选择性修饰聚合物亚单位以改进基于纳米孔的分析的制作方法

选择性修饰聚合物亚单位以改进基于纳米孔的分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于改善聚合物的基于纳米孔的分析的方法和系统。本公开内容提供了选择性修饰一种预分析物聚合物的一种的一个或多个单体亚单位的方法，其导致聚合物分析物具有被修饰亚单位。所述聚合物分析物在基于纳米孔的系统中产生可检测的信号。所述可检测信号和/或其与参考信号的偏差表明在所述聚合物分析物中所述被修饰亚单位的位置，从而允许在原始预分析物聚合物中那个位置的亚单位的鉴定。
【专利说明】选择性修饰聚合物亚单位从改进基于纳米孔的分析
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年8月30日递交的美国申请号61/872,406的权益。
[0003] 关于序列表的声明
[0004] 与本申请相关的序列表W文本形式代替纸质复印件进行提供，并特此通过引用将 其并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是52586_SEQ_LISTING_ST25.txt。文本文 件为6邸;创建于2014年9月2日；并且通过EFS-Web与递交本说明书一起进行提交。
[0005] 政府许可权声明
[0006] 本发明是W由美国国立卫生研究院授予的资助号R01HG005115下的政府支持进行 的。政府具有本发明的某些权利。
[0007] 发明背景
[000引聚合物分子的快速、可靠且成本节约的分析(诸如核酸和多肤的测序)是研究人员 和执业医师的主要祀。确定聚合物的序列(诸如DNA或RNA或多肤中的核酸序列）的能力在鉴 定遗传突变和多态性方面具有额外的重要性。已确立的DNA测序技术在过去十年已经有了 很大改进，但仍然需要大量的DNA和若干冗长的步骤和努力W得到大于100个核巧酸的连续 阅读长度。然后，该信息必须鸟枪"形式进行组装，运是费力的事，其非线性地依赖于基 因组的大小和构建完整基因组的片段的长度。运些步骤昂贵且耗时，尤其是在对哺乳动物 基因组进行测序的时候。
[0009] 已经将基于纳米孔的分析方法作为传统聚合物分析方法的替代方法进行研究。运 些方法设及将多聚分子(例如单链DNA("ssDNA"))通过纳米级开口，同时监测信号（诸如电 信号），在聚合物分析物通过纳米孔开口时，所述信号受聚合物亚单位的物理性质的影响。 纳米孔最佳地具有使得聚合物仅W依次、单个亚单位顺序(single file order)通过的大 小或Ξ维构型。在理论最佳条件下，聚合物分子W使得聚合物的每个离散单体亚单位的通 过能够与所监测的信号相关联的速率通过纳米孔。构成聚合物的每个单体亚单位(例如构 成ssDNA的核巧酸）的化学和物理性质的差异产生特征电信号，所述特征电信号能够在每个 单体亚单位通过纳米孔时鉴定它。由此，迄今为止已被用于分析DNA、RNA和多肤的纳米孔 (例如保持在脂双层膜内的蛋白质纳米孔W及固态纳米孔)提供强有力地分析甚至是低拷 贝数的聚合物的潜在优点。
[0010] 但是，完全实现运样的好处仍然存在挑战。例如，在理想测序条件下，每个潜在单 体亚单位类型通过纳米孔会产生不同的可检测信号，其能够容易地与任何其他单体亚单位 类型通过纳米孔所产生的可检测信号区分开。但是，取决于纳米孔和特定聚合物分析物的 结构特征，多个单体亚单位类型常常会产生难W区分的可检测信号。例如，在使用基于耻垢 分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)的蛋白质纳米孔分析ssDNA中，孔收 缩部分中的核巧酸对流过该孔的离子电流（ion current)影响最大。当监测离子电流时，已 经发现核巧酸残基腺嚷岭(A)产生最大的可检测电流，而残基胸腺喀晚(T)产生最低的可检 测电流。尽管可W容易地区分A和T残基，但核巧酸残基胞喀晚(C)和鸟嚷岭(G)产生类似地 在A和T残基所产生的电流水平之间的电流水平。因此，C和G残基相互之间常常难W区分。在 另一个实例中，分析蛋白质孔α-溶血素中的ssDNA产生甚至更为压缩的信号，其中对于所有 四个核巧酸残基类型存在信号重叠，运使得碱基判定(base-calling)不确定。
[0011]因此，仍然存在便于产生一致、清楚和可区分的信号的需要，所述信号能够区分聚 合物的每个潜在亚单位类型。本公开内容的方法和组合物解决了该需要和本领域的相关需 要。
[0012] 概述
[0013] 提供本概述是为了 W简化的形式介绍下面在详述中进一步描述的概念的选择。本 概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征，也不旨在被用于帮助确定所要求保护的主 题的保护范围。
[0014] 在一个方面，本公开内容提供了用于分析聚合物分析物的方法。该方法包括：
[0015] (a)将包含被修饰亚单位的聚合物分析物通过纳米孔从第一导电液体介质转运至 第二导电液体介质，其中纳米孔提供第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连 通；
[0016] (b)测量聚合物分析物通过纳米孔时第一导电液体介质和第二导电液体介质之间 的离子电流;W及
[0017] (C)基于所测量的离子电流检测被修饰亚单位。
[0018] 在某些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(a)之前选择性修饰预分析物(pre- anal}fte)聚合物中一个种类的勒1聚合物亚单位(a ta;rget polymer subunit of a kind)， 由此产生包含被修饰亚单位的聚合物分析物。在某些实施方案中，对一个种类的祀聚合物 亚单位的修饰包括将预分析物聚合物与药剂接触，其中药剂能够选择性修饰预分析物聚合 物中某个种类的祀聚合物亚单位。在某些实施方案中，预分析物聚合物包含核酸、PNA、多肤 或其组合。在某些实施方案中，核酸是DNA或RNA。在某些实施方案中，祀聚合物亚单位的种 类是胞喀晚残基、鸟嚷岭残基、胸腺喀晚残基、腺嚷岭残基或尿喀晚残基。
[0019] 在某些实施方案中，对某个种类的祀聚合物亚单位的修饰包括将某个种类的祀聚 合物亚单位选择性转变成脱碱基位点。在某些实施方案中，某个种类的祀核酸聚合物亚单 位被选择性修饰或者新的分析物序列中被修饰亚单位类似物被替代，并且被修饰亚单位随 后用错误校正酶转化成脱碱基位点。
[0020] 在某些实施方案中，步骤(C)包括：
[0021] (i)将所测量的离子电流与对应于包含没有进行修饰的亚单位的参考聚合物的离 子电流进行比较；W及
[0022] (ii)检测步骤（i)中所比较的离子电流中差异的有无，其中离子电流中差异的有 无分别表示聚合物分析物中亚单位修饰的有无。
[0023] 在某些实施方案中，参考聚合物包含与预分析物聚合物相同的序列或由其组成。
[0024] 在某些实施方案中，该方法进一步包括将参考聚合物通过纳米孔从第一导电液体 介质转运至第二导电液体介质并测量离子电流W提供对应于参考聚合物的离子电流。在某 些实施方案中，该方法进一步包括基于所测量的离子电流的特征确定聚合物分析物中被修 饰亚单位的位置。在某些实施方案中，该方法进一步包括确定在预分析物聚合物序列中对 应于聚合物分析物中被修饰亚单位的位置的位置处的祀聚合物亚单位的身份。
[0025] 在某些实施方案中，该方法进一步包括：
[00%] 对于包含共同序列(common sequence)的多个预分析物聚合物执行选择性修饰革己 聚合物亚单位的步骤和步骤(a)和(b);
[0027] 产生在步骤(b)中所测量的多个离子电流的一致性图谱(consensus map); W及
[0028] 检测共同序列中多个被修饰亚单位的存在。
[0029] 在某些实施方案中，该方法进一步包括：
[0030] 对于包含共同序列的多个预分析物聚合物执行选择性修饰祀聚合物亚单位的步 骤和步骤(a)和(b);
[0031] 产生在步骤(b)中所测量的多个离子电流的一致性图谱；
[0032] 将一致性图谱与对应于包含没有进行修饰的亚单位的参考聚合物的离子电流进 行比较；W及
[0033] 检测在一致性图谱和对应于参考聚合物的离子电流之间多个差异的存在，其中多 个差异的存在与否表示共同序列中多个被修饰亚单位的存在。
[0034] 在另一个方面，本公开内容提供了用于分析核酸分析物的方法。该方法包括：
[0035] (a)将经被修饰的核碱基引入核酸分析物；
[0036] (b)将核酸分析物与能够去除被修饰的核碱基的错误校正酶接触W提供核酸分析 物中的脱碱基位点；
[0037] (C)将核酸分析物通过纳米孔从第一导电液体介质转运至第二导电液体介质，其 中纳米孔提供第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连通；
[0038] (d)测量核酸分析物通过纳米孔时第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的 离子电流；W及
[0039] (e)基于所测量的离子电流检测脱碱基位点。
【附图说明】
