一种pH与葡萄糖双重响应性药物载体及其制备和应用
【专利摘要】本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种pH与葡萄糖双重响应性药物载体及其制备和应用。所述的药物释放载体是Uio66?CBA?α?CD?CeO2?RGD复合纳米颗粒；其制备过程为：先由苯硼酸改性金属有机框架材料Uio66?NH2制得Uio66?CBA，再以环糊精修饰CeO2纳米颗粒制得α?CD?CeO2，然后将Uio66?CBA和α?CD?CeO2通过硼酸酯键进行组装，并且在组装的材料表面修饰RGD靶分子，而获得复合纳米颗粒。所制得的复合纳米颗粒在酸性条件为pH≤6，葡萄糖浓度1~10mM的双重刺激下，能释放所负载的抗癌药物，具有集靶向、pH及葡萄糖双重响应刺激功能等优点。
【专利说明】
一种pH与葡萄糖双重响应性药物载体及其制备和应用
技术领域
[0001]本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种pH与葡萄糖双重响应性药物载体的制备与应用。
【背景技术】
[0002]纳米载体技术是纳米生物技术的重要发展方向之一。纳米药物载体是指粒径大小在10?1000 nm的一类新型载体，它是以纳米颗粒作为药物载体，将药物治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗。目前常用的药物载体主要是有聚合物纳米颗粒，脂质体，氧化铁，金纳米颗粒等。其中金属有机骨架(Metal organicframeworks, MOFs)是一种由金属离子与含氧或氮的有机配体桥链形成的网状骨架材料，其中金属或金属簇为顶点，刚性或半刚性的有机配体为桥链。例如U166-NH2是以锆为金属中心，2-氨基对苯二甲酸为有机配体组装而成的三维刚性微孔MOFs，由于其密集的无机结构单元与较强的Zr-O键，U166显示出较强的化学和热稳定性，以及较好的载药能力和生物相亲性。另一方面，CeO2是一种常见的催化材料，具有很高的实用及研究价值。在纳米尺度下，由于表面氧缺陷的产生，氧化铈中部分Ce4+被还原为Ce3+以稳定缺陷。此时材料中的Ce3+和Ce4+能够可逆的转化，这一性质使得纳米CeO2能够催化分解生物体内的过量自由基，具有多种生物酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、磷酸酶、过氧化物酶和氧化酶等的模拟活性，以及具有羟基自由基及氮氧化物自由基清除的能力。这些多重酶活性使CeO2在生物方面有着众多极具前景的潜在应用价值。目前，在生物领域其已被开发用于生物检测、疾病诊断及治疗、药物载体及生物支架等方面。
[0003]环糊精分子与苯硼酸分子在碱性条件下易形成硼酸酯键，而硼酸酯键在低pH时会发生水解，在有葡萄糖存在时发生竞争反应。因此，利用环糊精分子修饰的金属氧化物纳米颗粒与苯硼酸修饰的介孔材料组装成受PH及葡萄糖刺激响应的药物释放体系很有研究意义。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种具有pH和葡萄糖双重刺激响应性药物载体及其制备和应用。本发明所制得的U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD复合纳米颗粒药物载体具有在肿瘤部位受pH及葡萄糖双重响应药物释放特性，同时还具有高药物负载率及良好的生物相亲性等优点，可实现对肿瘤或炎症组织的药物递释、靶向一体化的治疗。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种具有PH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体:所述的药物释放载体是U166_CBA-a-CD-Ce02-R⑶复合纳米颗粒;其是先由苯硼酸改性金属有机框架材料仍066-順2制得U166-CBA，再以环糊精修饰CeO2纳米颗粒制得a-CD-Ce02，然后将U166-CBA和a-CD-Ce02通过硼酸酯键进行组装，并且在组装的材料表面修饰R⑶靶分子而获得的复合纳米颗粒。
[0005]—种制备如上所述的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，包括如下步骤:
a)苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成:
将一定量的EDC，NHS加入至4-羧基苯硼酸溶液中，加入U166-NH2，在室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166-CBA材料；
b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成
将六水硝酸铈与α-CD在水中搅拌Ih，之后加入30ml浓氨水，在25?100° C搅拌24h，3000rpm离心处理得上清液，然后将上清液继续高速18000rpm离心处理，得到浅黄色α-⑶-Ce〇2纳米颗粒；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成
将步骤a)制得的U166-CBA材料分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按一定质量比加入0.2mg/mL步骤b)制得的Ct-CD-CeO2纳米颗粒，室温搅拌12h，通过硼酸酯键的构建获得U166-CBA-a-CD-CeO2 复合纳米颗粒；
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒的制备
在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥；
然后将一定量步骤c)制得的U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按一定摩尔比加入CBA-R⑶分子，反应4h，获得Ui o66-CBA-a-CD-CeO2-R⑶复合纳米颗粒。
