一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物领域，具体设及一种马来穿山甲线粒体c〇x3基因 序列的扩增引物及鉴定方法。
【背景技术】：
[0002] 马来穿山甲（Manis javanica)隶属于鱗甲目、穿山甲科、穿山甲属，主要分布于泰 国、马来西亚、细甸、印尼、新加坡等地，生活在低海拔森林及次生林中。马来穿山甲的鱗片 具有很高的药用价值，近年来，过渡猎捕导致马来穿山甲野生资源日益减少，已被IUCN列为 极危动物。为了保护野生资源，恢复马来穿山甲野生种群数量，研究其种群遗传结构和野生 群体遗传变异水平非常必要。
[0003] 分子标记是在DNA水平上对遗传多样性的直接反映，具有数量多，多态性好，遗传 稳定等优势，是研究遗传变异的理想方法。其中，线粒体基因是一个非常有效的遗传标记， 与核基因相比，线粒体基因具有母系遗传、结构简单、进化速率快等独特的遗传特性，被广 泛应用于物种鉴定和群体遗传多样性等研究。因此，线粒体基因是进行马来穿山甲物种鉴 定、群体结构和遗传变异研究的有效工具。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的是提供一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方 法，利用该扩增引物，按照本发明的鉴定方法能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体Cox3 基因，用于鉴定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种 的分子鉴定提供基础。
[0005] 本发明的马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物，其特征在于，所述的扩增 引物为：
[0006] F: 5 ' -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 '，核巧酸序列如沈Q ID NO. 1 所示；
[0007] 1?:5'-〔644了〇1；446了66了661'-3'，核巧酸序列如沈9 10備.2所示。
[000引本发明的另外一个目的是提供马来穿山甲的鉴定方法，其特征在于，提取待测穿 山甲的基因组DNA，然后利用上述扩增引物，W待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR 扩增，如果扩增不出来片段，则待测穿山甲不是马来穿山甲，如果能够扩增出扩增片段，将 扩增片段进行测序，如果扩增片段的核巧酸序列与SEQ ID NO.3所示的序列相同或者相似 度达到95% W上，则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。
[0009] 按照本发明的鉴定方法能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体Cox3基因，用于鉴 定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定 提供基础。
【具体实施方式】：
[0010] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[00川实施例1:
[0012] (1)马来穿山甲基因组DNA的提取
[OOU] 剪取马来穿山甲肌肉组织于2mL离屯、管中，将组织剪碎，加800化消化缓冲液，10化 蛋白酶Κ(20mg/mL)，混匀后于55°C消化过夜。消化清透后，加入80化L饱和酪，轻轻颠倒混匀 20min，lOOOOg离屯、lOmin，抽提上清。加入400化饱和酪，400化氯仿/异戊醇（24:1)，轻轻颠 倒混匀20min，lOOOOg离屯、lOmin，抽提上清。加入80化L氯仿/异戊醇（24:1)，轻轻颠倒混匀 20min，lOOOOg离屯、lOmin，抽提上清。加入1血预冷的无水乙醇，于-20°C冷冻化，12000g离屯、 15111；[]1，弃上清。加预冷的70%乙醇，小屯、洗涂0魁沉淀两次，12000旨离屯、51]1；[]1，弃上清。惊干 乙醇，加入50化超纯水溶解沉淀，置于-20°C保存备用，得到马来穿山甲基因组DNA。
[0014] (2)PCR扩增Cox3基因片段
[0015] 上游引物F: 5 ' -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ' ；
[0016] 下游引物R: 5 ' -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 '。
[0017] PCR扩增体系为25化，包括约lOng步骤（1)获得的马来穿山甲基因组DNA，2.扣L 10 XPCR buffer，0.2mM dNTP，上下游引物各0.2μΜ，0.5υ Taq聚合酶(Takara)JCR扩增条件 为：首先94°C预变性5min，然后进行30个循环，每个循环包括94°C变性30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸Imin，最后72°C延伸7min。用浓度为2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如 果扩增出的片段长度符合预期大小，则该扩增片段为Cox3基因片段。PCR产物纯化后直接进 行测序，获得Cox3基因片段的序列信息，马来穿山甲的Cox3基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0018] (3)利用Cox3基因片段的序列信息进行物种鉴定
[0019] 当需要对疑似马来穿山甲的穿山甲样品进行鉴定时。
[0020] 首先提取待测穿山甲的基因组D N A，然后利用上游引物F : 5 ' - ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ' ；下游引物R: 5 ' -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 '，W 待测穿山甲的基 因组DNA作为模板，进行PCR扩增，并将扩增片段进行测序，如果扩增片段的核巧酸序列与 SEQ ID NO.3所示的序列相同或者相似度达到95% W上，则为马来穿山甲，否则则不是马来 穿山甲。
【主权项】
1. 一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为： F:5 '-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 '； R:5，-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3，。2. -种马来穿山甲的鉴定方法，其特征在于，提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用 权利要求1所述的扩增引物，以待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，如果扩增 不出来片段，则待测穿山甲不是马来穿山甲，如果能够扩增出扩增片段，将扩增片段进行测 序，如果扩增片段的核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的序列相同或者相似度达到95%以上， 则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。
【专利摘要】本发明公开了一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法。所述的扩增引物为：F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’。提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用所述扩增引物，以待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，如果扩增不出来片段，则待测穿山甲不是马来穿山甲，如果能够扩增出扩增片段，将扩增片段进行测序，如果扩增片段的核苷酸序列与SEQ？ID？NO.3所示的序列相同或者相似度达到95％以上，则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。本发明能鉴定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105543365
【申请号】CN201610012778
【发明人】龚世平, 李伟业, 滑溜帅, 葛研, 王付民, 侯方晖
【申请人】广东省昆虫研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月5日