[0040] 当结合附图时，参考W下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将由于 其变得更好理解而变得更容易理解，其中：
[0041 ] 图1显示了通过将胞喀晚残基（下面的序列，如SEQ ID N0:9所示并且在运里W3' 至5'方向显示）用尿喀晚残基(上面的序列，如SEQ ID N0:8所示并且在运里W3'至5'方向 显示)替代、但保留5-径甲基胞喀晚(*)和5-甲基胞喀晚(**)时在纳米孔系统中获得的电流 差异；
[00创图2显示了与DNA寡核巧酸Μ6Γ甲基护深线)和bM6("甲基6亚硫酸氨盐"浅线)相关 的离子电流水平的图案；
[0043] 图3显示了相比于bM6DNA寡核巧酸，与Μ抓NA寡核巧酸相关的电流水平的差异(M6 减去bM6)。大部分具有C至U的转换的区域具有显著减小的离子电流。参考如SEQ ID Ν0:7所 示、在运里W3'至5'方向显示的分析物序列显示离子电流。
[0044] 详述
[0045] 本公开内容一般性设及有效分析聚合物特征的组合物和方法。在一些方面，本公 开内容提供产生和/或分析对祀聚合物亚单位类型特异性实施的修饰的方法和组合物。运 样的修饰能够强调(或产生)通过纳米孔系统所产生的可检测信号的差异。该差异能够增强 区分聚合物中存在的不同亚单位的能力。
[0046] 纳米孔有希望用于聚合物的便宜、快速和几乎"无试剂"的分析。在纳米孔系统的 一般实施方案中，跨纳米尺度的、填充有电解质的孔施加外部电压，诱导电场。任何分析物 (诸如接触、驻留于或移动通过孔内部的聚合物)基于它的物理特征调制通过孔的离子电 流。如果孔所形成的内部通道具有足够小的直径和长度，通过的聚合物则必须W线性形式 通过，使得一次只有聚合物亚单位的一个子集驻留于孔通道的最收缩区。因此，当聚合物通 过纳米孔(亚单位接着亚单位)时，离子电流随时间波动，其取决于每个重复步骤中驻留于 纳米孔收缩区的亚单位的不同物理特征。亚单位通过时所测量的离子电流的波动可W与亚 单位相关联，从而提供关于聚合物中亚单位类型的序列的信息（即可鉴定的亚单位类型的 依次顺序）。
[0047] 如上所述，基于纳米孔的聚合物分析的主要挑战在于建立纳米孔系统，其中聚合 物的每个特异性亚单位类型产生可区分且特征性的信号。对纳米孔和纳米孔系统的改进已 经被设计用来减慢聚合物分析物通过纳米孔的转运并针对每个单体亚单位产生更加可区 分的信号。然而，本发明人已经开发了能够很容易地应用于所有纳米孔系统的替代方法。如 下文中更详细描述的那样，本发明人已经发现，可W对待分析的聚合物的特异性亚单位实 施选择性修饰，其产生不同于针对原始、未被修饰亚单位所观察到的信号差异。结果，聚合 物中特异性单体亚单位的存在能够通过对运些单体亚单位的修饰(如果存在的话)所产生 的可检测信号中可预测的改变来进行区分。因此，当检测到信号中运样的改变时，从业者可 W很容易地推断特异性单体亚单位的存在，而减少与代表其他单体亚单位类型的信号发生 潜在混淆。该信息能够被应用于确定聚合物分析物的总体序列。在某些实施方案中，修饰产 生能够容易地与对应于任何其他单体亚单位类型的信号区分开的信号改变，并因此仅新信 号的存在就足W确认聚合物序列中被修饰亚单位和原始的、未被修饰的亚单位的存在(和 位置）。
[0048] 根据前文，在一个方面，本公开内容提供了用于分析聚合物分析物的方法。该方法 包括将包含被修饰亚单位的聚合物分析物通过纳米孔从第一导电液体介质转运至第二导 电液体介质，其中纳米孔提供第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连通。该 方法进一步包括测量聚合物分析物通过纳米孔时第一导电液体介质和第二导电液体介质 之间的离子电流。该方法进一步包括基于所测量的离子电流检测被修饰亚单位。
[0049] 本公开内容一般性讨论了便于分析适于在基于纳米孔的系统中进行分析的任何 聚合物分析物的方法。本文使用的术语"聚合物"是指运样的化合物，所述化合物包含两个 或更多个重复结构单元，所述重复结构单元一般性地在本文中可交换地被称为"亚单位"、 "单体单元"或"聚体"，其中每个亚单位可W是相同或不同的。取决于聚合物的类型，每个位 置的潜在亚单位可W选自一组可鉴定的亚单位结构。待用本发明的方法进行分析的聚合物 的非限制性实例包括:核酸、多肤和蛋白质，W及多种控聚合物(例如聚乙締、聚苯乙締)和 官能化控聚合物，其中聚合物主链包含碳链(例如聚氯乙締、聚甲基丙締酸醋）。聚合物可W 包括共聚物、嵌段共聚物和支化聚合物诸如星形聚合物和树状聚合物。
[0050] 在某些实施方案中，聚合物是或者包含核酸。术语"核酸"是指单链或双链形式的 脱氧核糖核巧酸聚合物(DNA)或者核糖核巧酸聚合物(RNA)。在本文中例如DNA的规范聚合 物亚单位的结构是普遍知晓的，并被称为腺嚷岭(A)、鸟嚷岭（G)、胞喀晚（C)和胸腺喀晚 (T)。在本文中，作为一组，它们一般被称为核巧酸或核巧酸残基。对于RNA，除了 W尿喀晚 (u)代替胸腺喀晚(T)W外，规范聚合物亚单位是相同的。
[0051] 在某些实施方案中，聚合物是或者包含多肤，即聚合物是或者包含多个氨基酸残 基的序列。本文使用的"氨基酸"是指W下任意氨基酸:蛋白质中发现的20种天然存在的氨 基酸、天然存在的氨基酸的D-立体异构体(例如D-苏氨酸)和非天然氨基酸。运些氨基酸类 型的每一种并不是相互排斥的。α-氨基酸包含碳原子，氨基、簇基、氨原子和被称为"侧链" 的独特基团与该碳原子键合。天然存在的氨基酸的侧链是本领域众所周知的，并且包括例 如氨(例如在甘氨酸中）、烷基(例如在丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸中）、取代 的烷基(例如在苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、半脫氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、谷氨酸、谷氨酷 胺、精氨酸和赖氨酸中）、芳基烷基(例如在苯丙氨酸和色氨酸中）、取代的芳基烷基(例如在 酪氨酸中）和杂芳基烷基(例如在组氨酸中）。
[0052] W下缩写用于20种天然存在的氨基酸:丙氨酸(Ala;A)、天冬酷胺(Asn;N)、天冬氨 酸(Asp;D)、精氨酸(Arg;R)、半脫氨酸(切s;C)、谷氨酸(Glu;E)、谷氨酷胺(Gln;Q)、甘氨酸 (Gly;G)、组氨酸化is;H)、异亮氨酸（Ile;I)、亮氨酸化eu;L)、赖氨酸化ys;K)、甲硫氨酸 (16*;1)、苯丙氨酸。}16;。）、脯氨酸。'0少）、丝氨酸(56';5)、苏氨酸(化';1')、色氨酸(化口； 胖)、酪氨酸(了71';￥)和鄉氨酸(化1;￥)。
[0053] 任何前述聚合物的实例也可W包括非规范亚单位或类似物。非规范亚单位能够用 于提供明显的输出信号，W表示参考结构域的末端已经通过纳米孔。关于核酸聚合物的实 施方案，非规范亚单位的示例性和非限制性实例包括尿喀晚（用于DNAK5-甲基胞喀晚、5- 美圣甲基胞喀晚、5 -甲酯胞喀晚（5-fo;rmethylcytosine)、5 -簇基胞喀晚（5- 。曰1'13〇巧巧1〇3；[]1日)13-葡萄糖基-5-径甲基胞喀晚、8-氧代鸟嚷岭、2-氨基-腺嚷岭、2-氨基- 脱氧腺嚷岭、2-硫代胸腺喀晚、化咯并-喀晚、2-硫代胞巧或者脱碱基损伤或位点。脱碱基位 点是脱氧核糖主链上缺少碱基的位置。天然核巧酸的已知类似物W类似于天然存在的核巧 酸的方式与核酸杂交，诸如肤核酸(PNA)和硫代憐酸醋DNA。
[0054] 代表性非规范肤残基是本领域已知的，如例如W下文献中所示:Williams等人， Mol.Cell.Biol.9:2574( 1989) ;Evans等人，J.Amer.Chem.Soc. 112:4011-4030( 1990);化等 人，J.Amer.化em.Soc.56:1280-1283(1991);Williams等人，J.Amer.Qiem. Soc. 113:9276- 9286(1991) 及它们之中所引用的所有参考文献。示例性非规范氨基酸包括、但不限于： 2-氨基己二酸、N-乙基天冬酷胺、3-氨基己二酸、径赖氨酸化yho巧lysin)、i3-丙氨酸、β-氨 基丙酸、别径赖氨酸(日11〇-曲化〇巧173山日）、2-氨基下酸、3-径脯氨酸、4-氨基下酸、赃晚酸 (piperidinic acid)、4-^脯氨酸、6-氨基己酸、异锁链素、2-氨基庚酸、别异亮氨酸、2-氨 基异下酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、3-氨基异下酸、N-甲基异亮氨酸、2-氨基庚二酸、6-N-甲 基赖氨酸、2,4-二氨基下酸、N-甲基鄉氨酸、锁链素、正鄉氨酸、2,2'-二氨基庚二酸、正亮氨 酸、2,3-二氨基丙酸、鸟氨酸、N-乙基甘氨酸。引入非规范氨基酸的方法是本领域众所周知 的。
[0055] 在某些实施方案中，单个聚合物可W包含任意前述聚合物和/或聚合物亚单位的 组合。例如，在某些实施方案中，聚合物分析物是DNA、RNA、PNA和/或多肤中任意两种或更多 种的组合。