[0006]步骤a)中U166_NH2与4-羧基苯硼酸的反应摩尔比例是1:1 ；
步骤b)中六水硝酸铺与α-⑶的摩尔比为1:2?1:8。
[0007]步骤c)中U166-CBA与Q-CD-CeO2的质量比为1:2?1:10。
[0008]步骤d)中CBA-R⑶分子与U166-CBA-a-CD-Ce02的反应摩尔比是1:10。
[0009]步骤a)制备的U166_CBA纳米颗粒直径为100± 10 nm；
步骤b)制得的α-⑶-Ce02纳米颗粒直径为5±2 nm，表面带负电荷。
[0010]如上所述的制备方法制得的药物释放载体的应用:U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD复合纳米颗粒在酸性及葡萄糖的双重响应刺激条件下释放所负载的抗癌药物。
[0011 ]更具体地，酸性条件为pH < 6，葡萄糖浓度I?10mM，所述的抗癌药物是为阿霉素、柔红霉素、紫杉醇中的一种或多种。
[0012]更具体地，一种制备如上所述的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，包括如下步骤:
a)表面苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成:
称取104.8 mg四氯化锆加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下搅拌1min形成溶液I;同时称取80.6 mg 2-氨基对苯二甲酸加入到5 mLDMF，超声1min溶解形成溶液2;将溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去离子水，转移至50 mL反应釜中，置于120° C烘箱中反应24 h，离心处理得到样品，依次用DMF，去离子水洗涤2次，最后样品重新分散于去离子水中，得到U1ee-NH2，室温保存备用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩尔比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC与3.3mgNHS，在pH=8.0缓冲液中室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166_CBA材料； b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成
将2.5 mL I M的六水硝酸铈与一定量的环糊精混合于水中，搅拌l-2h，之后加入30 mL质量浓度28wt%的氨水，在一定温度下搅拌24 h，3000 rpm离心处理得上清液，上清液继续在18000 rpm下离心30分钟，并用蒸馈水洗，分散于蒸馈水中，得到环糊精修饰的a-CD_Ce02纳米颗粒，室温保存备用；
六水硝酸铺与环糊精摩尔比为1:2?1: 8，优选摩尔比是1:4;反应温度为25?100° C，优选温度是60° C。
[0013]c)U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成
将一定量U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS缓冲液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2纳米颗粒，在室温下搅拌12h，离心处理获得U166-CBA_a-⑶-CeO2复合纳米颗粒。
[0014]步骤c中U166_CBA与Q-CD-CeO2的质量比是1:2?1:10，最优质量比是1:4。
[0015]d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD 复合纳米颗粒的制备
在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥备用。
[0016]将一定量U166-CBA-a-CD_Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按一定摩尔比加入CBA-R⑶分子，反应4h，获得U166-CBA-a-CD-CeO2-RGD复合纳米颗粒。
[0017]步骤d中CBA-R⑶分子与Ui o66-CBA-a-CD-Ce02的反应摩尔比是1:1O，R⑶分子的固定率是91.76%。
[0018]U166-CBA-a-CD-Ce02-R⑶复合纳米颗粒可作为药物载体，在酸性及葡萄糖的双重响应刺激条件下释放所负载的抗癌药物。体外释放实验结果显示在酸性及葡萄糖的双重刺激下，药物释放量在48h后达到89.69 %，说明复合纳米颗粒具有良好的刺激响应释放效果。细胞毒理实验结果表明1^066-08六-0(?-€^0-0602浓度为12.5 yg/ml时，癌细胞抑制率可达到54.07%，U166-CBA-D0X-a-CD-CeO2-R⑶对癌细胞的抑制率为79.05%。
[0019]与其他药物释放体系相比，本发明的显著优点在于:
(1)本发明所述的金属有机框架/金属氧化物复合纳米颗粒制备简单，合成颗粒尺寸均一;Ct-CD-CeO2粒径小于10 nm，对金属有机框架具有很好的封堵效果，48h预泄漏量低至于9.1%；
(2)本发明所述的金属有机框架/金属氧化物复合纳米颗粒生物相容性好，在肿瘤细胞内易受酸性及葡萄糖双重刺激响应，硼酸酯键解离，释放出所负载药物，可实现对肿瘤或炎症组织的药物递释、靶向一体化的治疗功能。
【附图说明】
[0020]图l(A)U166-NH2颗粒的低倍透射电镜图(TEM);(B)U166-CBA颗粒的低倍透射电镜图(TEM) ； (C)Q-CD-CeO2 纳米颗粒的低倍透射电镜图(TEM) ； (D)U166-CBA-a-CD_Ce02 纳米颗粒的低倍透射电镜图(TEM):照片中白色箭头所指小黑点为α-⑶-CeO2纳米颗粒；
图2(A)U166-NH2纳米颗粒的X射线衍射图像(XRD);图2(B)a-CD-Ce02和U166-CBA-a-CD-CeO2复合纳米颗粒的X射线衍射图像(XRD);横坐标为2Θ角度，纵坐标为衍射强度；
