专利名称：一种砗磲科贝类线粒体coi基因扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种砗磲科贝类线粒体COI [the cytochrome c oxidase I]基因扩增引物。
背景技术：
砗磲科(Corbiculacea)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)，它是世界上最大的双壳贝类，多分布于印度洋和太平洋海域，特别是在印度尼西亚、马来西亚和澳大利亚等热带海域低潮区附近的珊瑚礁间较多，我国的海南省以及南海诸岛也有分布。全世界共有2属6种，其中大砗磲、库氏砗磲和鳞砗磲被列为世界珍稀保护动物。砗磲科物种自古以来受到人们的青睐，位于“佛教七宝”之首。而且砗磲肉质鲜美，营养丰富，是名贵的海产品，并具有一定的药用价值和观赏价值。由于其生活环境的特殊性，还可以成为评价珊瑚礁生态系统是否健康的重要指标。砗磲将是一种非常有 养殖前景的海洋经济贝类。然而由于砗磲科的贝壳外部形态可塑性强、受环境影响大，有时还覆盖有大量附着物，利用形态特征对砗磲科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些近缘物种，单利用形态特征很难区分开来。近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法，其中线粒体COI基因已成为区分物种和研究物种进化关系的理想标记，并在许多物种中得到了成功应用。因此，利用mtCOI基因对砗磲科进行物种鉴定和系统发育分析具有很好的前景。然而贝类mtCOI序列的变异速率明显高于动物的其他类群，软体动物不同物种，即使是近缘种甚至种内不同群体之间的mtCOI序列变异都很大，这就导致了 Folmer等人于1994年设计的COI通用引物LCO1490和HC02198在这一动物类群中的扩增效率极低。缺少扩增效率高的引物已经严重阻碍了这种分子标记应用于双壳贝类的分子鉴定研究。
发明内容
本发明目的是提供一种砗磲科贝类线粒体COI基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本发明根据砗磲科物种COI基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，对比分析美国国立生物技术信息中心(NCBI, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上已有的砗磲科贝类序列，结合自己利用通用引物扩增的序列，通过重复试验，最终筛选出砗磲科贝类COI基因最适扩增引物。采用本发明的砗磲科贝类COI基因扩增引物，可以高效的扩增出砗磲科不同物种的COI序列，更有利于砗磲科的物种遗传多样性的研究。
具体实施例方式本发明的砗磲科贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法采用四个步骤a、在美国国立生物技术信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上下载已有的砗磲科序列；b、利用COI通用扩增引物(LC01490F和HC02198R，Folmer 1994)扩增出部分砗磲科物种的COI序列；c、从上述得到的砗磲科mtCOI序列中，通过比对找出保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；d、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增砗磲科线粒体COI基因效果最好的一对引物。下面结合实施例对本发明作进一步说明I.在美国国立生物技术信息中心(NCBI, http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载已有的5种砗磲科贝类52条COI序列番红砗磲(Genbank Number JN392040-JN392066);大砗碟(Genbank Number EU003616);无鱗砗碟(Genbank Number GQ166591);鳞砗磲(Genbank Number JN392020-JN392037);长砗磲(Genbank Number EU003610-EU003614)。2.样品采集于2002年 2011年，从中国南北沿海共采集砗磲科2个属4个种类的43个个体。3.DNA提取用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。4. COI通用扩增引物扩增利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物LC01490F:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’HC02198R 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’对上述采集的砗磲科43个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为48°C 52°C。扩增产物经I. 5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得番红砗磲2个个体的COI序列，其长度约为700bp，其余个体均未扩增出。5.序列比对利用CLUSTALW软件将上述测得的2个COI序列和下载的52条序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。6.引物合成根据上述的比对结果，利用引物设计软件PrimerPrimer5在碱基变异度最小的序列片段设计出4对扩增引物。7.引物扩增将上述设计的4对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的砗磲科4个种类的43个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同，PCR热循环退火温度范围为48°C 52°C。扩增产物用I. 5倍的琼脂糖电泳进行检测。8.引物扩增结果上述4对扩增引物中，I对引物能扩增出2个个体，I对引物能扩增出5个个体，I对引物能扩增出21个个体，I对引物能扩增出砗磲科全部的43个个体，扩增效果非常好。特异性扩增引物序列经过大量的重复试验，最终筛选出上述扩增砗磲科COI基因效果最好的一对引物序列为CQF :5’ -GATATTGGAACCCTTTACTT-3’ ；CQR 5’ -TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为650bp。9.特异性扩增引物扩增条件上述CQF与CQR扩增引物的10 μ L PCR反应体系为
Iμ LlOXbuffer Mg2+，I μ L DNTP (2mM), O. 6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L 引物 CQF (10 μ Μ)，I μ L引物 CQR(10 μ Μ)，O. 08 μ L r-Taq (5u/μ L), I μ L DNA 模板，4. 32 μ L 双蒸水。PCR 热循环的退火温度为48°C 52°C。
权利要求
1. 一种砗磲科贝类线粒体COI基因扩增引物，其特征是CQF :5’ -GATATTGGAACCCTTTACTT-3’ 和 CQR :5’ -TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’。
全文摘要
本发明利用NCBI中已有的52条砗磲科序列，结合笔者用通用引物扩增得到的2条砗磲科序列，利用CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，用43个砗磲砗磲科个体在10μl体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种砗磲科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，其特征是CQF5’-GATATTGGAACCCTTTACTT-3’CQR5’-TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’采用本发明的砗磲科贝类线粒体COI引物，可以高效地扩增出砗磲科贝类不同物种的目的片段，对利用分子方法鉴定砗磲科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用分子手段开发、保护砗磲科种质资源提供可靠的技术指导。
文档编号C12N15/11GK102816762SQ201210324790
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月1日 优先权日2012年9月1日
发明者于贞贞, 李琪, 孔令锋 申请人:中国海洋大学