一种新型高灵敏度呼吸道病毒核酸nasba扩增引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药学技术领域，尤其涉及一种呼吸道病毒检测的基因扩增技术，更具体的建立一种高灵敏度的呼吸道病毒核酸NASBA扩增技术。具体包括一对呼吸道病毒特异性扩增引物，NASBA扩增反应体系及NASBA产物检测体系。
【背景技术】
[0002]急性呼吸道感染是人类致病和死亡的最主要原因之一。引起感染的病原体种类多，包括细菌、病毒、支原体和衣原体等，尤以病毒多见。无论病因如何，呼吸道感染的临床症状和体征都很相似，而不同种类病原体引起的感染，其治疗方法截然不同，疗效和病程也不尽相同。
[0003]呼吸道病毒作为最主要的致病病原体，种类繁多，需要快速进行鉴别。目前临床上呼吸道病毒感染的检测手段主要分为四类:第一类为最经典的病毒培养，是呼吸道病毒感染检测的金标准；但由于病毒繁殖有严格的嗜宿主性，需要根据不同的病毒选择各自敏感的细胞株，造成操作上的繁琐；且病毒培养周期长，不能很好的满足临床的需求。第二类为免疫学方法，也为目前最常用的方法。根据检测目标物为抗原/抗体，可分为直接免疫荧光法/间接免疫荧光法或是酶联免疫吸附实验。间接免疫荧光法/酶联免疫吸附实验虽然检测方法简单，但灵敏度低，且受干扰因素较多。直接免疫荧光法主要检测呼吸道病毒抗原，灵敏度较前两者高，但样本多取自病患咽拭子或肺泡灌洗液，增加了病患的痛苦，因此实用性比较低。第三类为核酸扩增技术，该方法包含多种基于病毒核酸的检测方法如聚合酶链式反应(PCR)、NASBA技术、环介导的等温扩增技术等。由于PCR检测时间短、灵敏度高，为目前最具有吸引力的方法。但该种方法需要首先将病毒RNA逆转录成cDNA，然后再进行特异核酸序列的扩增反应，增加了污染的机会，限制了此类技术在临床检测中的广泛应用。第四类为基因芯片、下一代测序技术及质谱技术等，这些先进的检测技术虽然大大提高了灵敏度，但耗时长或是价格昂贵，科研用途较多，目前尚未在临床病原体检测中得到大规模应用。
[0004]呼吸道病毒中，除少数如腺病毒为DNA病毒外，其余大多数为RNA病毒。目前PCR技术整个过程耗时虽较传统方法缩短，灵敏度必然有所下降。NASBA技术是直接以RNA为模板的核酸扩增技术，在AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶及RNaseH酶的作用下，短期内可在恒温条件下将模板RNA放大至101(]-1012拷贝量。该实验过程可认为分为非循环相及循环相两部分:在非循环相，引物1在其5’端人工加上了一段T7RNA聚合酶识别启动子序列，引物1的3’端则与RNA模板序列互补。在AMV逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA链；RnaseH识别RNA-DNA杂合双链并水解其中的RNA链；引物2与剩下的DNA链互补，在AMV逆转录酶催化下，以DNA链为模板合成互补链，形成双链DNA ；T7RNA聚合酶识别启动子序列，催化合成大量的RNA。新合成的RNA进入循环相，成为新的模板，如此循环往复，使RNA拷贝数迅速扩大。综上所述，NASBA技术与PCR技术的最大不同之处有三点:1)与PCR技术以DNA为模板不同，NASBA技术直接以RNA为模板，操作具有更简洁性；2)PCR需要进行变性-复性-延伸过程，至少需要两个温度的变化，而NASBA技术为恒温扩增，因此NASBA技术不需要特殊的设备；3)NASBA技术的灵敏度与PCR相比高1000倍左右，可显著提高临床核酸病毒的检出率，能更好的临床检测需要。
