一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcSep4及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属微生物基因工程技术领域，具体设及植物保护领域中控制真菌侵染结构 形成与致病力的基因及其编码蛋白质的应用。
【背景技术】 阳00引灰霉病菌度Otrytis cinerea)通常又称作灰葡萄抱，属于子囊菌口(Ascomycota)真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树 作物。寄主从苗期到挂果期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的 典型症状表现为"V"形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病 害的发生和蔓延与环境的湿度、溫度存在密切的关系，在20°C -23°C，相对湿度90% W上时 发生严重。因此，灰霉病属低溫高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，每年 因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加 上相关分子研究技术成熟，灰霉菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质 等，运些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞并分解死亡的寄主组织作为营养。自 然条件下，灰霉菌多W分生抱子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常W菌丝 体、分生抱子或菌核附着在植物病残体上或在±壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵 染来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生抱子梗，并产生大量的分生抱子。成熟 的分生抱子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低溫高湿条件下，分生抱 子萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主 要从衰败的花器、伤口W及坏死组织侵入。
[0004] 附着胞、侵染垫等侵染结构的发育，对于灰霉病菌侵染寄主是至关重要的，如果侵 染结构发育受到影响，灰霉病菌将难W侵入寄主，其危害程度随之会受到严重削弱。灰霉病 菌侵染结构的发育受到营养、界面等外源条件及发育信号的联合调控，相关分子机制尚不 清楚，对该领域进行深入研究不仅有助于掲示灰霉病菌等死体营养型病原真菌致病的分子 机制，而且对于研发防治包括灰霉病菌在内的植物病原真菌的药剂具有重要应用价值。
[0005] 从分生抱子萌发到发育出功能完备的侵染结构，是一个精细的调控过程，鉴定该 调控过程的重要组分，并验证相关基因的致病功能，有可能从中发现可W作为杀真菌剂作 用祀标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。
[0006]Sep4是一种GTP结合蛋白质，广泛存在于包括真菌在内的真核生物（植物除外）， 该蛋白质可通过聚合成异源寡聚体蛋白质复合体或进一步形成纤丝，参与调控细胞多种关 键的生命过程。通过对灰霉病菌Sep4编码基因的分析，评价该基因在灰霉病菌致病过程的 作用，有利于鉴定潜在的防治祀标，用于筛选新型杀真菌药剂。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的旨在提供一种控制灰霉病菌侵染结构发育和致病性基因及其编码 的蛋白质。
[0008] 本发明所提供的控制侵染结构发育和致病性基因来源于灰霉病菌，名称为 BcS巧4,其具有序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列，该DNA序列由2793个核巧酸组成， 包括基因的启动子、开放阅读框及终止子。5'端第1位至931位核巧酸之间为启动子序列； BcSep4的开放阅读框由1147个核巧酸组成，其中包含3个外显子，分别位于SEQIDNo: 1 的5'端第932位至1067位核巧酸之间、第1134位至1696位核巧酸之间和第1746位至 2078位核巧酸之间，组成的编码区长度合计为1032个核巧酸；5'端第2079位至2793位核 巧酸之间为终止子序列。
[0009] 本发明提供了来自灰霉病菌的控制侵染结构发育和致病性基因BcSep4所编码的 蛋白质，其具有序列表中SEQIDNo:2所示的氨基酸序列，该序列由343个氨基酸组成。
[0010] 来自灰霉病菌的控制侵染结构发育和致病性基因BcSep4可应用于植物抗灰霉病 基因工程领域。
[0011] 来自灰霉病菌的控制侵染结构发育和致病性基因BcSep4所编码的蛋白质，对灰 霉病菌控制侵染结构发育和致病性的蛋白质BcSep4进行缺失、突变或修饰而使其侵染结 构、致病力发生缺陷，可作为祀标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。
