新的肌营养不良肌病的血清miRNA标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及两个新的肌营养不良肌病的血 清miRNA标志物。
【背景技术】
[0002] 微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果觸和植物，哺乳动物等真核 生物中发现的一种内源性的长度为22个核巧酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有 组织和时间的特异性，通过与祀mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进 行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来 越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与祀mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对 生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。一些miRNA已被证明在肌肉中特异性表达， 并在肌肉发育过程中发挥十分重要的作用。在肌肉分化过程中特异性miRNA通过依赖成肌 决定因子MyoD,Mef2W及Myogenin的功能来调节肌肉增殖与分化之间的平衡。miR-208b 和miR-499位于慢肌肌球蛋白重链基因（Myh7和Myh7b)的内含子中，他们与肌纤维的分化 的类型有着密切的关系。
[0003] 然而，最近的研究表明，不论是在动物或者人的循环系统中，也能够检测到miRNA 的稳定存在，并且送些循环系统中的miRNA种类和数量的变化，与生物体的生理病理状况 相关。由此掲示循环系统中的miRNAs具备疾病的无创诊断标志物的潜在可能性。通过血 清miRNAs的发现与疾病的关系，W及对miRNAs祀向的进一步研究，进而对于一些疾病设计 出新型的治疗方案。
[0004] 研究miRNA的方法很多，最常用的是使用高通量的芯片来筛选特异的、本发明人 所感兴趣的miRNA,然后使用低通量的方法，比如real-time?〔3、否dhernblot、标记检测 (英光标记或者纳米粒子标记等）来对特定的miRNA表达进行验证，此外也可W通过原位杂 交来检测特定miRNA表达的空间位置和时序性。在功能方面，可W通过k否Ckdown或者过 表达的方法来研究miRNA与祀基因的关系，从而阐明miRNA在生物体中的具体功能。
[0005] 肌营养不良肌病是一种致死的X-连锁隐性遗传性神经肌肉疾病。他的主要病理 特征是骨骼肌进行性变形坏死，纤维化，脂肪浸润，随后逐步失去行走能力最终呼吸W及必 脏衰竭死亡。发病率约为1/3500活产男婴。
[0006] 送种疾病是由于肌营养不良突变导致该蛋白表达缺乏引起。肌营养不良蛋白是一 种细胞骨架蛋白，它将肌纤维通过细胞膜连接到周围的细胞外基质。当该蛋白缺乏时，初始 损伤的肌纤维衰弱坏死，并伴随着一系列复杂的活动，包括吞瞻作用，炎性细胞浸润和随后 的纤维化和脂肪替代肌肉进而导致后续肌纤维的萎缩引起呼吸或必脏衰竭从而使患者过 早死亡。
[0007] 肌营养不良蛋白基因的突变，如果导致可W表达出功能缺陷或者数量不足的 dystro地in蛋白，且患者的临床表现比较温和则称之为贝克型肌营养不良症度MD);如果 基因突变导致dystro地in蛋白缺乏且临床表现严重的则为杜氏肌营养不良症值MD)。
[000引 由于目前没有针对DMD患者的有效治疗方法，因此早发现，早接触协助治疗，延长 其离床活动的时间对于患者来说有着更加重要的意义。因此，本领域技术人员致力于开发 一种能够准确、快速检测DMD并判断其临床发展阶段的技术。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的就是提供一种新的、可用于区分肌营养不良肌病患者样本及正常样 本的microRNA标志物及其用途。
[0010] 本发明的另一目的是提供检测所述疾病的芯片和试剂盒。
[0011] 在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA或miRNA集合，所述的miRNA选 自：
[001引 （i)序列如沈QIDNO. : 1所示的miRNA;
[001引 （U)序列如沈QIDNO. :2所示的miRNA,和/或
[0014] (iii)与（i)或（ii)中所示miRNA序列互补的miRNA。
[0015] 在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体 miRNA能在人细胞内剪切并表达成如本发明第一方面所述的miRNA或miRNA集合。
[0017] 本发明的第H方面，提供了一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸能被人细胞转 录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如权利要求1所述的 miRNA或miRNA集合。
[0018] 在另一优选例中，所述的多核巧酸具有式I所示的结构：
[001引Seq正向-X-Seq反向式I
[0020] 式I中，
[0021] Seqts为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核巧酸序列；