[0056] 本文使用的术语"聚合物分析物"是指在基于纳米孔的系统中经受分析的聚合物， 纳米孔系统在下文中进行更详细的描述。在某些实施方案中，聚合物分析物可W源自预分 析物聚合物，或反映其序列。本文使用的术语"预分析物聚合物"是指具有单体亚单位的原 始序列的聚合物。如上所述，预分析物聚合物可W是DNA、RNA、PNA、多肤中的任意一种，或其 组合。在某些实施方案中，预分析物聚合物包含核酸。在进一步的实施方案中，核酸是DNA或 RNA。预分析物聚合物的序列不需要事先已知，但是在某些实施方案中可W通过本发明公开 的方法所促进的分析来进行推断。聚合物分析物包含相对于预分析物聚合物中对应亚单位 被修饰的亚单位。在该情形下，术语"被修饰"表示在聚合物分析物的亚单位中存在结构改 变，其产生可W与预分析物聚合物中对应的未被修饰或原始亚单位所产生的信号可区分开 的信号。
[0057] 在某些实施方案中，该方法进一步包括在转运步骤之前选择性修饰预分析物聚合 物中某一种类的祀聚合物亚单位，由此产生包含被修饰亚单位的聚合物分析物。本文使用 的短语"选择性修饰某一种类(一个种类）的祀聚合物亚单位"是指修饰单体亚单位中单个 种类（即类型）的一次或多次重复。例如，在预分析物聚合物是DNA的实施方案中，祀聚合物 亚单位可W是任意一个类型的或种类的亚单位，即任何具体类型的核碱基（例如腺嚷岭 (A)、胸腺喀晚(T)、胞喀晚(C)或鸟嚷岭(G))。在预分析物聚合物是RNA的实施方案中，祀聚 合物亚单位可W是任意一个类型或种类的亚单位，即任何具体类型的核碱基(例如腺嚷岭 (A)、尿喀晚化）、胞喀晚(C)或鸟嚷岭(G))。作为一个具体示例性实例，祀亚单位类型可W是 胞喀晚(C)，其经受选择性修饰，其中其他任何类型(在该DNA实例中是A、T或G)不被修饰。当 W具有未知序列的预分析物聚合物开始时，将不会事先知道是否存在任何C亚单位，存在多 少C亚单位，或者任意C亚单位存在于序列的哪里。然而，该知识不是必须的。
[0058] 不管有无任何事先知识，被修饰的某一种类的祀聚合物亚单位的具体数目仅受到 预分析物聚合物序列中一个种类的聚合物亚单位的数目的限制。即便在预分析物聚合物中 存在多个某一种类祀聚合物亚单位，本发明的方法包括修饰小于所有现有的某一种类祀聚 合物亚单位。在一个实施方案中，修饰现有的某一种类祀聚合物亚单位中的一个。例如，即 使预分析物聚合物在序列中包含多个祀胞喀晚亚单位，只修饰胞喀晚亚单位中的一个。在 另一个实施方案中，修饰现有某一种类祀聚合物亚单位中的超过一个。在又一个实施方案 中，修饰所有的现有的某一种类祀聚合物亚单位。如下文中更详细描述的那样，在修饰小于 所有现有的某一种类祀聚合物亚单位的实施方案中，可W对多个拷贝的预分析物聚合物进 行分析W产生多个测量的离子电流。然后，多个离子电流的一致性(consensus)可W被用于 定位预分析物序列的原始序列内某一种类祀聚合物亚单位的所有位置。
[0059] 在某些实施方案中，修饰某一种类祀聚合物亚单位的步骤包括将预分析物聚合物 与药剂接触，其中药剂能够选择性修饰预分析物聚合物中某一种类祀聚合物亚单位。如上 所述，修饰是选择性的，因为任何其他种类的聚合物亚单位不被该药剂修饰。
[0060] 在一个实施方案中，预分析物聚合物是或者包含核酸。在一个进一步的实施方案 中，祀聚合物亚单位的种类选自腺嚷岭(A)、胸腺喀晚(T)、胞喀晚(C)、鸟嚷岭(G)或尿喀晚 化)（在RNA中）。
[0061] 在一个实施方案中，祀聚合物亚单位的种类是胞喀晚。在一个进一步的实施方案 中，通过将胞喀晚核碱基转换成尿喀晚核碱基而选择性修饰祀胞喀晚聚合物亚单位。运种 转换也被称为胞喀晚核碱基的脱氨基。可W通过任何各种已知的药剂进行胞喀晚的脱氨 基。作为非限制性实例，可W通过包括亚硫酸氨盐、胞喀晚脱氨基酶、NO、化化和棘霉素等的 药剂进行胞喀晚变成尿喀晚的选择性脱氨基。参见例如Caulfield，J. L.等人"Nitric Oxide-induced Deamination of Cytosine and Guanine in Deoxynucleosides and Oligonucleotides,"The Journal of Biological Qiemistry,273:12689-12695(1998)和 Moyer,R.等人 Echinomycin,a bis-intercalating agent, induces C一 T mutations via cytosine deamination,"Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mu化genesis 228:291-300( 1993)，通过引用将其每一篇W全文并入本文中。
[0062] 在某些实施方案中，进一步将所得尿喀晚转换成聚合物中的脱碱基位点。如上所 述，脱碱基位点是在脱氧核糖主链上缺少碱基的位置(例如缺少核碱基亚单位）。但是，与缺 失突变相反，在脱碱基位点，该位点本身仍然存在并且没有被从聚合物上切除。如下文中更 详细描述的那样，核酸聚合物中的脱碱基位点在纳米孔系统中产生非常独特的信号，其倾 向于不与由任何其他可能的亚单位类型产生的任何信号重叠。因此，一旦尿喀晚转换成脱 碱基位点，所得聚合物可W在该方法的转运步骤中被用作分析物聚合物。
[0063] 在其他实施方案中，尿喀晚转换成脱碱基位点包括将预分析物聚合物与核酸错误 校正酶接触。用于核酸的错误校正酶是众所周知的并可W被用来定位并从核酸聚合物去除 非规范核碱基(例如被修饰的核碱基亚单位）。例如，在一个实施方案中，核酸错误校正酶是 尿喀晚去糖基化酶化NG)或其类似物。能够将尿喀晚核碱基转换成脱碱基位点的其他核酸 错误校正酶是已知的，并且包括在该方法内。
[0064] 在一个实施方案中，祀聚合物亚单位的种类是胞喀晚，并且通过甲基化而选择性 修饰预分析物聚合物中的一个或多个胞喀晚亚单位。在一个实施方案中，通过将预分析物 聚合物与甲基转移酶接触而直接甲基化所述一个或多个胞喀晚亚单位。甲基转移酶不必甲 基化一种类型的祀亚单位中的每一个(例如序列中的每一个胞喀晚）。但是，可W类似地处 理多个、相同的预分析物聚合物，并且可W编译一致山〇邮日113113)信号W确定运类型祀亚单 位的聚集分布(aggregate distribution)。在另一个实施方案中，可W在使用例如引物延 伸或PCR方法产生新的预分析物聚合物过程中通过取代对胞喀晚亚单位进行甲基化。例如， 可W通过使用聚合酶将甲基胞喀晚类似物引入预分析物聚合物序列中代替胞喀晚残基来 选择性甲基化预分析物聚合物中的一个或多个胞喀晚亚单位。在该实施方案中，所提供的 原始dNTP混合物会引入甲基-dS憐酸，例如5-甲基-dCTP代替dCTP。该实例中所得聚合物会 具有W5-甲基胞喀晚代替胞喀晚的序列。
[0065] 在进一步的实施方案中，选择性修饰一个或多个胞喀晚残基的步骤进一步包括将 甲基化的胞喀晚残基转换成脱碱基位点，从而产生聚合物分析物。在某些实施方案中，将甲 基化的胞喀晚残基转换成脱碱基位点包括将预分析物聚合物与核酸错误校正酶接触。如 上，错误校正酶可W是能够识别对规范核酸核碱基的修饰并去除它们而得到脱碱基位点的 任何酶。作为一个非限制性实例，DNA糖基化酶是可W被使用的主要修复酶家族。DNA糖基化 酶分成两类："纯"糖基化酶和AP(脱嚷岭/脱喀晚)裂合酶/糖基化酶。纯糖基化酶在DNA中留 下脱碱基位点，而AP裂合酶/糖基化酶留下具有切口的AP位点，其会使DNA的单链断裂。5-甲 基胞喀晚DNA糖基化酶是从DNA聚合物去除5-甲基胞喀晚碱基的核酸(例如DNA)错误校正酶 的一个实例。
[0066] 在一个实施方案中，祀聚合物亚单位的种类是鸟嚷岭，并且通过甲基化来选择性 修饰预分析物中的一个或多个鸟嚷岭亚单位。如上面对胞喀晚的描述中所述，在一个实施 方案中，通过将预分析物与甲基转移酶接触来直接甲基化一个或多个鸟嚷岭亚单位。甲基 转移酶不需要甲基化一种类型的每个祀亚单位(例如序列中的每个鸟嚷岭）。然而，可W类 似地处理预分析物聚合物的多个复制品，并且可W编辑一致性信号W确定该类型的祀亚单 位的聚集分布。在另一个实施方案中，可W在产生新的预分析物聚合物期间，使用例如引物 延伸反应或PCR方法，通过取代来甲基化鸟嚷岭亚单位。在一个进一步的实施方案中，所述 甲基化鸟嚷岭是3-甲基化鸟嚷岭。在另一个实施方案中，所述甲基化鸟嚷岭是7-甲基化鸟 嚷岭。如上所述，可W使用PCR或引物延伸反应方法，在重新编码的预分析物聚合物中通过 取代实现甲基化鸟嚷岭。在运样的方法中，提供的dNTP混合物可W含有3-甲基-dGTP或7-甲 基-dGTP，而不是dGTP。