图3为U166-NH2、U166-CBA和U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒在373K的氮气吸附脱附曲线； 图4为U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02复合纳米颗粒针对不同pH以及1mM葡萄糖浓度刺激响应的药物体外释放曲线图；横坐标为释放时间，纵坐标为释放百分率；
图5为考察U166-CBA_a-CD-CeO2复合纳米颗粒的生物相容性测试;横坐标为复合纳米颗粒浓度，纵坐标为细胞生存率；
图6为加入不同组样品培养后所得的细胞存活率柱状图；横坐标为不同组样品，纵坐标为细胞生存率；UControl，2、U166-CBA-a-CD-Ce02 Nps，3、U166-CBA_D0X- Q-CD-CeO2Nps，4、U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02_RGD Nps，5、Free DOX0
【具体实施方式】
[0021]下面以具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
[0022]实施例1
一种制备具有PH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，包括如下步骤:
a)表面苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成:
称取104.8 mg四氯化锆加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下搅拌1min形成溶液I;同时称取80.6 mg 2-氨基对苯二甲酸加入到5 mLDMF，超声1min溶解形成溶液2;将溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去离子水，转移至50 mL反应釜中，置于120° C烘箱中反应24 h，离心处理得到样品，依次用DMF，去离子水洗涤2次，最后样品重新分散于去离子水中，得到U1ee-NH2，室温保存备用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩尔比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC与3.3mgNHS，在pH=8.0缓冲液中室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成
将2.5 mL I M的六水硝酸铈与一定量的环糊精混合于水中，搅拌lh，之后加入30 mL质量浓度28wt%的氨水，在60° C下搅拌24 h，3000 rpm离心处理得上清液，上清液继续在18000rpm下离心30分钟，并用蒸馏水洗，分散于蒸馏水中，得到环糊精修饰的Ct-CD-CeO2纳米颗粒，室温保存备用;六水硝酸铈与环糊精摩尔比是1:4;
c)U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成
将U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS缓冲液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2纳米颗粒，在室温下搅拌12h，离心处理获得U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒;U166_CBA与Q-CD-CeO2的质量比是1:4;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒的制备
在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥备用。
[0023]将U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，然后加入CBA-RGD分子，反应4h，获得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒；CBA-RGD分子与U166-CBA-a-CD-CeO2的反应摩尔比是1:10，R⑶分子的固定率是91.76%。
[0024]实施例2
一种制备具有PH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，包括如下步骤:
a)表面苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成: 称取104.8 mg四氯化锆加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下搅拌1min形成溶液I;同时称取80.6 mg 2-氨基对苯二甲酸加入到5 mLDMF，超声1min溶解形成溶液2;将溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去离子水，转移至50 mL反应釜中，置于120° C烘箱中反应24 h，离心处理得到样品，依次用DMF，去离子水洗涤2次，最后样品重新分散于去离子水中，得到U1ee-NH2，室温保存备用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩尔比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC与3.3mgNHS，在pH=8.0缓冲液中室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成
将2.5 mL I M的六水硝酸铈与环糊精混合于水中，搅拌2h，之后加入30 mL质量浓度28界七％的氨水，在100°(:下搅拌24 h，3000 rpm离心处理得上清液，上清液继续在18000 rpm下离心30分钟，并用蒸馏水洗，分散于蒸馏水中，得到环糊精修饰的Q-CD-CeO2纳米颗粒，室温保存备用；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成
