检测hbv病毒扩增的引物组和荧光探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明设及基因检测技术领域，具体设及检测皿V病毒扩增的引物组和巧光探针 及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒化BV)感染引起的一种疾病，主要通过血和血制品、 母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床 表现有食欲减退、恶屯、、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有低热等症状。乙型肝炎患者可 发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。
[0003] 皿V-DNA常规检测方法主要有斑点杂交法和巧光定量PCR法。斑点杂交法是较传 统的方法，成本较低，灵敏度W及精准度都较低，假阳性几率较高，不适合做皿V定量检测。
[0004] 巧光定量PCR法是一种集PCR技术、巧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量 检测技术。巧光定量PCR使用了特异性的探针，能够对祀序列进行特异性的识别，具有引物 探针双重控制，且综合了巧光标记技术、激光检测技术、数码显像技术，在扩增指数期进行 定量，具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点。 阳00引国内外临床应用皿V-DNA巧光定量PCR法存在W下缺陷：
[0006] 1.常用的核酸提取方法有：a、磁珠法；b、层析柱法；C、碱裂解法。^上；种方法需 要繁琐的离屯、、换管等步骤，易导致核酸污染与丢失，且操作过程繁杂，操作人员易疲劳操 作。
[0007] 2.定量标准品操作：大多标准品由于不参与核酸提取，不能全面真实反映核酸提 取和扩增。
[0008] 3. PCR反应体系：传统的PCR反应体系多为无色，容易导致视觉疲劳。
[0009]有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0010]本发明的目的有；个：提供一种检测皿V病毒扩增的引物组和巧光探针；提供一 种检测皿V病毒的试剂盒；提供一种检测皿V病毒的方法。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
[0012]检测皿V病毒扩增的引物组和巧光探针，包括
[0013] 上游引物皿V-F:如沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列；
[0014] 下游引物HBV-R :如SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列；
[0015]化qman巧光探针皿V-FP:如SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列，在5'端标记巧光报 告基团，除5'端标记巧光泽灭基团。
[0016]作为本发明的优选方案，在3'端标记有泽灭基团；
[0017]本发明在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的巧光探针，该探针 为一寡核巧酸，两端分别标记一个报告巧光基团和一个泽灭巧光基团。探针完整时，报告基 团发射的巧光信号被泽灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降 解，使报告巧光基团和泽灭巧光基团分离，从而巧光监测系统可接收到巧光信号，即每扩增 一条DNA链，就有一个巧光分子形成，实现了巧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 [001引作为本发明的优选方案，所述巧光报告基团为6-簇基巧光素化-FAM);
[0019] 作为本发明的优选方案，所述巧光泽灭基团为黑桐泽灭剂1度册1);
[0020] 所述巧光报告基团和巧光泽灭基团均为市售。
[0021] 本发明所述的试剂盒包括上述所述的引物组和巧光探针，W及促巧光剂；
[0022] 作为本发明的优选技术方案，还包括皿V病毒定量标准品I~IV组、阴性质控品 和皿V临界阳性质控品。
[0023] 作为本发明的优选技术方案，所述阴性质控品为灭活皿V阴性血清；所述皿V临界 阳性质控品为浓度介于1. 0X 102~2. 0X 10 3IU/mL的皿V阳性血清；所述皿V病毒定量标 准品I浓度为2. 0 X l〇3lU/mL、皿V病毒定量标准品II浓度为1. 0 X l〇5lU/mL、皿V病毒定量 标准品III浓度为5. 0X 106IU/mL、皿V病毒定量标准品IV浓度为2. 5X 108IU/mL。
[0024] 作为本发明的优选技术方案，所述促巧光剂是终质量百分浓度为0. 01%的孔雀石 绿水溶液。
[00巧]作为本发明的优选技术方案，还包括酶混合物。 阳0%] 作为本发明的优选技术方案，所述酶混合物为化q DNA酶和UNG酶。
[0027] 上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤： 阳0測 1)提取核酸DNA ;
[0029] 2)采用W上任意所述的试剂盒进行巧光定量PCR扩增反应，PCR扩增时化q DNA 酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使巧光报告基团和泽灭基团分离，从而巧光监测系 统可接收到巧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个巧光分子形成，实现了巧光信号的累 积与PCR产物形成完全同步；