[0067] 在进一步的实施方案中，选择性修饰一个或多个鸟嚷岭残基的步骤还包括将甲基 化鸟嚷岭残基转换成脱碱基位点，从而产生聚合物分析物。在一些实施方案中，如上所述， 将甲基化胞喀晚残基转换成脱碱基位点包括使预分析物聚合物接触核酸(例如DNA)错误校 正酶。核酸(例如DNA)DNA误差校正酶的说明性非限制性实例是alkA(来自大肠杆菌），W移 除7-甲基鸟嚷岭碱基。参见例如化rilch,S.S.,等人，"Base excision repair enzyme family portrait: integrating the structure and chemistry of an entire DNA repair pathway"，Sl:;ruc1:ure5(l2): 1543-1550(1997),通过引用全文并入本文。移除3-甲 基鸟嚷岭的核酸(例如DNA)DNA错误校正酶的说明性、非限制性实例包括alkA(来自大肠杆 菌）、tag(也称为"3-甲基腺嚷岭DNA糖基化酶Γ'，来自大肠杆菌）、MAG(来自酿酒酵母）、MPG (来自小鼠或人类）。参见例如Bjelland,S.,等人，Excision of 3-methylguanine from alkylated DNA by 3-methyladenine DNA glycosylase I of Escherichia coli"， Nucleic Acids Res.21(9) :2045-2049(1993) 等人，"purification and properties of the alkylation repair DNA glycosylase encoded the MAG gene from Saccharomyces cerevisiae"，Biochemistry34(14) :4577-4582(1995);和Roy ,R.,等人， ('Distinct substrate preference of human and mouse N-methyIpurine-DNA glycosylases"，Carcinogenesis 17( 10): 2177-2182( 1996)。W上各文献通过引用全文并 入本文。
[0068] 本领域技术人员会容易理解，对一种类型的祀核酸亚单位(例如4、1\6、(：或1]中的 任一个)的选择性修饰，而不是甲基化事件，也可W被应用于预分析物核酸聚合物。因此，例 如，根据类似的方法(例如直接用适当的选择剂或通过在PCR或引物延伸反应中取代W重新 编码预分析物聚合物序列），可W使祀核酸碱基亚单位经受其他修饰。使用适当的核酸(例 如DNA)错误校正酶可W将所得被修饰亚单位转换成脱碱基位点。例如，腺嚷岭亚单位可W 接受特异性祀定的脱氨基化W提供次黄嚷岭亚单位。运些亚单位可W被来自大肠杆菌的 DNA错误校正酶a化A(酵母中的Magi，人类中的MPG)检出并移除。作为另一个实例，DNA错误 校正酶巧g(甲酯胺基喀晚[fapy ]-DNA糖基化酶）（也称作8-氧代鸟嚷岭DNA糖基化酶)识别 运样的7,8-二氨-8-氧代鸟嚷岭(8-氧代鸟嚷岭)和8-氧代腺嚷岭，它们是非-甲基化碱基改 变。尽管运种酶还含有裂解酶活性，其可W在产生脱碱基位点后导致DNA的切割，通过标准 方法(诸如用于裂解酶活性的活性位点的分子工程)可W很容易抑制裂解酶的活性。
[0069] 在很多实施方案中，在预分析物聚合物中一种类型的一个或多个祀亚单位的修 饰，W产生包含被修饰亚单位的分析物聚合物，将足W导致可检测的离子电流，其清楚地发 出存在修饰的信号。例如，通常预计转换任何核酸亚单位成为脱碱基位点将在大部分纳米 孔系统产生明显的信号，该信号不会与来自剩余核酸亚单位的任何离子电流信号重叠。然 而，在某些实施方案中，被修饰亚单位的存在产生了不同的离子电流，运种离子电流可W会 与另一种不同类型已有亚单位产生的离子电流重叠。因此，正是存在离子电流信号变化表 示在序列中特定位置存在被修饰亚单位。因此，在该方法的某些实施方案中，检测被修饰亚 单位的步骤包括:将所测量的离子电流与对应于包含没有进行修饰的亚单位的参考聚合物 的离子电流进行比较;检测所比较的离子电流中差异的有无，其中离子电流中差异的有无 分别表明在聚合物分析物中亚单位修饰。
[0070] 在某些实施方案中，参考聚合物包含与预分析物聚合物相同的序列。在某些实施 方案中，参考聚合物由与预分析物聚合物相同的序列组成。因此，在某些实施方案中，参考 聚合物是预分析物聚合物。
[0071] 在某些实施方案中，所述方法进一步包括通过纳米孔将参考聚合物从第一导电液 体介质转运到第二导电液体介质，并测量离子电流，W提供对应于参考聚合物的离子电流。 在某些实施方案中，该方法进一步包括基于所测量的聚合物分析物的离子电流的特征确定 聚合物分析物中被修饰亚单位的位置。在某些实施方案中，所测量的离子电流的特征是在 聚合物分析物的离子电流和参考聚合物的离子电流之间的差，或者是差异的范围。在某些 实施方案中，所述方法包括确定在预分析物聚合物序列中对应于聚合物分析物中被修饰亚 单位的位置的位置处的祀聚合物亚单位的身份。
[0072] 可W理解，对于DNA分析物的情况下，其中正（或有义)链与负（或反义）链互补，可 W在第一链上进行分析，W确定在第一链中一种第一祀聚合物亚单位的一个或多个位置。 可W在互补链(例如第二链)上进行相同的分析，由于第一链和第二链的互补性，运将指明 第一链中一种第二祀聚合物亚单位的一个或多个位置。例如，DNA的有义链可W被修饰，其 中胞喀晚被转换成尿喀晚(且有可能被进一步修饰成脱碱基位点），如本文所述，获得第一 聚合物分析物。被修饰亚单位会产生可区别的离子电流信号，其指明原胞喀晚在DNA的原始 预分析物有义链中的位置。可W在DNA的反义链上进行相同的修饰W产生第二聚合物分析 物，所述反义链是第一链的互补。得自第二聚合物分析物的离子电流信号表明原始原胞喀 晚在预分析物反义链中的位置。由于原始预分析物反义链中胞喀晚残基与原始预分析物有 义链中鸟嚷岭残基互补，第二聚合物分析物(反义链)的运种分析提供了原始预分析物有义 链中鸟嚷岭的位置。因此，可W清楚地识别用于有义链的四种类型聚合物亚单位中的两种。 在MspA纳米孔系统的情况下，腺嚷岭和胸腺喀晚残基产生易于分辨的离子电流，而胞喀晚 和鸟嚷岭残基常常具有重叠的离子电流。通过成功地识别胞喀晚和鸟嚷岭残基两者的位 置，可高水平的确定性查明整个序列。
[0073] 如上所述，在某些情况下，不是一种类型的全部的已有祀聚合物亚单位都被修饰。 运可能是由于所用药剂的限制，或者是聚合物不能稳定地接受所有变化。因此，在该方法的 某些实施方案中，针对包含共同序列的多个预分析物聚合物进行选择性修饰祀聚合物亚单 位W提供聚合物分析物、转运聚合物分析物，和测量离子电电流的步骤。在该实施方案中， 产生多个测量的离子电流的一致性图谱，并在共同序列中检测存在被修饰亚单位。在进一 步的实施方案中，其中通过不同于参考信号的离子电流信号确定被修饰亚单位的存在，针 对包含共同序列的多个预分析物聚合物进行选择性修饰祀聚合物亚单位W提供聚合物分 析物、转运聚合物分析物和测量离子电流的步骤;产生多个测量的离子电流的一致性图谱； 将该一致性图谱与对应于包含没有进行修饰的亚单位的参考聚合物的离子电流进行比较； 并检测一致性图谱与参考聚合物的相应离子电流之间多处差异的存在，其中多处差异的有 无表明在共同序列中多个被修饰亚单位的存在。
[0074] 在另一方面，本公开内容提供了用于分析核酸分析物的方法，包括：
[0075] (a)将被修饰的核碱基并入核酸分析物；
[0076] (b)用能够去除被修饰的核碱基的错误校正酶接触核酸分析物，W提供核酸分析 物中的脱碱基位点；
[0077] (C)将核酸分析物从第一导电液体介质通过纳米孔转运到第二导电液体介质，其 中所述纳米孔提供第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连通；
[0078] (d)测量核酸分析物通过所述纳米孔时第一导电液体介质和第二导电液体介质之 间的离子电流；W及
[0079] (e)基于所测量的离子电流检测脱碱基位点。
[0080] 如上所述，可W使用已知的在祀核碱基中选择性产生结构变化的药剂直接产生被 修饰的核碱基，所述结构变化诸如甲基化、脱氨基化、氧化等等。或者，可W使用祀核碱基重 新编码核酸分析物，使用已知的对dNTP混合物的适当修饰，W选择的被修饰的核碱基取代 所述祀核碱基(如上所述W及下面示例的）。随后，核酸分析物与错误校正酶(诸如DNA错误 校正酶)接触，DNA错误校正酶是本领域已知的，并且在上文中进行了一般性描述。对本领域 技术人员显而易见的是，运种策略可W针对任何核酸亚单位类型，诸如腺嚷岭(A)、鸟嚷岭 (G)、胞喀晚(C)和胸腺喀晚(T)(或RNA中的尿喀晚化)）。
[0081] 现在将描述纳米孔和纳米孔系统的各个方面。"纳米孔"特定地指一种孔，其具有 的开口在其最狭窄点处的直径为大约〇.3nm至大约2nm。在本公开内容中有用的纳米孔包括 任何能够允许聚合物W适合于监控技术(诸如检测电流波动的技术）的速度从一边线性转 运到另一边的任何孔。在某些实施方案中，纳米孔包括蛋白质，诸如α溶血素、耻垢分枝杆菌 孔蛋白A(MspA)、0mpATb、它们的同系物、或其他孔蛋白，如在美国专利公开号US2012/ 0055792、PCT 国际专利公开号 W02011/106459、W02011/106456 和 Manrao 等人的'书 eading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29DNA polymerase"，化t.Biotechnol.30:349-353(2012)，运些文献通过引用全文并入本文。本文 使用的"同系物"是指来自具有类似的结构和进化起源的另一种类细菌的基因。例如，野生 型MspA的同系物，诸如MppA、PorMl、PorM2和Mmcs4296可W用作本发明的纳米孔。蛋白质纳 米孔作为生物分子具有的优势是:它们自组装，并且彼此基本上相同。此外，有可能赋予基 因工程蛋白质纳米孔所需的属性，诸如用具有不同电荷的氨基酸取代氨基酸残基，或创建 一种融合蛋白（例如外切核酸酶+曰溶血素）。因此，蛋白质纳米孔可W是野生型，或者可W被 修饰W含有至少一种氨基酸取代、缺失或添加。在某些实施方案中，所述至少一种氨基酸取 代、缺失或添加导致纳米孔的不同净电荷。在某些实施方案中，净电荷的不同增加了与聚合 物分析物的第一荷电部分相比净电荷的不同。例如，如果第一荷电部分具有净负电荷，则至 少一种氨基酸取代、缺失或添加会导致纳米孔较少荷负电。在某些情况中，所得净电荷是负 的(但是较少运种情况）、是中性的（其之前是负的）、是正的（其之前是负的或中性的），或是 更多正电荷(其之前是正的，但较少运种情况）。
