创 （1)如果待测基因FAM通道没有出现S型扩增曲线，判为皿V DNA检测阴性。 阳06引 似如果待测基因FAM通道出现S型扩增曲线，判为皿V DNA检测阳性，检测结果 有如下解释： W64] 1)测定值在0~500IU/mL的样本报告为"低于试剂盒检出下限巧OOIU/mL)"，即 "巧OOIU/mL"，应结合其它临床诊断指标进行判断。 W65]。巧^定值在500~2. 5X 108IU/mL之间的样本，直接报告所测定的数值；
[0066] 如测定值大于2. 5X108IU/血的样本，可报告为>2. 5X108IU/血；若需精确定量， 可根据结果将样本稀释至2. 5X 108IU/mL W下复测，并根据W下公式计算样本浓度，结果注 明为可报告数值。
[0067] 可报告数值（最终样本浓度）=稀释后浓度X稀释倍数
[0068] 稀释倍数=(样本量+稀释液量）/样本量 W例 实施例1 :
[0070] 一步法实现对皿V阴性、阳性样本的定性检测
[00川 （1)试剂准备
[0072] ①取出试剂盒中各组分，室溫放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离屯、； 阳073] ②根据待测样本、皿V阴性质控品的数量，按比例取相应量的试剂加入灭菌 的离屯、管中，混匀并瞬时离屯、后备用；将各成分（PCR反应液、酶混合物、促巧光剂）按 一定比例混合在一起，制备成PCR-mix。其中PCR反应液包括：皿V-F(l〇yM)1.5yL 皿V-R(10yM)1.5yL皿￥斗口（10^]?)0. 4yL DM Mix 19. 5yL最后用无菌超纯水将反应 体系补至30 y L。
[0074] 在PCR反应液中加入浅蓝色促巧光剂，使最终配制的PCR反应体系呈现浅蓝色，在 PCR预变性过程中稱色，轻松准确操作整个PCR过程，促巧光剂的加入不影响PCR检测，能够 稳定巧光信号，增强PCR扩增效率。 阳〇7引 似样本处理
[0076] ①取3 y L核酸释放剂，加入PCR反应管中； 阳077] ②分别取待测样本、皿V阴性质控品各3 y L加入对应的PCR反应管中，并用移液 器在管底吹打混匀15~20次； 阳078] ③各PCR反应管中分别加入30 iiL无菌石蜡油，然后在PCR反应管口贴上封口膜；
[0079]④将PCR反应管放置在巧光定量PCR仪中进行95°C、lOmin煮沸裂解反应。
[0080] (3) PCR 扩增
[0081] ①将经过裂解处理后的PCR反应管从巧光定量PCR仪中取出，撕弃封口膜，在各管 中按33 y L/管加入制备的PCR-mix，悬空加入到反应管内，瞬时离屯、；
[0082] ②反应条件设置：37°C，2分钟；95°C，3分钟；（95°C，10秒；60°C，35秒）X 45个循 环；25°C，30 秒；
[0083] 采用MX3000P巧光定量PCR仪，巧光信号收集时设定为FAM巧光素，巧光信号收集 设在60°C。
[0084] (4)结果判断：检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为皿V病毒阴性；检测通道 出现S型扩增曲线，判定为阳性。 阳0化]利用上述方法对12例皿V病毒血液样本、2例JC病毒尿液样本、5例健康人尿液 样本，5例健康人血液样本、2例丙肝病毒（HCV)血液样本、2例邸病毒巧BV)血液样本、2 例人巨细胞病毒（HCMV)血液样本、2例人类细小病毒B19(HPV B19)血液样本和2例服病 毒度KV)血液样本，共计34份样本进行检测，结果如图1所示：
[0086] 其中，12例检测均为阳性，有S型扩增曲线；健康人尿液样本，血液样本，丙肝病毒 (HCV)，邸病毒巧BV)，人巨细胞病毒（HCMV)，人类细小病毒B19 (HPV B19)，JC病毒（JCV) 和服病毒度KV)检测均为阴性，无S型扩增曲线。
[0087] 实施例2 ;
[0088] 一步法实现对皿V定量检测
[0089] (1)试剂准备
[0090] ①取出试剂盒中各组分，室溫放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离屯、；
[0091] ②根据待测样本、皿V阴性质控品W及皿V病毒定量标准品I~IV的数量，按比例 取相应量的试剂加入灭菌的离屯、管中，混匀并瞬时离屯、后备用；将各成分（PCR反应液、酶 混合物、促巧光剂）按一定比例混合在一起。其中PCR反应液包括：皿V-F(10 yM) 1. 5 y L 皿V-R(10yM)1.5yL皿￥斗口（10^]?)0. 4yL DM Mix 19. 5yL最后用无菌超纯水将反应 体系补至30 yL。 阳〇9引 似样本处理 阳09引①取3 y L核酸释放剂，加入PCR反应管中；
[0094] ②分别取待测样本、皿V阴性质控品W及皿V病毒定量标准品I~IV各3 y L加 入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀15~20次；
[0095] ③各PCR反应管中分别加入30化无菌石蜡油，然后在PCR反应管口贴上封口膜；
[0096] ④将PCR反应管放置在巧光定量PCR仪中进行95°C、lOmin煮沸裂解反应。
[0097] (3) PCR 扩增
[0098] ①将经过裂解处理后的PCR反应管从巧光定量PCR仪中取出，撕弃封口膜，在各管 中按33 y L/管加入制备的PCR-mix，悬空加入到反应管内，瞬时离屯、；
[0099] ②反应条件设置：37°C，2分钟；95°C，3分钟；（95°C，10秒；60°C，35秒）X 45个循 环；25°C，30 秒；
