使用纳米粒子提取神经干细胞的方法
【专利说明】使用纳米粒子提取神经干细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年11月15日提交的美国临时申请号61/726，762的优先权，该美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及一种从受试者提取生物细胞的方法，特别是但不仅仅是一种从活受试者提取神经干细胞的方法。
【背景技术】
[0004]在神经干细胞研宄和再生医学中的一项重大挑战是从成人的脑中精确地分离和提取功能性神经干细胞。神经干细胞(NSC)在性质上具有自我更新性和多能性，从而使得用于神经系统中的疾病的细胞替代疗法成为可能，这些疾病在目前一般是无法被治愈的。目前，神经干细胞仅可以从胎儿组织中获得或从作为替代来源的其它细胞类型分化而来。在目前，实际上不可能直接从已经是成人的患者本身直接获得神经干细胞。本发明的目的在于提供一种用于从受试者提取生物细胞、特别是神经干细胞的方法，在所述方法中，上述缺点得以减少或至少提供了一种有用的替代方案。
【发明内容】
[0005]因此，本发明提供了一种从受试者提取生物细胞的方法。所述方法包括将磁性纳米粒子引入到所述受试者体内，使用所述磁性纳米粒子靶向生物细胞以形成磁性纳米粒子所靶向的细胞，分离所述磁性纳米粒子所靶向的细胞，以及从所述受试者提取所述磁性纳米粒子所靶向的细胞。
[0006]优选地，所述靶向步骤进一步包括将所述生物细胞与所述磁纳米粒子一起培育的步骤。
[0007]优选地，所述分离步骤进一步包括搅拌所述磁性纳米粒子所革E向的细胞的步骤。
[0008]优选地，所述搅拌步骤包括使用磁力。
[0009]优选地，在所述受试者的外部施加所述磁力。
[0010]优选地，所述磁性纳米粒子包被有二氧化硅。
[0011]优选地，所述磁性纳米粒子与细胞标志物表面缀合。
[0012]优选地，所述磁性纳米粒子带有荧光。
[0013]优选地，所述细胞标志物包括干细胞表面标志物。
[0014]优选地，所述干细胞表面标志物包括抗体⑶133。
[0015]优选地，所述生物细胞是神经干细胞。
[0016]优选地，所述方法是在所述受试者的脑的脑室下区处进行的。
[0017]优选地，所述磁性纳米粒子具有超顺磁性。
[0018]优选地，所述磁性纳米粒子由选自由以下各项组成的组的材料制成:氧化铁纳米粒子、磁赤铁矿(Fe2O3)纳米粒子、磁铁矿(Fe3O4)纳米粒子以及它们的混合物。
[0019]优选地，所述引入步骤包括注射的步骤。
[0020]优选地，所述受试者是活生物体。
[0021]优选地，所述受试者包括青少年或成人。
[0022]优选地，所述培育步骤持续少于或等于约24小时。
[0023]优选地，所述培育步骤持续约6小时。
[0024]优选地，所述搅拌步骤持续少于或等于约15分钟。
[0025]优选地，经由旋转磁场施加所述磁力。
[0026]优选地，所述提取步骤包括使用选自下组的工具:注射器、磁体探针、钕磁体以及它们的组合。
[0027]优选地，在体外(in vitro)施用所述方法。
[0028]优选地，在体内(in vivo)施用所述方法。
[0029]优选地，将所述方法用于治疗、预防患者的神经相关疾病或延迟所述神经相关疾病进展。
[0030]优选地，所述患者包括青少年或成人。
[0031]优选地，将所述方法用于使用患者自身的神经干细胞进行移植和治疗神经相关疾病的定制的细胞替代疗法中。
[0032]优选地，将所述方法用于鉴定神经干细胞群体以进行靶向的神经干细胞提取。
【附图说明】
[0033]根据以下说明，在与附图相结合时，本发明将变得显而易见，其中:
[0034]图1示出了根据本发明的一个实施方案所合成的磁性纳米粒子(MNP)。(a) 二氧化硅包被的典型的MNP的透射式电子显微照片，其中所述粒子的尺寸是约10nm的直径。(b)具有97± 13nm的平均尺寸的二氧化硅包被的MNP的尺寸分布。
[0035]图2示出了 MNP的表征:(a)示出了处于二氧化硅中的氧化铁的饱和磁化强度曲线，并且(b)和(c)示出了每克MNP随温度(5K至300K)而变化的磁化率。
[0036]图3示出了乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定，所述乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定表明了在使用不同浓度的MNP (200-5000 μ g/ml)处理24小时之后PO大鼠脑室中细胞死亡的百分比。
[0037]图4示出了使用缀合有FITC的与抗体缀合的MNP (Ab-MNP)对⑶133+星形细胞进行的选择性分离。