[0005]根据NASBA的技术原理，其最终产物为大量与RNA模板学列一致的片段，为使产物片段可视化，之前曾采用琼脂糖凝胶显像技术，但由于琼脂糖凝胶所用染料为溴化乙锭，具有一定的毒性，目前多采用NASBA技术偶联酶标(荧光)探针杂交的方式进行产物量的检测。由于呼吸道病毒大多数为单链RNA病毒，现有检测方法引物设计原则多采用与RNA模板相反的单条引物的5’端引入T7RNA聚合酶启动子区域，最后大量扩增而成的是与病毒RNA模板序列一致的RNA分子，并以此为基础达到病毒检测的目的。由此可知，经典NASBA技术偶联酶标(荧光)探针杂交法仅能识别与模板链相一致的RNA序列，且检测过程中须通过酶标(荧光)探针偶联的显色技术，增加了该方法的操作繁琐性及需要用到显色设备等。同时，由于呼吸道病毒大多数为RNA病毒，在病人样本保存过程中极易降解，故进一步提高NASBA技术的检测灵敏度、降低技术操作繁琐程度已成为临床RNA病毒检测中急待解决的问题。
[0006]一直以来，研究人员致力于开发一种灵敏度更高、操作更简便、设备要求更简单的呼吸道病毒核酸检测方法。经典的NASBA技术仅在引物1的5’端添加一段T7RNA聚合酶启动子识别序列，以保证能合成与模板序列一致的RNA复制子，方便后续探针进行杂交检测。
【发明内容】
[0007]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明首先要解决的技术问题是提供新型高灵敏度呼吸道病毒核酸NASBA扩增引物。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案:
[0008]本发明公开了一对针对呼吸道病毒基因的特异性扩增引物，其设计原则为通过查询NCBI数据库及利用序列比对软件，选择呼吸道病毒保守区域，并在该区域设计扩增引物；其所设计的引物在合成是引物5’端均带有T7RNA聚合酶识别的启动子序列，如SEQ所不ο
[0009]本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种新型高灵敏度呼吸道病毒核酸NASBA扩增检测方法，该方法包括以下步骤:
[0010](1)制备权利要求1或2所述的扩增引物，
[0011](2)制备扩增试剂盒，所述扩增试剂盒由以下检测试剂组成:
[0012]本发明进一步公开了针对呼吸道病毒的NASBA检测试剂盒，由如下成分组成:
[0013]1)引物
[0014]引物FP:0.25ul
[0015]引物RP:0.25ul
[0016]所述引物序列如SEQ所示。
[0017]2) NASBA 扩增试剂
[0018]BA (缓冲液):2ul
[0019]DA:dNTP0.25ul
[0020]ΝΑ:NTP0.5ul
[0021]DMSO:0.25ul
[0022]EM(酶混合物):AMV 逆转录酶，RNAseH, T7RNA 聚合酶，BSA 5.5ul
[0023]3) NASBA产物检测试剂
[0024]1%琼脂糖凝胶
[0025]本发明进一步公开了针对呼吸道病毒NASBA检测试剂盒的使用方法，其特征包括如下步骤:
[0026]1)扩增反应体系:
[0027]lul 待检样本 RNA，0.25ul FP，0.25ul RP，2ul ΒΑ,Ο.25ul DA，0.5ul NA，0.25ulDMSO。
[0028]2) NASBA 扩增过程:
[0029]65。加热 5min，42。降温 5min 后加入 5.5ul EM, 42° 反应 60min。
[0030]3) NASBA产物检测过程:
[0031]①称取0.6g琼脂糖凝胶，置于100ml锥形瓶中，加入60ml TAE，微波炉加热至沸，冷却至70°左右加入GelRed染料，倒入凝胶模块中，待冷却凝固；
[0032]②将NASBA扩增产物加入2ul上样缓冲液终止反应后，分别加入到凝胶上样孔中；
[0033]③100V进行电泳lOmin，观察目的条带有误，判断结果。
[0034]本发明更加详细的制备方法如下(以呼吸道合胞病毒为例):
[0035]1、试剂组成
[0036]1.1 引物
[0037]针对呼吸道合胞病毒的N基因保守区设计合成引物，由上海生物工程有限公司合成，序列如下:
[0038]FP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGX ；
[0039]RP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGY ；
