片段的扩增和 序列分析
[0018] 对宽壳全海笋C0I基因的扩增：
[0019] (1)对采自浙江宁波和秦皇岛的宽壳全海笋(个数均为16个，共32个）用CTAB法进 行DNA提取，加双蒸水稀释为lOOng/μΙ的工作液备用。
[0020] (2)利用上述的引物对DNA工作液进行PCR扩增，该反应体系的配制溶液包括：ΙμL 模板DNA，0.05ylTaq聚合酶，ΙμL10XPCRbyffer，0.8yldNTPs，上下游引物各 1μ1，5·15μ1 双蒸水。PCR扩增条件为：94°C预变性3min，94°C变性45s，46-56°C退火温度45s，72°C延伸 45s，共35个循环，最后为72°C延伸lOmin。
[0021] (3)用1.5%生物琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物交由华大基因进行双向 测序。测得的序列用BioEdit软件拼接后，与NCBI上下载的COI序列进行多重比对分析，确定 所得序列为宽壳全海笋C0I序列。
[0022]申请人分析了扩增获得的宽壳全海笋C0I基因部分序列（SEQIDN0:1);在NCBI数 据库中进行Blast比对，利用DNASTAR软件对宽壳全海笋和其他几种贝类的⑶I基因片段进 行对比分析，发现宽壳全海笋与脆壳全海笋的C0I基因核苷酸一致性为84%，与短管仙女蛤 的C0I基因核苷酸的一致性为87%，与花纹碟文蛤的⑶I基因核苷酸一致性为79%，结果表 明宽壳全海笋的C0I基因核苷酸序列与其他几种贝类的C0I基因核苷酸序列存在明显的差 异。
[0023]实施例2:引物的设计
[0024] (1)对采自浙江宁波和秦皇岛的宽壳全海笋(个数均为16个，共32个）用CTAB法进 行DNA提取，加双蒸水稀释为lOOng/μΙ的工作液备用。
[0025] (2)利用C0I通用引物(LC01490F和HC02198R，Folmerl994)扩增出宽壳全海笋的部 分序列。
[0026] (3)从上述所得的部分宽壳全海舆序列中，通过软件BioEdit(http:// www.Mbio .Ncsu. edu/BioEdit/bioedit .html)对上述序列进行多重对比分析，确定出前后 的保守区域。
[0027] (4)经比对，前后端各150个碱基对在保守区域，用引物设计软件Primer Premier5 设计了3对引物，设计的引物时尽量都没有出现引物二聚体、发夹结构和错配现象。设计的 引物交由上海生工生物技术有限公司进行合成，引物的序列信息如下：
[0034] (5)在10μ1 PCR反应体系中，用合成的3对引物分别扩增宽壳全海笋32个个体的 C0I基因片段，该反应体系的配制溶液包括：ΙμL模板DNA，0.05ylTaq聚合酶，ΙμL 10 X PCR buffer，0.8μ1 dNTPs，上下游引物各ΙμL，5.15μ1双蒸水。PCR扩增条件为:94°C预变性3min， 94°C变性45s，46-56°C退火温度45s，72°C延伸45s，共38个循环，最后为72°C延伸lOmin。
[0035] (6)将各引物扩增出的产物，用1.5%生物琼脂糖凝胶电泳检测，由凝胶电泳的结 果观察分析，三对引物都能扩增出单一条带，但COIBF和COIBR扩增出的条带最清晰，扩增效 率较另外两对引物高，且扩增的个体数目远高于另外两对引物，扩增出29个个体，扩增效率 高达90% ;表明COIBF和COIBR扩增引物的扩增效率更高。
[0036] (7)扩增产物交由华大基因进行双向测序。测得的序列用BioEdit软件拼接后，与 NCBI上下载的C0I序列进行多重比对分析，确定所得序列为宽壳全海笋C0I序列，从而表明C0IBF和C0IBR扩增引物具有扩增的特异性。
【主权项】
1. 一种宽壳全海笋COI基因，其特征在于，所述的宽壳全海笋COI基因的核苷酸序列为 SEQIDN0:1。2. 权利要求1所述的宽壳全海笋COI基因在设计检测宽壳全海笋的扩增引物中的应用。3. -种检测宽壳全海笋的引物，其特征在于，所述的引物的序列信息如下： 上游引物的序列为SEQIDNO:2、 下游引物的序列为SEQIDN0:5。4. 如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述的上游引物的序列为SEQIDN0:3或SEQ IDNO:4〇5. 如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述的下游引物的序列为SEQIDN0:6或SEQ IDN0:7〇6. 权利要求3-5任一项所述的引物在检测宽壳全海笋的种群遗传多样性中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种宽壳全海笋线粒体COI基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO:1；上述的基因序列用于设计检测宽壳全海笋的扩增引物。本发明的引物是针对宽壳全海笋线粒体COI基因片段设计的，相对软体动物通用的COI基因引物，具有绝对的特异性优势。该引物的扩增效率高达90％以上，扩增效率高，大大降低了扩增的时间和费用。
【IPC分类】C12N15/53, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105462995
【申请号】CN201610021309
【发明人】张婷婷, 李莉, 王英俊, 邹琰, 刘童, 刘洪军, 王慧
【申请人】山东省海洋生物研究院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月14日