[0082] 在参见美国专利公开号2012/0055792中已经描述了对MspA纳米孔的修饰，将该文 献通过引用全文并入本文。简单地描述一下，可W用氨基酸取代来修饰MspA纳米孔，W获得 MspA突变体，其参考野生型氨基酸序列而言在位置93有一个突变、在位置90、位置91，或90 和91两个位置有突变，并任选在W下氨基酸位置的任何一个发生一或多个突变:88、105、 108、118、134或139。在一个特定实施方案中，1394参考野生型序列位置而言包含突变09(^/ D91N/D93N(在其中被称为"MlMspA"或"Ml-NNN")。在另一个实施方案中，MspA参考野生型序 列位置而言包含突变D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K (在其中被称为"M2MspA")。参见 美国专利公开号2012/0055792。运样的突变会产生一种MspA纳米孔，其包括具有长度约2至 约6皿、直径约2至约6皿的前厅(vestibule)和具有长度约0.3至约3皿和直径约0.3至约3皿 的缩窄区，其中前厅和缩窄区共同限定了通道。此外，在运些实例中描述的氨基酸取代在纳 米孔的前厅提供了更大的净正电荷，进一步增强了与荷负电的聚合物分析物端相互作用的 能量有利度。
[0083] 在某些实施方案中，纳米孔可包括或包含基于DNA的结构，诸如通过DNA折纸技术 产生的那些。关于用于分析物检测的基于DNA折纸的纳米孔的描述，请参见PCT专利公开号 W02013/083983,将其通过引用并入本文。
[0084] 在某些实施方案中，所述纳米孔可W是固态纳米孔。固态纳米孔可W按照美国专 利号7,258,838和7,504,058的描述来产生，将运两篇文献通过引用全文并入本文。固态纳 米孔具有的优势是它们更坚固和稳定。此外，在一些情况下，固态纳米孔可非常高效和 成本节约的方式多路和批量生产。最后，它们可W与微电子制造技术结合。在某些实施方案 中，所述纳米孔包括杂合蛋白/固态纳米孔，其中纳米孔蛋白质被并入到固态纳米孔。在某 些实施方案中，所述纳米孔是生物适应的固态孔。
[0085] 在某些实施方案中，诸如并入MspA蛋白纳米孔，所述纳米孔包括前厅和缩窄区，它 们共同形成通道。"前厅"指的是纳米孔内部的锥形部分，其直径一般沿中屯、轴从一端到另 一端减少，其中前厅最窄的部分连接至缩窄区。前厅通常可W被可视化为"杯状的"。由于前 厅是杯状的，直径沿着中屯、轴路径变化，其中一端的直径大于相对端的直径。直径可W在大 约化m至大约6nm的范围。任选该直径是大约、至少大约或至多大约2，2.1,2.2,2.3,2.4， 2.5.2.6.2.7.2.8.2.9.3.0. 3.1.3.2.3.3.3.4.3.5.3.6.3.7.3.8.3.9.4.0.4.1.4.2.4.3, 4.4.4.5.4.6.4.7.4.8.4.9.5.0. 5.1.5.2.5.3.5.4.5.5.5.6.5.7.5.8.5.9,或6. Onm,或其 中可衍生的任何范围。中屯、轴的长度可W在大约2nm至大约6nm的范围。任选该长度是大约、 至少大约或至多大约2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4， 3.5.3.6.3.7.3.8.3.9.4.0. 4.1.4.2.4.3.4.4.4.5.4.6.4.7.4.8.4.9.5.0.5.1.5.2.5.3, 5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,或6. Onm，或其中可衍生的任何范围。当本文中提到"直径"时， 可W通过测量中屯、到中屯、距离或原子表面到表面的距离来确定。
[0086] "缩窄区"是指就直径而言的纳米孔通道的最窄部分，其与前庭相连。缩窄区的长 度可W是例如大约0 .化m至大约20nm范围。任选该长度是大约、至多大约或至少大约0.3， 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8，1.9,2，或3nm,或其 中可衍生的任何范围。缩窄区的直径可W为大约〇.3nm至大约2nm。任选该直径为大约、至多 大约或至少大约 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7， 1.8,1.9,2,或3皿，或其中可衍生的任何范围。在其它实施方案中，诸如并入固态孔的那些， 尺寸(长度或直径)的范围可W延伸直到大约20nm。例如，固态纳米孔的缩窄区是大约、至多 大约或至少大约 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7， 1.8，1.9,2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，1，213，14，15，16，17，18，19，或20皿，或其中可衍生的任 何范围。运种纳米孔中的较大尺寸可优选依赖于……
[0087] 在某些情况中，将所述纳米孔置于膜、薄膜或脂质双层内，其可W分隔第一和第二 导电液体介质，在第一导电液体介质和第二导电液体介质之间提供了非导电屏障。因此，所 述纳米孔提供了第一和第二导电液体介质之间的液体连通。在某些实施方案中，所述孔提 供了第一和第二导电液体介质之间唯一的液体连通。所述液体介质通常包含可W通过纳米 孔的内部从第一导电液体介质流向第二导电液体介质的电解质或离子。在本文所述方法中 可用的液体是本领域公知的。运种介质(包括导电液体介质）的描述和实例被提供于例如美 国专利号7,189,503中，通过引用全文并入本文。第一和第二液体介质可W相同或不同，并 且它们之一或两者可W包含盐、去垢剂或缓冲剂中的一种或多种。事实上，本文描述的任何 液体介质都可W包含盐、去垢剂或缓冲剂中的一种或多种。另外，本文描述的任何液体介质 可W包含改变粘度的物质或改变速度的物质。
[0088] 用作祀或一种分析的焦点的聚合物分析物能够与纳米孔相互作用，并(优选W线 性方式)通过所述孔转运到另一侧。本文使用的术语"相互作思'或"正在相互作思'指的是 分析物移动进入至少纳米孔的内部，并且任选通过纳米孔移动。本文使用的术语"通过纳米 孔"或"转运"用于表达所述聚合物分析物的至少某部分(即至少一个亚单位)进入纳米孔的 一侧，并移动进入纳米孔的另一侧，并从纳米孔的另一侧移出。在某些情况中，位于纳米孔 两侧的第一和第二导电液体介质被称为位于顺式区域和反式区域，其中待测量的聚合物分 析物通常通过纳米孔从顺式区域转运到反式区域。然而，在某些实施方案中，待测量的聚合 物分析物可W通过纳米孔从反式区域转运到顺式区域。在某些情况中，不是聚合物的整个 长度通过所述孔，而是聚合物的一部分或片段通过所述纳米孔用于分析。
[0089] 可W使用多种机制使聚合物分析物转运通过所述纳米孔。例如，所述聚合物分析 物和/或参考序列可W电泳转运通过所述纳米孔。还可W在纳米孔系统中并入结构元素 ，W 跨承载纳米孔的膜或薄膜施加电场。例如，该系统可W包括一对驱动电流通过所述纳米孔 的驱动电极。另外，该系统可包括一种或多种测量电极，其测量通过所述纳米孔的电流。运 些可W例如是膜片错放大器或数据采集器。例如，纳米孔系统可包括Axopatch-IB膜片错放 大器(Axon Ins化uments,化ion City,CA)，W跨双层应用电压并测量流过所述纳米孔的离 子电流。所述电场足W转运聚合物分析物通过纳米孔。正如将会理解的，可W使用的电压范 围可W取决于所使用的纳米孔系统的类型。例如，在某些实施方案中，对于嵌于脂质膜中的 基于蛋白质的纳米孔而言，所应用的电场在大约20mV和大约260mV之间。在某些实施方案 中，所应用的电场在大约40mV和大约200mV之间。在某些实施方案中，所应用的电场在大约 lOOmV和大约200mV之间。在某些实施方案中，所应用的电场为大约180mV。在使用固态纳米 孔的其它实施方案中，所应用的电场可W在上述类似的范围，可W高达IV。
