用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸的制作方法
【专利说明】用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸 发明领域
[0001] 本发明是关于靶向在编码肌强直性营养不良蛋白激酶（DMPK)的基因的3'非翻译 区中的多聚CUG重复束（polyCUGrepeattract)的阳离子肽连接吗啉代（PPMO)反义寡 核苷酸及其系统施用用于治疗I型肌强直性营养不良（DMl)。
[0002] 发明背景
[0003] 1型肌强直性营养不良是常染色体显性遗传性病症，主要表现为神经肌肉疾病，但 也可能涉及心脏、内分泌、胃肠道和中枢神经系统功能障碍。DMl的一个标志症状是肌强直， 一种收缩之后肌肉松弛方面的缺陷，并通过肌电图（EMG)由肌肉中持久运行的重复动作电 位检测。DMl中的基因病变由在编码称为肌强直性营养不良蛋白激酶（DMPK)的蛋白激酶的 基因的3'非翻译区中的不稳定CUG三核苷酸重复元件组成。CUG重复的较小拷贝数目在未 受到影响的个体中有发现，而在DMl患者中检测到范围在50拷贝至数千拷贝的较大数目的 不稳定CUG重复。遗传学研宄已经确立了CUG重复数目直接与发病年龄和疾病严重程度相 关（Day&Ranum，2005,NeuromusculDisord15:5-16)。
[0004] 包含较大数目的CUG重复的RNA转录物如DMPK取得了功能获得性 (gain-of-function)特性并在表达突变的DMPK转录物的细胞和组织中促进RNA介导 的毒性（Wheeler&Thornton, 2007,CurrOpinNeurol20:572-576)。病理性的转录物保 留于核中（Tanejaetal.，1995，JCellBiol128:995-1002)，在其中所述病理性的转 录物捕获RNA结合蛋白如MBNLl(Mankodietal.，2001，HumMolGenet10:2165-2170; Mankodietal.，2003,AnnNeurol54:760-768)。多聚（CUG)RNA还增加CUG-BPl的稳态 水平（TimchenkoNAetal. ,2001,JBiolChem, 276:7820-7826 ;Kuyumcu-Martinezet al.，2007,MolCell28:68-78)。MBNLl的封存和CUG-BPl活性的增加都与大数目的RNA转 录物的异常剪接相关。值得注意的是氯离子通道ClC-ImRNA的缺陷性RNA剪接（Mankodi etal.，2002，MolCell10:35-44)，已表明其可直接导致肌强直（Wheeleretal.，2007，J ClinInvest117:3952-3957)。除RNA剪接异常外，突变的DMPK表达的后果还包括骨骼肌 转录物组的重塑（Osborneetal.，2009，HumMolGenet18:1471-1481)。由异常的RNA剪 接导致的具有改变的一级序列（primarysequence)的蛋白产物和包含改变的转录物组的 失调的mRNA水平预期会与DMl疾病的特定方面具有相关性甚至因果关系。
[0005]目前在临床上无靶向毒性RNA(该疾病的首要病理学驱动者）的用于DMl的治 疗剂。对于DMl的标准照护治疗主要是支持性的且目的在于管理特定的病症如肌强直 (Logigianetal.，2010,Neurology74:1441-1448)。新型治疗方式的临床前评估已在包 含在3'非翻译区含有250个CUG三核苷酸插入的人骨骼肌动蛋白转基因的HSAlk转基因小 鼠模型中实施。HSAl莫型表明DMl的多个特征包括通过CUGRNA的MBNL封存和随之而来 的RNA剪接异常、肌肉转录物组中的改变和生理畸变如肌强直（Osborneetal.，2009,Hum MolGenet18:1471-1481;Mankodietal.，（2000),Science289:1769-1773)。在HSAl~J、 鼠中测试的新型治疗模式包括经设计与CUG重复RNA相互作用并释放与病灶关联的MBNLl 蛋白的小分子配体（Warfetal.，2009，ProcNatlAcadSciUSA106:18551-18556; Parkeshetal.，2012,JAmChemSoc134:4731-4742;Oforietal.，2012,Nucl.Acid.Res.出版中，首次在线公开：2012年4月6日）。此外，三种靶向所述CUG重复束的反 义寡核苷酸（ASO)化学已在于DMl转基因小鼠模型中实施的研宄中得以评估（Wheeler etal.,2009,Science325:336-339；Muldersetal. , 2009,ProcNatlAcadSciUSA 106:13915-13920；Leeetal. , 2012,ProcNatlAcadSciUSA109:4221-4226〇Wheeler 及其同事（2009,Science325:336-339)证实了在经过25merCAG序列（CAG25)吗啉代寡 核苷酸肌内（頂）注射的HSAlk小鼠的胫骨前（TA)肌中DMl病理学的局部纠正。CAG25治疗 的TA肌肉表现出核糖核灶存在的减少、MBNLl蛋白的重新分布、RNA剪接异常的纠正、氯离 子通道（CLC-I)蛋白质表达和功能的恢复和肌强直的降低（Wheeleretal.，2009,Science 325:336-339)。虽然该治疗方式表明对HSAlk小鼠DMl样表型的纠正，但是仍需要允许多组 织（包括多组织类型）得以暴露于靶向造成DMl的毒性DMPKRNA转录物的活性吗啉代寡 核苷酸的系统递送策略。
[0006] 贯穿本说明，引用了多个专利、专利申请和其他类型的发表物（例如，杂志文章）。 本文引用的所有专利、专利申请和发表物的公开内容由于各种目的以其全文通过提述并 入。
[0007] 发明概述
[0008] 除其他外，本文提供的发明公开用于制造和使用可系统性递送至多组织和组织类 型的阳离子肽连接吗啉代（PPMO)反义寡核苷酸的组合物和方法，及其用于治疗DMl的用 途。