[0038]图5示出了在解离之后，与Ab-MNP —起培育过的PO大鼠侧脑室壁的解离细胞的流式细胞术实验的结果:(a)示出了在不存在Ab-MNP的情况下进行的流式细胞术对照实验；(b)示出了与Ab-MNP —起培育过的、但未进行磁力分离的脑室细胞；(c)和(d)示出了在进行磁力分离处理之后的与Ab-MNP—起培育过的脑室细胞；(e)示出了揭示了纯化的脑室细胞的CD133表达的免疫细胞化学的结果。
[0039]图6示出了使用从提取物拍摄的相应图像对使用在体内施用的Ab-MNP (2000 μ g/ml，在5 μ I的PBS中)从SVZ中高效地提取NSC的最佳的培育时间进行的研宄:(a) O小时；(b) I小时；(c) 3小时；(d) 6小时；(e) 24小时。
[0040]图7示出了使用从SVZ内衬层拍摄的相应图像对用于从SVZ中高效地提取NSC的‘磁力搅拌’的时间事件进行的研宄:(a)在未施用Ab-MNP的情况下；(b) O分钟；(c) 5分钟；(d)10分钟；(e)15分钟。
[0041]图8示出了由所提取的细胞产生神经球:(a)和(b)示出了在磁力分离之后通过注射器获得的具有CD133免疫反应性的脱离的细胞；(c)示出了在未进行磁力搅拌时，在提取物中很难找到CD133+细胞；(d)示出了分化成不同细胞之前的形成神经球的分离的成年大鼠侧脑室⑶133+细胞的放大图像；(e)示出了在培养基中6天之后⑶133+细胞产生的神经球；(f)至(i)示出了在将由神经球产生的不同类型的细胞铺板到PDL包被的表面上之后5天时的结果，包括:(f)-(g)Tuj-l+/MAP2+神经元；(f)GFAP +星形细胞；(h)RIP +少突胶质细胞；以及Q)巢蛋白+未定型(uncommitted)的祖细胞。
[0042]图9示出了在为了提高⑶133+NSC的纯度以进行分化、使用磁体吸引靶细胞时的结果:(a)在施加磁场之前；(b)在施加磁场之后；(C)将钕磁体探针插入SVZ中以对⑶133+细胞进行原位提取。
[0043]图10示出了从脑组织中对NSC进行磁力分离的汇总。
【具体实施方式】
[0044]本发明涉及一种用于从成年哺乳动物采集⑶133+室管膜细胞的基于纳米粒子的提取系统。CD133+室管膜细胞是在被称作脉络丛的脑结构中以相对大的量存在的神经干细胞，所述脉络丛沿着脑的脑室下区(SVZ)内衬。脑室下区在性质上是中空的，这允许在体内对细胞进行手术提取而不会引起重大脑损伤。磁性纳米粒子(MNP)包含由保护性的亲水性二氧化硅壳封装的氧化铁、磁赤铁矿(Fe2O3)、磁铁矿(Fe3O4)或它们的混合物，被用作用于细胞捕集的生物相容性纳米装置。优选地，所述纳米粒子具有超顺磁性。为了提高细胞提取的特异性，已经将抗CD133抗体(CD133是用于鉴定干细胞群体的细胞表面标志物)与MNP
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[0045]将与抗体缀合的MNP (Ab-MNP)通过注射引入到受试者的SVZ中并且培育几小时以允许Ab-MNP对神经干细胞(NSC)进行靶向。将使所述受试者经受旋转过程以促进所靶向的细胞的分离，其中将所述受试者放置在磁场内以促进靶细胞的脱离，其中在所述受试者的外部施加所述磁场。优选地，所述磁场是旋转磁场。将通过使用注射器或钕磁体探针对脱离的细胞进行提取和收集以进行进一步培养。所述受试者被发现能够在所述提取过程之后保持存活。
[0046]然后将所提取的细胞在促进神经球的条件下培养。随后收集神经球以用于诸如神经元之类的所关注的细胞的分化。
[0047]MNP的合成和验证
[0048]根据在以下方法部分中所述的方法来进行合成:合成MNPJf MNP涂覆以二氧化硅、然后涂覆以荧光，随后的将抗体CD133缀合到带有荧光的二氧化硅包被的Ab-MNP上。如从图1中所看到，MNP被发现显示出窄的粒度分布，其中粒子的尺寸是如通过透射式电子显微照相术(TEM)(图1a,比例尺:(A-1)200 ym ； (A_ii) 100 μm)所揭示的约10nm的直径和如通过尺寸分布(图1b)所揭示的97±13nm的平均尺寸。
[0049]还对这些粒子的磁化率进行了测量和优化。如图2中所示，首先测量了二氧化硅包被的典型的氧化铁纳米粒子在递增的磁场中的饱和磁化强度曲线。此后在存在和不存在100奥斯特(Oe)的外部弱磁场的情况下通过超导量子干涉器件(SQUID)对所有功能性氧化铁粒子的磁化率曲线进行了探测(图2b和2c)。注意到，与裸露的氧化铁的70-80emu/g相比，在二氧化娃包被的氧化铁粒子上保持约30emu/g的高饱和磁化强度值(图2a)。FC磁化强度曲线和ZFC磁化强度曲线在阻隔温度(blocking temperature)处以及在低于阻隔温度处分开(TB是铁磁性向超顺磁性的转变)。因此明显的是，所有材料在整个温度范围(高于300K的TB)内均明确地表现出铁磁特性。如从图中