[0012] 本发明证明了BcSep4基因的缺失或突变导致灰霉病菌侵染结构形成率及致病力 显著降低，说明BcSep4基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够 阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可W有效控制灰霉病菌分生抱 子萌发形成侵染结构及灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂。即本发明所提供的 BcSep4基因的一个重要用途是：该基因的表达与其蛋白质产物的表达、修饰及定位可W作 为重要候选祀标位点用于抗真菌药剂（特别是抗灰霉病菌药剂）的筛选和设计。
【附图说明】
[0013] 图1为各物种Sep4蛋白质系统发育树分析示意图
[0014] 其中：下划线标记的为灰霉病菌。
[0015] 图2为灰霉病菌BcSep4基因的敲除策略（通过同源重组进行基因替换）示意图
[0016] 其中：WT为野生型菌株B05. 10,pSep4-ko为敲除载体，BcS巧4-K0为BcSep4基因 缺失突变体。
[0017] 图3为BcSep4基因缺失突变体的PCR验证电泳图
[0018] 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2 ;M1、M2为两株独立获得的BcSep4缺 失突变体。
[0019] 图4为遗传互补菌株的PCR验证电泳图
[0020] 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2 ;M1/Sep4为在突变体Ml基础上转入 完整BcSep4基因的互补菌株。
[0021] 图5为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株B05. 10及互补菌株的培养特征对 比照片
[0022] 其中：所用培养基为PDA，WT为野生型，M1、M2为两株独立获得的BcSep4缺失突变 体，Ml/Sep4为在突变体Ml基础上转入完整BcSep4基因的互补菌株。
[0023] 图6为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的产抱量比较。
[0024]图7为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片 [00巧]其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法。接种3天后进行评价。 [00%]图8为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片
[0027] 其中：所选择寄主为油菜，采用离体叶片接种菌饼的方法。接种3天后进行评价。
[0028] 图9为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的附着胞形成能力比 较显微照片
[0029] 其中：将PDB抱子悬浮液巧X104ml1)滴在载玻片上，20°C保湿培养化后，用卢卡 弗巧光增白剂染料染色，进行暗视野紫外激发显微观察。箭头所示为附着胞，标尺为20ym。
[0030] 图10为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株侵染洋葱表皮的显微 观察的对比照片
[0031] 其中：用104ml1抱子悬浮液接种洋葱表皮，20°C解育2地，用乳酪蓝染色后进行显 微观察，染不上颜色的为侵染菌丝，箭头所示为灰霉病菌侵入位点。标尺为IOym。
[0032] 图11为BcSep4基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的侵染垫形成能力比 较的对比显微照片 阳03引其中：将PDB抱子悬浮液巧X104ml1)滴在载玻片上，20°C保湿培养36h后，显微 观察，标尺为100ym。
【具体实施方式】
[0034] 为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予W进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0035] 实施例lBcSep4基因的相关性分析
[0036] BcSep4基因位于灰霉病菌IV号染色体上，其开放阅读框由1147个核巧酸组成，包 含3个外显子，编码区CDNA全长为1032个核巧酸，编码的蛋白质产物由343个氨基酸组成。 取BcSep4蛋白质序列进行比对分析化ttp://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi)，发现 Sep4广泛存在于真菌、动物中，绿藻中也有，但在高等植物中，该基因退化掉了。系统发育树 分析化ttp://phyIogeny. lirmm. fr/phylo_cgi/simple_phylogeny. cgi)表明，丝状真菌 Sep4蛋白质之间的同源性较高，其中BcSep4与核盘菌Sep4亲缘关系最近；BcSep4与酵母 稍远，接下来是动物，与绿藻亲缘关系最远（见图1)。
[0037] 实施例2BcSep4基因的敲除与遗传互补
[0038] 1)敲除载体的构建
[0039]采用引物Sep4-UP-F巧'-CTCGAGCTTCGTGGGCATTGGTCTTG-3'）与Sep4-UP-R 保-GAATTCACGAGGGTATTATCTTTGGATTG-3'），W灰霉病菌菌株B05. 10 的基因组DNA为模板 扩增BcSep4 基因上游