[0009] 相应地，在一个方面，本文提供在有需要的个体中用于治疗或预防1型肌强直性 营养不良（DMl)的方法，包括：向个体系统施用治疗上有效量的阳离子肽连接吗啉代反义 寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与在肌强直性营养不良蛋白激酶（DMPK)RNA转录物靶的3'非 翻译区（UTR)中的至少3个多聚CUG重复序列互补的序列，其中所述阳离子肽连接吗啉代 反义寡核苷酸的施用至少在两种肌肉中缓解至少一种DMl症状。权利要求1的方法，其中 所述阳离子肽在长度上为8-30个氨基酸残基且包含一种或多种选自下组的亚序列：RXR、 RX、RB和RBR，其中R是精氨酸，B是0 -丙氨酸，且每个X独立为-NH- (CHR1)n-C(0)-，其中 n是4-6且每个R1独立为H或甲基且使至多两个R1是甲基。在一些实施方案中，所述阳离 子肽包含氨基酸序列Ac(RXRRBR) 2XB-。在另一些实施方案中，所述阳离子肽包含氨基酸序 列Ac(RXR) 4XB-。在上述任一方法的实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包 含序列5' _(AGC)n_3'、5' _(GCA)n_3'或5' _(CAG)n_3'，其中n为约5-25中的任意值。在另 一实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在所述寡核苷酸的5'和/或3'末 端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。在一些实施方案中，所述阳离子肽连接吗啉 代反义寡核苷酸包含序列：5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3'。在另一实施方案中，所述 阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸进一步包含5'胺修饰。在上述任一方法的实施方案中， 所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸是二氨基磷酸阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。 在上述任一方法的其他实施方案中，所述阳离子肽通过连接在吗啉代反义寡核苷酸5'末 端的间隔区部分与所述吗啉代反义寡核苷酸分开。在一个实施方案中，所述间隔区部分包 含
[0010]
【主权项】
1. 一种用于在有需要的个体中治疗或预防1型肌强直性营养不良（DMl)的方法，包括： 向所述个体系统施用治疗上有效量的阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸，所述阳离子肽连 接吗啉代反义寡核苷酸包含与至少在肌强直性营养不良蛋白激酶（DMPK)RNA转录物靶的 3'非翻译区（UTR)的3个聚CUG重复序列互补的序列，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义 寡核苷酸的施用在至少两种肌肉中缓解DMl的至少一种症状。
2. 权利要求1的方法，其中所述阳离子肽在长度上为8-30个氨基酸残基且包含一种或 多种选自下组的亚序列：RXR、RX、RB和RBR，其中R是精氨酸，B是β-丙氨酸，且每个X独 立地为-NH-(CHR 1)n-C(O)-,其中η是4-6且每个R1独立地为H或甲基且使至多两个R 1是 甲基。
3. 权利要求2的方法，其中所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXRRBR) 2ΧΒ-。
4. 权利要求2的方法，其中所述阳离子肽包含氨基酸序列Ac(RXR) 4ΧΒ-。
5. 权利要求1-4任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列 5' _(AGC)n_3'、5' _(GCA)n_3' 或 5' _(CAG)n_3'，其中 η 为约 5-25 的任意值。
6. 权利要求5的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸在所述寡核苷酸的 5'和/或3'末端进一步包含1至2个额外的吗啉代核苷酸。
7. 权利要求5的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸包含序列：5' -AGCA GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3, 。
8. 权利要求7的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸进一步包含5'胺修 饰。
9. 权利要求1-8任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸是二氨基 磷酸阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸。
10. 权利要求1-9任一项的方法，其中所述阳离子肽通过连接在吗啉代反义寡核苷酸 5'末端的间隔区部分与所述吗啉代反义寡核苷酸分开。
11. 权利要求10的方法，其中所述间隔区部分包含
12. 权利要求1-11任一项的方法，其中所述肌肉是骨骼肌、平滑肌和/或心肌。
13. 权利要求1-12任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸穿透入 胫骨前肌、四头肌和/或腓肠肌的细胞。
14. 权利要求1-13任一项的方法，其中所述DMl的至少一种症状是肌强直。
15. 权利要求1-14任一项的方法，其中所述DMl的至少一种症状是在肌细胞核内核糖 核灶中的肌盲样蛋白I(MBNL-I)的聚集。
16. 权利要求1-15任一项的方法，其中所述DMl的至少一种症状是肌肉细胞中至少一 种RNA转录物的异常剪接。
17. 权利要求16的方法，其中所述至少一种RNA转录物选自下组：Serca-Um-肌联蛋 白、Zasp 和 CIC-I。
18. 权利要求1-17任一项的方法，其中所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸的系统 施用通过静脉内、腹膜内或皮下实施。
19. 权利要求1-18任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸每周 施用至个体。
20. 权利要求1-19任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸向个 体施用至少一周。
21. 权利要求1-20任一项的方法，其中将所述阳离子肽连接吗啉代反义寡核苷酸与可 药用赋形剂一起施用。
22. 权利要求1-21任一项的方法，其中所述个体是人。
【专利摘要】本文提供靶向在编码肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)的基因的3’非翻译区中的多聚CUG重复束的肽连接吗啉代(PPMO)反义寡核苷酸和用于其系统施用以治疗I型肌强直性营养不良(DM1)的方法。
【IPC分类】C12N15-113
【公开号】CN104837997
【申请号】CN201380061337
【发明人】A·莱杰, B·温特沃思, C·A·纳尔逊, T·E·韦登, N·克莱顿, S·程
【申请人】建新公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年9月24日
【公告号】CA2886017A1, EP2900821A1, US20150238627, WO2014052276A1