[0022] Seq&自为与Seqi自基本上互补或完全互补的核巧酸序列；
[002引 X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向 不互补；
[0024] 并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
[00 巧] Seq压巧 H…X Se巧巧向
[0026]式II，
[0027] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
[002引 M表示在Seq正自和Seq反自之间形成的碱基互补配对关系。
[0029] 本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的 miRNA,或如本发明第H方面所述的多核巧酸。
[0030] 本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的miRNA或miRNA集合的用途，所 述的miRNA或miRNA集合用于制备区分DMD样本、BMD样本和正常样本的芯片或试剂盒。
[0031] 本发明的第六方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
[00础固相载体；W及
[0033]有序固定在所述固相载体上的寡核巧酸探针，所述的寡核巧酸探针特异性地对应 于沈QIDNO. : 1和/或沈QIDNO. : 2所示的序列。
[0034] 在另一优选例中，所述的寡核巧酸探针含有：
[003引互补结合区；和/或
[0036] 与固相载体相连的连接区。
[0037] 本发明的第走方面，提供了一种本发明第六方面所述的miRNA芯片的用途，所述 miRNA芯片用于制备区分DMD样本、BMD样本和正常样本的试剂盒。
[0038] 本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第六方面所 述的miRNA芯片；或
[0039] 本发明第一方面所述的miRNA或miRNA集合。
[0040] 本发明的第九方面，提供了一种筛选用于治疗肌营养不良肌病的候选药物的方 法，包括步骤：
[0041] (a)提供一测试组和一对照组，其中在所述测试组中将候选物质施用于测试组的 细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miR-499和/或miR-208b的表达水平，而所述的 对照组采用与测试组相同的条件，但不将候选物质施用于对照组的细胞或动物；
[0042] 化）将测试组的miR-499和/或miR-208b与对照组的miR-499和/或miR-208b 的表达水平进行比较；
[004引其中，当测试组的miR-499和/或miR-208b的表达水平显著低于对照组的表达水 平时，则表明该候选物质是用于治疗DMD的候选药物。
[0044] 本发明的第十方面，提供了一种诊断肌营养不良肌病的方法，包括步骤：
[0045] (a)检测样本中miR-499和/或miR-208b的表达水平；
[0046] 化）根据步骤（a)的检测结果，判断检测的样本是否来自肌营养不良肌病患者，判 断方法为：
[0047] 如果miR-499表达水平高于正常样本中的表达水平，和/或
[0048] 如果miR-208b的表达水平高于正常样本中的表达水平，
[0049] 则判定该检测样本来自于DMD患者。
[0050] 在另一优选例中，如果所述miR-499表达水平高于正常样本的3倍，较佳地高于正 常样本的4倍，更佳地高于正常样本的5倍，最佳地高于正常样本的6. 5倍（特异性达到 100 %，灵敏性达到100 % );和/或
[005。如果miR-208b的表达水平高于正常样本的2倍（特异性达到90%，灵敏性达到 95% )，更佳地高于正常样本的3倍，
[0052] 则判定该检测样本来自于肌营养不良肌病患者。
[0053] 本发明中所提及的miR-499和/或miR-208b在正常样本中的表达水平，为正常样 本中miR-499和/或miR-208表达水平的平均值。
[0054] 本发明的第十一方面，提供了一种诊断区分DMD和BMD肌营养不良肌病的方法，包 括步骤：
[00巧](a)检测样本中miR-499和/或miR-208b的表达水平；
[005引 化）根据步骤（a)的检测结果，判断检测的样本是否来自DMD患者还是BMD患者， 判断方法为：
[0057] 如果miR-499表达水平高于BMD样本中的表达水平，和/或
[0058] 如果miR-208b的表达水平高于BMD样本中的表达水平，
[0059] 则判定该检测样本来自于DMD患者。
[0060] 在另一优选例中，所述miR-499表达水平高于正常平均值27倍（特异性达到 92 %，灵敏性达到43% );和/或
[0061]如果miR-208b的表达水平高于正常平均值4. 5倍（特异性达到83 %，灵敏性达到 62%),
[0062] 则判定该检测样本来自于DMD患者而不是BMD患者。
[0063] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0064] 图1显示了miRNA在肌营养不良患者血清中的变化，图A显示了miR-499在肌营 养不良患者血清中的变化；图B显示了miR-208b在肌营养不良患者血清中的变化。
[0065]图 2 显示了miRNA(图A;miR-499;图B;miR-208b)对于正常人、BM