[0090] 另外或者备选地，纳米孔系统可包括酶促转运聚合物通过所述纳米孔的成分。例 如，可W包括一种分子马达W影响聚合物通过所述纳米孔的转运。分子马达对于促进聚合 物进入纳米孔和/或促进或调节聚合物通过纳米孔的转运是有用的。理想的是，该转运速度 或平均转运速度小于在没有分子马达的情况下会出现的转运速度。在本文中的任何实施方 案中，所述分子马达可W是酶，诸如聚合酶、外切核酸酶，或Klenow片段。在一个实例中，下 面将要详细描述，可W使用诸如phi29的DNA聚合酶来促进在两个方向上的移动。参见 Cherf ,G.M.,等人，"Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore atsAprecision,"化t .Biotechnol. 30: ；344-；348(2012)，和Manrao等人'书eading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29DNA polymerase, "Pfet .Biotechnol. 30: 349-353(2012)，运两篇文献通过引用将其全文并入本 文。
[0091] 聚合物分析物的特征(诸如识别它们的一些或全部亚单位的特征）可W在纳米孔 系统中确定，运可W基于聚合物分析物在纳米孔中的驻留性来进行。将会容易理解的是，运 样确定的聚合物分析物的特征可W用来推断所述预分析物聚合物的特征。在某些实施方案 中，确定关于一种或多种聚合物亚单位在聚合物分析物中的信息。因此，如上所述，得自选 择性修饰的分析物的离子电流可用来推断在预分析物聚合物中那个位置的原始亚单位。在 某些实施方案中，一种或多种亚单位的存在可用来推断在预分析物聚合物中多个未被修饰 亚单位的存在和模式，W提供"指纹图谱"或初始亚单位序列。在其些实施方案中，确定在预 分析物聚合物中一种、两种或更多种聚合物亚单位的序列身份。在某些实施方案中，确定预 分析物的一些或全部序列。
[0092] 可W基于当与纳米孔相互作用（诸如与纳米孔的外缘、前厅或缩窄区相互作用） 时，聚合物分析物或其亚单位在可测量信号上的作用来确定聚合物分析物或其亚单位的特 征。为了示例，在某些实施方案中，确定或影响可测量信号的聚合物亚单位是驻留在"缩窄 区"（即，具有最窄直径的孔内部的=维区域）的亚单位。取决于缩窄区的长度，影响电解质 通过从而影响电流输出信号的聚合物亚单位的数量可W变化。由纳米孔系统产生的输出信 号是提供多个依赖于聚合物或聚合物亚单位的物理特征的可区别的和可再现的信号的任 何可测量信号。例如，通过所述孔的离子电流水平是可W依赖于驻留在所述纳米孔缩窄区 的特定聚合物亚单位而变化的输出信号。当聚合物在重复步骤中转运(例如一个接一个亚 单位线性通过所述孔)时，所述电流水平可W变化，W产生对应于所述聚合物亚单位的连续 序列的多个输出信号的踪迹或"电流图案"。运个对电流水平或者"阻塞"事件的检测已被用 于表征众多关于结构聚合物(诸如DNA)在各种环境下通过或保持在纳米孔中的信息。
[0093] 一般而言，通过明显区别于背景噪音波动的离子电流变化证实了 "阻塞"，运通常 与纳米孔内（诸如在缩窄区内）存在分析物分子(例如一种或多种聚合物亚单位)相关。阻塞 的强度，或者电流的变化将依赖于存在的聚合物亚单位的特征。因此，在某些实施方案中， "阻塞"被与参考电流相对来进行定义。在某些实施方案中，参考电流相当于当纳米孔没有 被阻塞时的电流水平（即在纳米孔内不存在分析物结构，或分析物结构没有与纳米孔相互 作用）。在某些实施方案中，参考电流水平相当于当纳米孔具有已知分析物(例如已知的分 析物聚合物亚单位)驻留于纳米孔中时的电流水平。在某些实施方案中，电流水平自发地返 回到参考水平(如果纳米孔回复到空的状态或者变成又被已知分析物占据的情况）。在其他 实施方案中，所述电流水平达到反映聚合物分析物通过纳米孔，并且特定的亚单位驻留在 纳米孔变化的下一个重复转运事件的水平。为了示例，相对于限定为未阻塞水平的参考电 流水平，当电流水平低于参考电流水平大约1-100%参考电流水平时，建立所述阻塞。将会 理解，参考电流水平可W立即达到阻塞事件水平，或者备选，可W与阻塞事件分开一段介于 电流测量的时段。例如，当聚合物分析物亚单位进入到纳米孔中时，离子电流可w低于参考 电流水平到一个参考电流的大约、至少约或至多约1 % ,2% ,3% ,4% ,5% ,10% ,15%， 20% ,25% ,30% ,35% ,40% ,45% ,50% ,55% ,60% ,65% ,70% ,75% ,80% ,85% ,90% , 95%，或100%，或任何其中可衍生的范围的阔值量。相对于通过存在已知分析物(例如已知 的聚合物亚单位)限定的参考电流水平，当电流低于或高于参考水平大约1-100%参考电流 水平的量时建立所述阻塞。将会理解，参考电流水平可W立即达到阻塞事件水平，或者备 选，可W与阻塞事件分开一段介于电流测量的时段。例如，当聚合物亚单位进入到所述纳米 孔时，离子电流可W低于或高于参考电流水平到一个参考电流的大约阔值量、至少约或至 多约1 % ,2% ,3% ,4% ,5% ,10% ,15% ,20% ,25% ,30% ,35% ,40% ,45% ,50% ,55%， 60% ,65% ,70% ,75% ,80% ,85% ,90% ,95%，或100%或任何其中可衍生的范围的阔值。 "深度阻塞"可W被识别为运样一个间隔，其中离子电流低于(或高于)至少50%参考水平。 离子电流下降少于50%参考水平的间隔可W被识别为"部分阻塞"。在某些实施方案中，阻 塞中的电流水平保持在至少约1.化S的减少的(或升高的)水平。
[0094] 在某些实施方案中，将获自聚合物分析物的纳米孔分析的可测量信号与已知的信 号或获自已知分析物的信号进行比较。术语"已知分析物"被用来指关于其特定特征(诸如 亚单位序列）的状态是已知的分析物。在某些实施方案中，已知信号获自在相同或相似分析 条件下的已知分析物。在某些实施方案中，可测量信号(诸如获自未知聚合物分析物和参考 标准聚合物分析物的电流图案的比较，可W允许可识别的"指纹图谱"的识别，所述指纹图 谱将聚合物分析物与其他潜在分析物区别开来。在某些实施方案中，可测量信号(诸如获自 未知聚合物分析物和参考标准聚合物分析物的电流图案的比较允许识别在分析物结构域 中的一种或多种聚合物亚单位。将会理解，在运些实施方案中，未知聚合物分析物和参考聚 合物分析物中的对应聚合物亚单位身份的电流水平不必匹配。相反，可W通过对应亚单位 身份的有限选择的电流水平中它们的相对电流水平来确定身份。
[0095] 尽管本公开内容支持指代唯一选择和"和/或"的定义，但是除非明确表明指的是 唯一选择或选择是彼此排斥的情况，否则在权利要求书中使用术语"或"用来表示"和/或"。
[0096] 除非特别指出其他情况，否则根据现有的专利法术语"一个(a)"和"一种(an)"当 与术语"包括(含Kcomprising)"结合使用在权利要求或说明书中时，指的是一个或多个。
[0097] 除非本文中清楚要求例外情况，否则遍布说明书和权利要求书中的术语"包含 (comprise)"、"包括"等等指的是涵盖含义，与专一的或穷举含义相反;换句话说是"包括、 但不限于"的意思。使用单数或复数形式的术语也分别包括复数和单数。另外，当术语"本 文"、"上文"和"下文"和类似术语用于本申请时，指的是作为整体的本申请而不是本申请的 特定部分。
[0098] 本文公开的是材料、组合物和成分，其可W用于本文公开的方法和组合物的产品、 可W与本文公开的方法和组合物的产品联合、可W用于制备本文公开的方法和组合物的产 品或为本文公开的方法和组合物的产品。可W理解，当公开运些材料的组合、子集、相互作 用、基团等时，可具体考虑各个单独的和集合的联合的每一个，即使没有明确公开特别参考 运些化合物的每一个和每一个单独组合和排列。运个概念应用到本公开内容的所有方面， 包括、但不限于本文所述的方法的步骤。因此，任何前述实施方案的特定元素可W被组合或 被在其他实施方案中的元素取代。例如，如果可W进行很多附加步骤，应当理解，运些附加 步骤的每一个可w对任何特定方法步骤或所公开方法步骤的组合进行，并具体考虑每个运 样的组合或组合的子集并应该认为已经被公开。另外，应当理解，本文所述的实施方案可W 使用任何适当的材料(诸如在本文别处描述的或现有技术已知的那些)进行实施。
[0099] 本文引用的出版物和其中引用的主题在此通过引用将其全文被具体并入本文。
[0100] W下是针对ssDNA多核巧酸分子(其中胞喀晚残基已经被转换成尿喀晚残基)所确 定的离子电流的比较的描述。该数据证实在聚合物分析物中的运样的修饰可W用来提供信 号变化，W区分胞喀晚残基W及互补链中的鸟嚷岭残基。由于可W在两条链上进行所述分 析，因此，可W容易地识别任一链中胞喀晚和鸟嚷岭残基的位置。
[0101] 之前在Manrao等人的化Uire Biotechnol. 30(4): 349-353(2012)中描述了实验设 置，将该文献通过引用并入本文。简而言之，PM29DNAP用做分子马达，W控制DNA通过在无 支撑的憐脂双层中建立的单MspA孔的运动。用做导电液体介质的缓冲液是300mM的KC1，其 具有lOmM的HEPES，缓冲到pH 8.00±0.05。在具有定制LabVIEW软件（National Instruments,Austin,Texas)的Axopatch 200B放大器上记录电流，偏压为180mV。
[0102] 常规DNA寡核巧酸和包含尿喀晚核碱基替代胞喀晚核碱基的DNA寡核巧酸购自斯 坦福大学的Protein and Nucleic Acid(PAN)部口。还订购了用于缀合到链上的引物和嵌 段寡聚物。参见表1.