[0030] PCR扩增反应包括：PCR反应液30 y L酶混合物1. 5 y L促巧光剂1. 5 y L所述 PCR 反应液的组成为：皿V-F (10 y M) 1. 5 y L，皿V-R (10 y M) 1. 5 y L，皿V-P (10 y M) 0. 4 y L， DNA Mix 19. 5 yL最后用无菌超纯水将反应体系补至30 yL。
[0031] 3)通过巧光定量PCR仪检测反应结果，巧光信号收集时设定为60°C、FAM巧光 素，如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为皿V病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增 曲线，则判定为阳性，并利用皿V定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度 师/血）。
[0032] 作为本发明的优选方案，所述步骤2)中PCR扩增反应的条件为：37°C条件下反应 2分钟；95°C，3分钟；然后，95°C，10秒，60°C，35秒，共45个循环。
[0033] 采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有W下有益效果：
[0034] 1)利用本发明的试剂盒可W快速、简便的对皿V病毒相关性肝炎进行筛查； 阳03引。本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500IU/mL ;
[0036] 3)本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒 (JCV)，丙肝病毒（HCV)，邸病毒巧BV)，人巨细胞病毒（HCMV)，人类细小病毒B19 (HPV B19) 和服病毒度KV)等；
[0037]4)本发明的检测方法反应快速，一般1. 5到2小时即可得到反应结果；
[0038]5)本发明的检测方法成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展，从而实现对皿V 病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
【附图说明】
[0039]图1为采用巧光定量PCR仪检测待测样本得到的曲线； W40]图2为采用巧光定量PCR仪检测皿V病毒定量标准品得到的曲线；
[0041] 图3为采用巧光定量PCR仪通过皿V病毒定量标准品对皿V阳性样本进行定量得 到的曲线。
【具体实施方式】
[0042] W下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
[0043] 1、对本发明中用到的试剂进行一下解释： W44] 1)核酸释放剂：
[0045]核酸释放剂紫红色，具体组成成分为0.0015%的孔雀石绿、0.015%的明胶、 Tris-肥1、0.01% TritonX-100、5. Omg/L蛋白酶K、0.5M化0H，分装量为leOyLXl管/48 份；
[0046]2) PCR反应液：
[0047] PCR反应液具体组成成分为：皿V-F(10y M)1.5y L皿￥-3(10y M)1.5y L 皿V-FP(10yM)0.4yL DM Mix19.5^以水7.1^以分装量为1500yLXl管/48份；
[0048]扣hq DM酶/UNG酶：80y L X1管/48份； W例4)促巧光剂：
[0050] 促巧光剂具体组成成分为1.5y L水、终质量百分浓度0.01%的孔雀石绿，呈浅蓝 色，分装量为SOiiLXl管/48份；
[(K)川 f5)定量标准品：HBV定量标准品I (2.0X103IU/血)、皿V定量标准品 II (1.0X l05lU/mL)、皿V定量标准品III巧.0X l06lU/mL)、皿V定量标准品IV (2.5X l0SlU/血)、皿V阴性质控品、皿V临界阳性质控品各30y L。 阳化引2、皿V标准血清质控品的制备如下： W53] 收集皿V DNA强阳性混合灭活血清，使用已灭活阴性血清进行稀释，制备 2.5Xl〇SlU/mL5. OXl〇6lU/mLl. OXl〇5lU/mL2. OXl〇3lU/ml皿V标准血清质控品，采用 卫生部标准质控品血清（国家一级标准），进行10X10实验内及实验间重复，最终确定皿V 标准血清质控品的DNA含量，并进行保存条件的稳定性实验。实现原病毒血清质控品与标 本同时进行核酸提取与扩增的全程监控。
[0054]3、皿￥0臟提取 阳化5] 取3y L核酸释放剂，加入PCR反应管中，取待测血清各3y L加入对应的PCR反应 管中，并用移液器在管底吹打混匀15~20次，各PCR反应管中分别加入30y L无菌石蜡油， 然后在PCR反应管口贴上封口膜；将PCR反应管放置在巧光定量PCR仪中进行95°C，lOmin 高溫裂解反应。将经过裂解处理后的PCR反应管从巧光定量PCR仪中取出，撕弃封口膜，悬 空加入PCR-mix (PCR反应液、酶混合物、促巧光剂），瞬时离屯、，备用。
[0056] 4、PCR反应液的配制与加样
[0057] 按W下比例进行PCR反应液配制与加样：PCR反应液30 y LX (n+4管定量标准品 和一管阴性对照W及一管临界阳性质控品），每管加化q DM酶/UNG酶1. 5 y ^促巧光剂 1. 5 y L ;震荡混匀，每份33 y L加入皿V DNA提取管中，直接进行PCR扩增。
[0058] 5、PCR扩增条件
[0059] 37°C，2 分钟；95°C，3 分钟；（95°C，10 秒；60°C，35 秒）X 45 个循环；25°C，30 秒
[0060] 采用MX3000P巧光定量PCR仪，巧光信号收集时设定为FAM巧光素，巧光信号收集 设在60°C。 阳OW] 6、结果判读
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