一种检测诊断多囊肾致病基因的dna文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种通过祀向高通量半导体测序技术检测诊断多囊肾致病基因的DNA 文库及其应用。具体说是根据多囊肾致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及邮邻区域的 超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进 行测序，寻找致病突变，明确多囊肾的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的 理论依据，为多囊肾患者晚期移植手术供体鉴别提供支持，为多囊肾患者进行选择性优生 优育提供基础。属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 多囊肾是一种常见的遗传性肾病，主要表现为双侧肾脏出现多个大小不一的囊 月中，囊肿进行性增大占位，挤压正常肾单位，破坏肾脏的结构和功能，最终导致终末期肾病。 该病临床常表现为多发性肾脏囊肿、进行性肾功能衰竭、持续性高血压和泌尿系感染等症 状，还可合并其他器官囊肿(肝囊肿、膜腺囊、卵巢囊肿等），脑血管崎形，动脉瘤，屯、脏瓣膜 病变，Π 脉高压等多种并发症。由于目前缺乏有效治疗手段，多数患者发展为终末期肾衰而 不得不进行肾脏替代治疗或肾移植手术。多囊肾根据遗传方式的不同，可W区分为常染色 体显性多囊肾(ADP邸)和常染色体隐性多囊肾(ARPKD)两种。常染色体显性多囊肾是最常见 的单基因遗传性肾病，发病率约为1:500~1000,发病年龄多在30~50岁。常染色体隐性多 囊肾发病率约为1:2000~5000,发病年龄较早，多在婴幼儿期即有表现。
[0003] 目前，研究发现多囊肾的数个致病基因中，只要任意一种基因发生功能性突变，即 可引起疾病表型，即：同一种多囊肾可W由多种遗传因素所导致。并且，不同基因的突变导 致的同一种多囊肾，其严重程度和预后不一样(如:PKD1基因突变导致的常染色体显性多囊 肾，患者发病年龄相对较早，PKD2基因突变导致的常染色体显性多囊肾，相对而言患者发病 年龄较晚）。除此之外，同一患者如果携带了一个W上的致病基因突变，其临床表现和预后 与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是多 囊肾精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。
[0004] 临床上现有的多囊肾的常规诊断技术主要是影像学检查，如肾脏彩超。但是，影像 学检查特异性不高，不能精确地区别多囊肾的具体种类。对于在早期尚未表现出临床症状 的年轻患者也不能进行准确诊断。因此，目前仅结合临床症状、影像学检查不能把各种多囊 肾精准地区分开来，具有预告性的基因诊断是解决运一难题的唯一解决办法。然而，传统的 基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无 法满足多囊肾庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
[000引因此，有必要寻求一种新的检测多囊肾致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降 低成本和劳动强度并提高时效性。
【发明内容】
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种全面覆盖常染色体显性多囊肾和常染色体隐性 多囊肾，包含6个多囊肾致病相关的致病基因的DM文库。其中6个致病基因如下：
[0007]
[0008] ~本发明根据6个多囊肾病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及邮邻调控区域' 的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高 通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断 提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供W下技术方案：
[0009] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊 断多囊肾。
[0010] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊 断多囊肾。优选的，所述诊断装置是测序忍片。
[0011] 进一步，所述应用包括下列步骤：
[0012] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[0013] (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部6个致 病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0014] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[001引（4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0016 ] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0017] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增;优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0018] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0019] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0020] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入忍片，上Ion Torrent?高通量测 序进行测序；
[0021] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0022] (11)对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
[0023] 优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0024] 本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含6个多囊肾的致病 基因的DNA文库。
[0025] 本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含6个多囊肾的致病基因 的DNA文库。优选的，所述装置为测序忍片。
[0026] 本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方 法，所述方法包括下列步骤：
[0027] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[0028] (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部6个致 病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0029] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[0030] (4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0031] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0032] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0033] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0034] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[003引 （9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入忍片，上Ion TorrentTM高通量测 序进行测序；
[0036] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0037] (11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
[0038] 优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0039] 采用本发明的DNA文库对离子通道病患者进行基因诊断有着W下重要意义和效 果：
[0040] 1.及时发现尚未发病的多囊肾患者:ADP邸是常染色体显性遗传疾病，家系中后代 患病率较高。然而，该病具有遗传外显延迟性，早期隐匿性强，青少年时代常无症状，多数患 者在40~60岁才会出现肾功能衰竭。利用本发明，可此陕捷准确地对ADPKD家系成员中尚无 症状、B超尚无多囊肾的个体及早进行症状前基因诊断，可W使患者提前知道病情，从而加 强自我保护，并能及时控制并发症的发生和发展，延缓疾病进程，对减轻家庭和社会的负担 都具有重大意义。
[0041] 2.基因诊断有助于改善肾移植手术后生存率:多囊肾患者大多在疾病晚期发生肾 衰竭，面临透析治疗和肾移植手术。国内肾移植供体主要来自家族内亲人，早期多囊肾的基 因诊断可应用于供体的选择，它可准确鉴定潜伏期的供体是否有发生ADPKD的危险，从而避 免移植肾再发多囊肾的风险，进而增加进行肾移植手术的患者的存活率。
[0042] 3.本申请的DNA文库是申请人从众多的多囊肾致病基因中选择的6个基因，运些基 因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。发明者通过多大样本中国汉族人群多 囊肾患者进行多年的临床观察和基因诊断研究，筛选出了运6个致病基因，对它们在中国人 群中的致病性和特点有了初步的了解。
[0043] 4.本发明的DNA文库能够检测常染色体显性多囊肾和常染色体隐性多囊肾。本发 明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测6种多囊肾的遗传缺陷；
[0044] 5.本发明中采用基于Ion Torrent?高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行 检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中设及的6个相关致病基因的全部外显子及 邮邻区域，并且能根据不同忍片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度 500X的前提下，检测1到96人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之 内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆 盖度广，整体覆盖度达到96.90% ;。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别 与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的 检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100 X的点突变，本方法的准确度达 到100 %;
[004引6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因多囊肾患者面临肾移 植的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊， 可W为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。多囊肾多数为常染色显性遗传病，患 者兄弟姐妹有50%的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助 于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
[0046] 综合来看，本发明中设及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特 点;经过临床评估，该发明对离子通道病具有很好的辅助诊断价值。
【附图说明】
[0047] 图1 一次Ion Torrent?高通量测序反应的数据采集概要图；
[0048] 图2-次对6个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；
[0049] 图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；
[0050] 图4 Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照