[0103] 表1:寡核巧酸用于比较胞喀晚至尿喀晚取代的基于纳米孔的分析
[0104]
[01化]在每次实验之前，将DNA模板、引物和嵌段寡聚物:1:1.2的比例混合至最终浓 度为50μΜ。然后通过加热到95°C 5分钟、冷却到60°C 2分钟然后再冷却到4°C使DNA退火。实 验浓度:对于DNA为~500nM，对于地i 29DNAP为~500nM，并且对于dNTPs为~500μΜ，对于 MgCl2~为~lOmM，并且对于DTT为~1 ml。
[0106]在对链测序期间，将DNA通过所述孔两次，一次是从5'到3'方向（解链模式），而另 一次为从3'到5'方向（合成模式）。在运个报告中，使用来自地i29DNAP运动的合成模式的数 据。参见 Manrao等人，化Uire Biotechnol. 30(4) :349-353(2012)。所有链包括具有序列5'- PAAAAAAACCTTCCX-3'（在本文中示为SEQ ID N0:1)、连接到5'端的接头序列，其中P代表憐 酸化5'端，X是脱碱基残基。该序列不经受修饰，如下将要描述的，并创建可再现电流基序， 其发信号通知所述读取结束。运个区域用于校准电流，W便控制缓冲液导电性由于蒸发或 溫度变化导致的小的变化。祀序列接着运一校准序列。
[0107] 图1示出了聚合物分析物通过所述MspA纳米孔产生的离子电流差异，其中胞喀晚 残基被尿喀晚残基取代。通过使寡核巧酸"甲基TGCC"(参见SEQ ID N0:5)和"mTGCC Ur (参 见SEQ ID N0:3)通过MspA纳米孔特异性地产生了该离子电流。除了胞喀晚被尿喀晚取代之 外，mTGCC U1与甲基TGCC相同，而5-甲基胞喀晚r'5mC'）和5-径甲基胞喀晚r'5hmC'）在运两 个寡核巧酸之间保持一致。给DNA寡核巧酸排序，W模拟亚硫酸氨盐处理对DNA的作用，其中 亚硫酸氨盐处理导致胞喀晚转换成尿喀晚。图1示出了当对齐到测量的离子电流中图示的 差异时（序列W3'到5'方向显示），"甲基TGCC'DNA(下面的序列，SEQ ID N0:9)和VTGCC υΓ〇ΝΑ(上面的序列，SEQ ID N0:8)序列的内部片段的对齐。未处理的DNA和处理的DNA读数 之间的比较得到链内胞喀晚残基的位置，运极大地简化了用纳米孔测序的任务。运里具体 指出的实例是，两个相邻的尿喀晚残基比单独的尿喀晚残基会产生更大的偏差。因此，在尿 喀晚之后跟随鸟嚷岭会导致更大的离子电流偏差，运可W与针对反义链时一对尿喀晚相区 另IJ(考虑到鸟嚷岭对应于反义链中的胞喀晚，因此可W适于用该方法进行转换）。此外，因为 在双链DNA分子中胞喀晚残基与鸟嚷岭残基配对，所W上面的分析一般可W用双链DNA分子 的有义和反义链两者进行，W获得沿单链的每个C和G的位置。剩下的测序单链分子的步骤 被极大地简化，并着力于剩余未知核巧酸的A和T之间的区别。对于MspA, A和T残基很容易区 另IJ，因为A产生最高的电流，而T产生最低的离子流。
[0108] 因此，显示DNA聚合物分析物中的胞喀晚残基向尿喀晚残基的转换可W被用在基 于纳米孔的测序中，W区别序列中的C残基。因为可W对双链DNA分子的有义和反义链进行 分析，C和G残基两者的位置都可W被明确确定。
[0109] 下面描述了亚硫酸氨盐处理ssDNA预分析物聚合物W产生聚合物分析物，其中胞 喀晚残基已经被修饰或转换成尿喀晚残基。之后的修饰的聚合物分析物和初始的预分析物 聚合物(作为参考)两者的纳米孔分析肯定了运一策略，即运样的化学修饰可W促进预分析 物聚合物序列中胞喀晚残基的明确的区别。
[0"0] 亚硫酸氨盐处理^改进纳米孔测序
[0111] 用纳米孔MspA + phi29 DNAP测序系统（如上在Manrao等人的Nature Biotechnol. 30(4):349-353(2012)的文章中所述），分析具有序列 AAAAAAACCTTCCXACACCGATTCTCCCGAGTCGGCCGAATCrM护）（在本文中示为沈Q ID N0:6)的合 成DNA构建体。运个DNA构建体也经受亚硫酸氨盐转换处理(Zymo Research,Irvine,CA)。也 用Μ S P A纳米孔测序系统对得到的D N A进行测量，所述D N A包含序列 AAAAAAAUUTTUUXAUAUUGATTUTUUUGAGTUGGUUGAATlK "bM护）（在本文中示为沈Q ID NO: 7，并 于图3中W3'到5'方向显示），其所有的胞喀晚残基都被转换成尿喀晚残基。
[0112] ^
[0113] 示于图2的M6和bM6寡核巧酸序列相关的离子电流水平图案接受如下文献中所用 的类似数据分析工具分析，Manrao等人，Nature Biotechnol. 30(4): 349-353(2012)和 Lasz 1〇 , A . Η .,等人，"Detect ion and mapping of 5-methyl cytosine and 5- hydroxymethy1cytosine with nanopore MspA,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:18904- 18909(2013)。该离子电流水平图案在很多位置显著不同。
[0114] 观察到亚硫酸氨盐处理的DNA寡核巧酸含有很多离子电流水平，它们一致性地是 较低水平的离子电流(参见图2)。单个胞喀晚向尿喀晚的转换大致影响了靠近被转换的核 巧酸位点的四个离子电流水平。多个相邻胞喀晚向尿喀晚的转换作用附加地叠加。预期该 环境(即在胞喀晚向尿喀晚转换的附近的核巧酸的身份)影响了信号的强度。靠近脱碱基位 点(X)的尿喀晚残基没有显示明显的离子电流变化，可能是由于脱碱基位点减弱了对胞喀 晚向尿喀晚转换附近的离子电流的冲击。靠近脱碱基位点的离子电流图案一般非常不同于 离开X的几个核巧酸的离子电流。运些结果与上面描述的从初步比较结果获得的发现相一 致。此外，尿喀晚残基具有与胸腺喀晚类似的化学结构，胸腺喀晚是与明显较低的离子电流 (在20pA量级)相关的碱基。未修饰的DNA与亚硫酸氨盐处理过的DNA的电流之间的差异显露 了亚硫酸氨盐处理修饰的碱基的位置，并因此，显露了初始M6构建体内胞喀晚残基的位置。 考虑到运一点，运样的技术是非常有优势的，在没有修饰的情况下，胞喀晚和鸟嚷岭的电流 常常非常相似，使得不同的残基几乎不可区别。一旦胞喀晚残基被转换成尿喀晚残基，所观 察到与未转换分析物的电流水平之间的差异可W与原始序列中胞喀晚残基的位置相关(参 见图2)。
[0115] 下面是关于选择性转换祀核酸残基成为脱碱基位置W促进在基于纳米孔的系统 中聚合物的测序的描述。
[0116] 上文证实了在ssDNA聚合物中胞喀晚残基转换成尿喀晚残基促进了胞喀晚和鸟嚷 岭残基的辨别，最终有助于ssDNA聚合物的序列中所有运样的残基的作图。另外的策略是选 择性创建脱碱基残基，替代特定的祀聚合物亚单位。该策略可W具有的优势是，使用大多数 纳米孔系统产生更大的信号变化。当脱碱基位置创建不与聚合物中任何潜在亚单位类型重 叠的新的、独特的信号时，可W无需将信号与参考相比就可推断出脱碱基单位(和原始祀亚 单位)的位置。对于核酸聚合物来说，内在的方法是用被修饰的碱基重新编码祀亚单位碱基 类型(例如胞喀晚或鸟嚷岭），所述被修饰的碱基可W被DNA修复酶识别，其将切除被修饰的 碱基，留下脱碱基位点。W运种方式，原始碱基被转换成脱碱基位点，运将在纳米孔系统中 提供独特的信号。然而注意到，如果修饰本身提供了独特的信号，诸如上文所述的胞喀晚到 尿喀晚的修饰，则在纳米孔系统分析之前不需要进一步的修饰。然而，如果信号变化不大， 或与对应于任何其他亚单位的信号有一定程度的重叠，则可能需要与参考信号的比较，W 确认被修饰的碱基的位置。
[0117] DNA糖基化酶是修复酶的主要家族，它可W被开发用于被修饰的核酸碱基向脱碱 基位点的最终转换。下文给出可W作用于不同碱基类型和修饰的DNA糖基化酶的特别实例。 女日在Parikh , S . S .,等人的"Base excision repair enzyme family portrait: integrating the structure and chemistry of an entire DNA repair pathway," StrucUire 5(12): 1543-1550(1997)中所述，DNA糖基化酶落入两类："纯"糖基化酶和AP(无 嚷岭的/无喀晚的)裂解酶/糖基化酶。纯糖基化酶在DNA中留下脱碱基位点，而AP裂解酶/糖 基化酶留下带有切口的AP位点，运将引起DNA单链断裂。对于该方法的很多应用，优选使用 纯的糖基化酶。如所熟知的，在糖基化酶中会有很大的重叠，因为单一酶可识别和去除很多 类型的被修饰的碱基。
[0118] 在第一个策略中，亚硫酸氨盐可被用来转换胞喀晚残基成为尿喀晚残基。如上所 述。该处理之后可W接着用诸如UDG的错误矫正酶处理，该酶是纯的糖基化酶。运导致目前 存在于核酸中的尿喀晚残基转换成脱碱基位点。参见化ri化等人的"Base excision repair enzyme family portr曰it: integrating the structure 曰nd chemistry of 曰n entire DNA repair pa1:hwayZ'St;ruc1:ure 5( 12) :1543-1550( 1997)，通过引用其全文将其 并入本文。
[0119] 在第二个策略中，核酸聚合物中的胞喀晚残基可W用修饰的胞喀晚(诸如5-甲基 胞喀晚)取代。运可W通过使用聚合酶与适当的dNTP混合物(其具有用被修饰的版本，诸如 5-甲基一dCTP替代的dC)通过进行PCR或引物延伸反应来完成。可W将所得DNA模板暴露于 DNA校正酶(诸如5-甲基胞喀晚DNA糖基化酶）W去除5-甲基胞喀晚碱基。参见例如化ooks, S . C .等人的"5-methylcytosine recognition by Arabidopsis thaliana DNA glycosylases DEMETER and DML3，"Biochemis化y 53( 15) :2525-2532(2014)和化ng，H.等 人的"Excision of 5-hydroxymethyl cytosine by DEMETER family DNA glycosylases," Biochem Bio地ys Res Commun.446(4): 1067-1072(2014)。每篇文献通过引用其全文并入 本文。运些文献描述了识别5-甲基胞喀晚并将其切除W形成脱碱基位点的相关DNA糖基化 酶 DME、R0S 巧阳 ML。
