甲型流感病毒全基因组扩增方法及使用的复合引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种病毒的全基因组扩增方法，具体设及一种甲型流感病毒的全基因 组扩增方法，W及在该方法中所使用的复合引物和试剂盒，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成。根据核蛋白（NP)和基质蛋白（M)不 同分为A型、B型、C型。
[0003] A型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9 个NA亚型。A型流感病毒常引起世界性大流行。
[0004] B型和C型流感病毒不分亚型。B型、C型流感病毒W局部暴发和散发流行为特征。 [000引禽流感(avian inf luenza，AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一种家禽和野禽 的疾病综合征，其病原禽流感病毒属正粘病毒科流感病毒属，为单股负链RNA病毒，根据血 凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个HA亚型和9个NA亚型。
[0006] 目前，研究甲型流感病毒基因进化的主要技术需要对甲型流感病毒的8个基因节 段分别进行扩增后再进行测序，不仅费事费力，而且对实验室和人员要求较高，通量低，不 适用于大批量的样本测序。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种复合引物，该复合引物对所有甲型流感病毒都 具有良好的特异性。
[0008] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0009] -种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的复合引物，其特征在于，包括2条正向引 物和1条反向引物，其中，
[0010] 正向引物F1 的序列为:ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG;
[0011] 正向引物F2 的序列为:ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG;
[0012] 反向引物R 的序列为:ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。
[0013] 本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒能够使获得甲型流 感病毒的全基因组产物变得更加容易。
[0014] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0015] -种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的试剂盒，试剂盒内装有若干管反应液和 反应复合酶，其特征在于，前述反应液中含有前面记载的正向引物F1、正向引物F2和反向引 物R。
[0016] 前述的试剂盒，其特征在于，前述反应液由W下成分组成： 无 RNA酶水 10/^、 反应盐离子缓冲液27///、 正向引物F1 ?μ、
[0017] 正向引物F2 ΙμΙ、 反向引物民 \叫、 RNA酶抑制剂 ΙμΙ、 共计 41/i。
[0018] 本发明的第Ξ个目的在于提供一种甲型流感病毒全基因组扩增方法，该方法操作 简单、特异性好、灵敏度高、检测快速、结果可靠。
[0019] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0020] -种甲型流感病毒全基因组扩增方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0021 ] Stepl:利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA;
[0022] Step2:利用前面记载的试剂盒进行RT-PCR反应，扩增核酸；
[0023] Step3:电泳扩增产物，并根据电泳图判断扩增结果。
[0024] 前述的扩增方法，其特征在于，在Step2中，扩增核酸的具体步骤为：
[0025] (1)将试剂盒中的反应液混匀，离屯、，分装，4化1/孔；
[0026] (2)向反应孔中加入提取的样品RNA，祉1 /孔；
[0027] (3)将试剂盒中的反应复合酶加入到反应孔中，1μ1/孔；
[002引（4)震荡离屯、后上PCR机进行检测。
[0029] 前述的扩增方法，其特征在于，设置的PCR循环条件为：
[0030]
[0031]
[0032] 本发明的有益之处在于：
[0033] -、经实验证明，本发明的复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性，能 快速有效的得到甲型流感病毒的全基因组产物；
[0034] 二、本发明的试剂盒应用方便，无需配置反应体系，减少了人为误差，增加了试验 的准确性，使得获得甲型流感病毒的全基因组产物变得更加容易，而且保证了实验结果重 复性更好；
[0035] Ξ、经实验证明，本发明的扩增方法不仅操作简单，而且特异性好、灵敏度高、检测 快速(PCR反应时间小于4小时）、结果可靠，为临床诊断、检验检疫等领域的甲型流感病毒二 代测序技术提供了简单可行的技术方案。
【附图说明】
[0036] 图1是采用本发明的方法获得的甲型流感病毒8个基因节段扩增后结果图；
[0037] 图2是采用本发明的方法获得的不同亚型的流感病毒8个基因节段扩增后结果图。
【具体实施方式】
[0038] W下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0039] 一、引物与探针
[0040] 从NCBI上下载国内甲型流感病毒的全基因序列，平均每年两株。使用bioedit软件 进行比对，选择8个基因节段两端的保守区域。引物探针设计使用商业软件Lasergene中的 PrimerSelect软件，设计后的引物进行合成。
[0041] 最终，本发明设计得到了由2条正向引物和1条反向引物组成的复合引物，该复合 引物的序列如下：
[0042] 正向引物F1 的序列为:ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG;
[0043] 正向引物F2 的序列为:ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG;
[0044] 反向引物R 的序列为:ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。
[004引探针序列与目的基因负链的碱基序列一致。
[0046] 因为正向引物F1、正向引物F2和反向引物R是针对甲型流感病毒8个基因节段的两 端保守区，所W本发明的复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性，能快速有效 的得到甲型流感病毒的全基因组产物。
[0047] 二、检测试剂盒
[0048] 试剂盒内装有若干管反应液和反应复合酶，其中，反应液中含有前面记载的正向 引物FI、正向引物F2和反向引物R。
[0049] 1、反应液的成分和用量如下： 无 RNA酶水 1