[0100] 采用MX3000P巧光定量PCR仪，巧光信号收集时设定为FAM巧光素，巧光信号收集 设在60°C; 阳101] (4)结果判断：检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为皿V病毒阴性；检测通道 出现S型扩增曲线，判定为阳性，并利用皿V定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测 样本的浓度（lU/mL)。检测反应时，皿V定量标准品I(2. 0Xl〇3lU/mL)、皿V定量标准品 II(1.0X l〇5lU/mL)、皿V 定量标准品III巧.0X l〇6lU/mL)、皿V 定量标准品IV(2. 5 X l〇SlU/ mL)与样品同时检测，如图2为定量标准品扩增曲线，图3为标准品与待测样本扩增曲线。 根据定量标准品浓度与检测结果CT值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测 CT值，可计算出样品中待测基因的浓度。
[0102] 利用上述方法对5例皿V病毒血液样本进行定量检测，通过计算机生成的标准曲 线，从左至右，计算5个阳性样本的浓度分别为：血液样本分别4. 4X 104IU/mL、1. 6X 104IU/ 血、4. 2Xl〇3lU/mL、l. 2Xl〇3lU/mL、4. 9Xl〇5lU/mL 阳103] 从而证实了本发明检测方法的特异性。
[0104] 妨结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证 实为皿V病毒基因序列。
[01化]W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 检测HBV病毒扩增的引物组和荧光探针，其特征在于，包括 上游引物HBV-F :如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； 下游引物HBV-R :如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； Taqman荧光探针HBV-FP :如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，在5'端标记荧光报告基 团，除5'端标记荧光淬灭基团。2. -种检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组 和荧光探针，以及促荧光剂。3. 如权利要求2所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括HBV病毒定量标准 品I~IV组、阴性质控品和HBV临界阳性质控品。4. 如权利要求3所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为灭活 HBV阴性血清；所述HBV临界阳性质控品为浓度介于1.0 X IO2~2. OX 10 3IUAiL的HBV阳 性血清；所述HBV病毒定量标准品I浓度为2. OX 103IU/mL、HBV病毒定量标准品II浓度为 1.0 X 105IU/mL、HBV病毒定量标准品III浓度为5. OX IO6IUAiU HBV病毒定量标准品IV浓度 为 2. 5X10sIU/mL。5. 如权利要求2所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，所述促荧光剂是终质量百 分浓度为〇. 01 %的孔雀石绿水溶液。6. 如权利要求2所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合物。7. 如权利要求6所述的检测HBV病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物为Taq DNA 酶和UNG酶。8. 如权利要求2-7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取核酸DNA ; 2) 采用权利要求2-7任意一项所述的试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应； 3) 通过荧光定量PCR仪检测反应结果。9. 如权利要求8所述的检测HBV病毒的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增反 应的条件为：37°C条件下反应2分钟；95°C，3分钟；然后，95°C，10秒，60°C，35秒，共45个 循环。
【专利摘要】本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及检测HBV病毒扩增的引物组和荧光探针及试剂盒。检测HBV病毒扩增的引物组和荧光探针，包括上游引物HBV-F、下游引物HBV-R和Taqman荧光探针HBV-FP。所述试剂盒包括该引物组合探针、HBV病毒定量标准品I～IV组、阴性质控品和HBV临界阳性质控品。利用本发明的检测引物组和试剂盒可以快速、简便地检测患者中HBV病毒是否发生扩增，具有检测灵敏度高、时间短、一般1.5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、假阳性少，适合于大规模临床开展。从而实现对HBV病毒扩增快速、有效且准确的检测，保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105002175
【申请号】CN201510514582
【发明人】朱柳, 刘沛, 陈广磊, 王佳, 袁太明
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月20日