[0040]前段序列为T7RNA聚合酶识别的启动子序列“X、Y”代表呼吸道病毒(如呼吸道合胞病毒、Β型流感病毒、副流感病毒1型及副流感病毒3型)的保守序列或互补序列。
[0041 ]1.2NASBA 扩增试剂
[0042]ΒΑ (缓冲液):购自TAKARA公司
[0043]DA: 10mM dNTP，购自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0044]NA: 10mM NTP，购自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0045]DMS0:购自 S i gma 公司
[0046]EM (酶混合物):10U AMV，0.2 ?0.6U RNAseH, 38 ?63U T7RNA 聚合酶，2.5ug BSA,均购自TAKARA公司
[0047]1.3NASBA产物检测试剂
[0048]琼脂糖粉，购自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0049]2、NASBA 检测过程
[0050]2.1扩增体系
[0051]取lul 样本 RNA 模板、2ul ΒΑ、0.25ul ΝΑ、0.5ul DA、0.25ul DMSO 及 0.25ulFP、
0.25ulRP加入0.2ml PCR扩增管中。
[0052]2.2扩增过程
[0053]将上述PCR扩增管放置扩增仪上65°加热5min后进入42°降温5min;随后加入
5.5ul EM,继续 42。反应 60min。
[0054]2.3NASBA扩增产物的检测
[0055]2.3.1称取0.6g琼脂糖粉末加入到60ml TAE缓冲液中，微波炉加热至溶解后加入GelRed染料，倒入凝胶模块中，插入孔梳。
[0056]2.3.2取2ul上样缓冲液加入到扩增产物中终止反应。
[0057]2.3.3待上述凝胶凝固后，取下孔梳，在一个加样孔中加入点泳标准品，其他孔中分别加入扩增产物，100V电压电泳lOmin。
[0058]2.3.4在电泳显像仪中观察目的条带的有无，判断结果。
[0059]本发明的有益效果是:本发明通过在与呼吸道病毒RNA序列两端互补的两条引物的5’端均添加T7RNA聚合酶启动子识别序列，使其在进入循环相时能够合成既与模板序列一致的RNA学列[RNA (+)]，又能合成与模板RNA序列互补的RNA序列[RNA㈠]。如此，在循环相反应中，RNA(+)和RNA(-)可分别作为模板，经过N次循环，RNA扩增效率能得到显著提高(公式1)，从而大大提高病毒核酸的检测灵敏度；可直接采用患者咽拭子标本进行扩增，而无需进行逆转录过程，节省操作时间；同时，结合近期琼脂糖凝胶电泳所用燃料已更新换代为无毒性的燃料，故其检测成本将大幅度降低，消除有毒、有害染料对人体及环境的危害，且操作过程更简便，双引物设计增加了引物二聚体及发卡结构更加复杂等问题，在选择引物时需要注意。
[0060]单侧引物+T7 RNA聚合酶启动子序列设计:
[0061]扩增产物量1=TXAn
[0062]双侧引物+T7 RNA聚合酶启动子序列设计:
[0063]扩增产物量2= TXAnX2n
[0064]则:通过对双侧引物进行改进后，其产物量增加倍数为:
[0065]P =扩增产物量J扩增产物量1= 2 N
[0066]其中T为原始模板数，A为扩增效率，N为循环数。
[0067]公式1.双侧引物设计扩增效率比较
[0068]通过将该设计应用于NASBA技术，可使检测方法灵敏度更高、结果更准确、操作更方便。
【附图说明】
[0069]图1是本发明的技术原理图。
[0070]图2是本发明与PCR方法比对实验图。
[0071]图3是本发明应用于呼吸道合胞病毒引物单侧及双侧设计比对图。
[0072]图4是本发明应用于呼吸道合胞病毒特异性检测。
[0073]图5是本发明应用于B型流感病毒引物单侧及双侧设计比对图。
[0074]图6是本发明应用于B型流感病毒特异性检测图。
[0075]图7是本发明应用于副流感病毒1型引物单侧及双侧设计比对图。
[0076]图8是本发明应用于副流感病毒1型特异性检测图。
[0077]图9是本发明应用于