[0120] 在第Ξ个策略中，可W用被修饰的鸟嚷岭(诸如7-甲基鸟嚷岭)替代核酸聚合物中 的鸟嚷岭残基。运可W使用聚合酶与适当dNTP混合物通过进行PCR或引物延伸反应来完成， 所述dNTP混合物具有用7-甲基一dGTP取代的dG。可W将所得DNA模板暴露于DNA校正酶(诸 如大肠杆菌a化A)W除7-甲基鸟嚷岭碱基除。参见例如化ri化,S.S.等人的"Base excision repair enzyme family portr曰it: integrating the structure 曰nd chemistry of 曰n entire DNA repair pa1:hwayZ'St;ruc1:ure 5( 12) :1543-1550( 1997)，通过引用将其全文并 入本文，其描述了 AlkA去除7-甲基鸟嚷岭和几种其它包括3-甲基腺嚷岭的异常甲基化碱 基。
[0121] 在第四个策略中，可W用诸如3-甲基鸟嚷岭的被修饰的鸟嚷岭替代核酸聚合物中 鸟嚷岭残基。运可W使用聚合酶与适当dNTP混合物通过进行PCR或引物延伸反应来完成，所 述dNTP混合物具有用3-甲基-dGTP取代的dG。可W将所得DNA模板暴露于DNA校正酶，诸如 alkA(来自大肠杆菌）aag(也称作"3-甲基腺嚷岭DNA糖基化酶Γ'，来自大肠杆菌）、MAG(来 自酿酒酵母）、MPG(来自小鼠或人类）。参见例如B jelland , S .等人的"Excision of 3- methylguanine from alkylated DNA by 3-methyladenine DNA glycosylase I of Escherichia coli, "Nucleic Acids Res.21(9):2045-2049(1993),通过引用将其全文并 入本文。Bjelland，S.等人描述了大肠杆菌alkA将有效地移除3-甲基鸟嚷岭。比较来说较弱 一点的程度，大肠杆菌"tag"酶也将去除3-甲基鸟嚷岭。almA和化g都可W有效地除3-甲基 腺嚷岭，其可W用于纳米孔，产生核酸信号，其中腺嚷岭信号与胸腺喀晚、鸟嚷岭或胞喀晚 信号的任一种重叠。还可参见等人的"Purification and properties of the alkylation repair DNA glycosylase encoded the MAG gene from Saccharomyces cerevisiae，"Biochemistir 34( 14): 4577-4582( 1995)，通过引用将其全文并入本文 D 等人描述了酿酒酵母的MG基因编码烷基化修复DNA糖基化酶，其序列与来自大 肠杆菌的alkA DNA糖基化酶同源。MAG在去除3-甲基腺嚷岭、7-甲基鸟嚷岭和7-甲基腺嚷岭 方面与alkA-样有效。与alkA相比，3-甲基鸟嚷岭被MAG切除的速度慢至1/20-1/40。发现3- 甲基鸟嚷岭被MAG切除的动力学类似于被大肠杆菌的3-甲基腺嚷岭DNA糖基化酶I(tag)催 化的3-甲基鸟嚷岭切除的低速率。还可参见Roy,R.等人的"Distinct substrate preference of human and mouse N-methylpurine-DNA glycosylases，"Carcinogenesis 17(10) :2177-2182(1996),通过引用将其全文并入本文。Roy, R.等人公开了与人类蛋白质 相比，当调整到用于从DNA释放3-甲基腺嚷岭的相等活性时，小鼠 MPGW~2-3倍高的速率去 除7-甲基鸟嚷岭和3-甲基鸟嚷岭。
[0122] 因此，各种已知的核酸错误检测酶可用于转换被修饰的核酸单体亚单位成为脱碱 基残基。可W通过在核酸序列中实施合理的修饰，W创建用于错误检测酶的祀，来将运种活 性杠杆作用到本发明的方法。该修饰不需要祀核酸单体亚单位的位置(或甚至初始存在)的 先验信息。所述策略获得对应于任何祀核酸单体亚单位位点的脱碱基位点，因此将很容易 在纳米孔系统中产生可识别信号，运可用来很容易地并且毫无疑义地鉴别在初始核酸序列 中初始祀核酸单体亚单位的位置。
[0123] 尽管上面已经对一些示例性实施方案进行了说明和示范，但应当理解，可W在不 脱离本发明精神和范围的情况下对其进行各种改变。
【主权项】
1. 用于分析聚合物分析物的方法，包括： (a) 使包含被修饰亚单位的聚合物分析物从第一导电液体介质通过纳米孔转运到第二 导电液体介质，其中所述纳米孔提供第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连 通； (b) 测量所述聚合物分析物通过所述纳米孔时所述第一导电液体介质和第二导电液体 介质之间的离子电流;和 (c) 基于所测量的离子电流检测被修饰亚单位。2. 权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前选择性修饰预分析物聚合物中一 个种类的靶聚合物亚单位，从而产生包含被修饰亚单位的聚合物分析物。3. 权利要求2的方法，其中修饰一个种类的靶聚合物亚单位包括使预分析物聚合物与 药剂接触，其中所述药剂能够选择性修饰预分析物聚合物中一个种类的革El聚合物亚单位。4. 权利要求2的方法，其中所述预分析物聚合物包含核酸、PNA、多肽或其组合。5. 权利要求4的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。6. 权利要求5的方法，其中所述靶聚合物亚单位的种类是胞嘧啶残基、鸟嘌呤残基、胸 腺嘧啶残基、腺嘌呤残基或尿嘧啶残基。7. 权利要求6的方法，其中选择性修饰胞嘧啶残基包括选择性将所述胞嘧啶残基转换 成尿嘧啶残基。8. 权利要求7的方法，其中将所述胞嘧啶残基转换成尿嘧啶残基包括使预分析物聚合 物与选自亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氨基酶、no、n 2〇3和棘霉素的药剂接触。9. 权利要求7的方法，其中选择性修饰所述胞啼啶残基进一步包括将所述尿啼啶残基 转换成脱碱基位点，从而产生所述聚合物分析物。10. 权利要求9的方法，其中将所述尿嘧啶残基转换成脱碱基位点包括使预分析物聚合 物与核酸错误校正酶接触。11. 权利要求10的方法，其中所述核酸错误校正酶是尿嘧啶去糖基化酶(UNG)。12. 权利要求6的方法，其中选择性修饰所述胞嘧啶残基包括选择性甲基化所述胞嘧啶 残基。13. 权利要求12的方法，其中选择性甲基化所述胞嘧啶残基包括使预分析物聚合物与 甲基转移酶接触，或使用聚合酶将甲基一胞嘧啶类似物掺入预分析物聚合物序列，以替代 胞嘧啶残基。14. 权利要求12的方法，其中选择性修饰所述胞嘧啶残基进一步包括将甲基化胞嘧啶 残基转换成脱碱基位点，从而产生所述聚合物分析物。15. 权利要求14的方法，其中将所述甲基化胞嘧啶残基转换成脱碱基位点包括使预分 析物聚合物与核酸错误校正酶接触。16. 权利要求16的方法，其中选择性修饰鸟嘌呤残基包括选择性甲基化所述鸟嘌呤残 基。17. 权利要求16的方法，其中选择性甲基化所述鸟嘌呤残基包括使用聚合酶将甲基化 鸟嘌呤类似物掺入所述预分析物聚合物序列，以替代鸟嘌呤残基，或使预分析物聚合物与 甲基转移酶接触。18. 权利要求16的方法，其中选择性修饰所述鸟嘌呤残基进一步包括将所述甲基化鸟 嘌呤残基转换成脱碱基位点，从而产生所述聚合物分析物。19. 权利要求18的方法，其中将所述甲基化鸟嘌呤转换成脱碱基位点包括使预分析物 聚合物与核酸错误校正酶接触。20. 权利要求2的方法，其中所述步骤(c)包括： (i) 将所测量的离子电流与对应于包含没有修饰的亚单位的参考聚合物的离子电流进 行比较;和 (ii) 检测在步骤（i)中比较的离子电流中差异的有无，其中离子电流中差异的有无分 别表明在聚合物分析物中亚单位修饰的有无。21. 权利要求20的方法，其中所述参考聚合物包含与预分析物聚合物相同的序列。22. 权利要求21的方法，其中所述参考聚合物由与预分析物聚合物相同的序列组成。23. 权利要求20的方法，进一步包括将参考聚合物从第一导电液体介质通过纳米孔转 运到第二导电液体介质，并测量离子电流，以提供对应于所述参考聚合物的离子电流。24. 权利要求2或20的方法，进一步包括基于所测量的离子电流的特征确定所述聚合物 分析物中被修饰亚单位的位置。25. 权利要求24的方法，包括确定在预分析物聚合物序列中对应于所述聚合物分析物 中被修饰亚单位的位置的位置处的靶聚合物亚单位的身份。26. 权利要求2的方法，进一步包括： 对包含共同序列的多个预分析物聚合物执行选择性修饰靶聚合物亚单位的步骤和步 骤(a)和(b); 产生步骤(b)中所测量的多个离子电流的一致性图谱；以及 检测在共同序列中多个被修饰亚单位的存在。27. 权利要求20的方法，进一步包括： 对包含共同序列的多个预分析物聚合物执行选择性修饰靶聚合物亚单位的步骤和步 骤(a)和(b); 产生步骤(b)中所测量的多个离子电流的一致性图谱； 将该一致性图谱与对应于包含没有修饰的亚单位的参考聚合物的离子电流进行比较； 以及 检测所述一致性图谱和对应于参考聚合物的离子电流之间多个差异的存在，其中多个 差异的存在与否表明在共同序列中存在多个被修饰亚单位。28. 权利要求1的方法，其中所述纳米孔是固态纳米孔、蛋白质纳米孔、杂合固态-蛋白 质纳米孔、生物调适的固态纳米孔或DNA折纸纳米孔。29. 权利要求2 8的方法，其中所述蛋白质纳米孔是α -溶血素、耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)或其同系物。30. 权利要求28的方法，其中修饰所述蛋白质纳米孔序列或杂合固态一蛋白质纳米孔 序列以含有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。31. 权利要求30的方法，其中所述至少一个氨基酸取代、缺失或添加导致在纳米孔中的 净电荷变化。32. 权利要求1的方法，其中使聚合物分析物通过所述纳米孔转运包括施加电势到所述 第一导电液体介质或第二导电液体介质。33. 权利要求32的方法，其中所述电势在大约40mV到IV之间。34. 权利要求1的方法，其中所述纳米孔与分子马达相关，其中所述分子马达能够以平 均转运速度移动分析物进入或通过所述纳米孔，其中所述平均转运速度小于在没有所述分 子马达的情况下所述分析物电泳转运进入或通过纳米孔时的平均转运速率。35. 用于分析核酸分析物的方法，包括： (a) 将被修饰的核碱基掺入所述核酸分析物； (b) 将核酸分析物与能够去除被修饰的核碱基以在核酸分析物中提供脱碱基位点的错 误校正酶接触； (c) 将所述核酸分析物从第一导电液体介质通过纳米孔转运到第二导电液体介质，其 中所述纳米孔提供所述第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的液体连通； (d) 当所述核酸分析物通过所述纳米孔时，测量所述第一导电液体介质和所述第二导 电液体介质之间的离子电流;以及 (e) 基于所测量的离子电流检测所述脱碱基位点。
【文档编号】B01D57/02GK105992634SQ201480047714
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年9月2日
【发明人】J·H·贡德拉赫, A·拉斯兹罗, I·德尔林顿, J·G·曼德尔
【申请人】华盛顿大学商业中心, 伊路明纳股份有限公司