将U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS缓冲液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2纳米颗粒，在室温下搅拌12h，离心处理获得U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒;U166_CBA与Q-CD-CeO2的质量比是1:2;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒的制备
在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥备用。
[0025]将U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，然后加入CBA-RGD分子，反应4h，获得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒；CBA-RGD分子与U166-CBA-a-CD-CeO2的反应摩尔比是1:10。
[0026]实施例3
一种制备具有PH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，包括如下步骤:
a)表面苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成:
称取104.8 mg四氯化锆加入到15 mL N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加0.38 mL醋酸，在55° C水浴下搅拌1min形成溶液I;同时称取80.6 mg 2-氨基对苯二甲酸加入到5 mLDMF，超声1min溶解形成溶液2;将溶液I和溶液2混合后并加入0.033 mL去离子水，转移至50 mL反应釜中，置于120° C烘箱中反应24 h，离心处理得到样品，依次用DMF，去离子水洗涤2次，最后样品重新分散于去离子水中，得到U1ee-NH2，室温保存备用；
取4mg U166-NH2分散于2 mL DMF，按摩尔比1:1加入2.37mg CBA，5.48mg EDC与3.3mgNHS，在pH=8.0缓冲液中室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166_CBA材料；
b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成
将2.5 mL I M的六水硝酸铈与环糊精混合于水中，搅拌l-2h，之后加入30 mL质量浓度28wt%的氨水，在25° C下搅拌24 h，3000 rpm离心处理得上清液，上清液继续在18000 rpm下离心30分钟，并用蒸馏水洗，分散于蒸馏水中，得到环糊精修饰的Q-CD-CeO2纳米颗粒，室温保存备用；
c)U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成
将一定量U166-CBA分散于pH=8.0的I3BS缓冲液中，加入0.2mg/mL Q-CD-CeO2纳米颗粒，在室温下搅拌12h，离心处理获得U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒;U166_CBA与a-CD-CeO2的质量比是1:10;
d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒的制备
在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥备用；
将U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的I3BS缓冲液中，然后加入CBA-RGD分子，反应4h，获得U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒;CBA-RGD分子与U166_CBA-Q-CD-CeO2的反应摩尔比是1:10。
[0027]性能检测:
1、将实施例1制得纳米颗粒水溶液滴在铜网上，晾干后进行TEM扫描(见图1)，结果见图1所示，从图1-A中可以看出Ui o66-NH2颗粒为四面体结构，尺寸均一，平均粒径约为100 ± 5nm;从图1-B中可以看出U166-CBA颗粒为四面体结构，表面有轻微改变，尺寸均一，平均粒径约为100±10 nm;从图1-C中可以看出Q-CD-CeO2 nps平均粒径约为5±2 nm;从图1-D中可以看出U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒四面体结构变形，表面较U166-CBA颗粒变粗糙，可看出分布均勾的a-CD_Ce02 Nps (白色箭头所指)。
[0028]2、粉末衍射仪器 Bruker D8 Advance powder X-ray diffractometer 使用Cu靶，在室温条件下，以2Θ步长为0.02得到的扫描衍射峰数据:光谱用晶面距离d表示。对于同种化合物的同种晶型，XRD谱图在整体上具有相似性，标准峰的d值相对误差值在±2%以内。因此我们选择U166-NH2化合物的标准衍射图谱作对比(图2(A):a)，U166-NH2的标准图片衍射峰位置:7.38、8.52、12.06、14.15、25.75。本发明所合成的U166_NH2的衍射峰位置(图2(八):13):7.40、8.54、12.08、14.17、25.72。本发明所合成1]1066-冊2与标准衍射图片对比，位置基本吻合，可以判断出它们属于同种晶型。同理我们选择CeO2化合物的标准衍射图谱做对比，其中CeO2化合物标准图片衍射峰位置:28.55、33.08、48.49、59.34、59.09、69.42、76.71、76.08。本发明所合成的Q-CD-CeO2 nps和U166-CBA-a-CD-Ce02 nps的衍射峰位置分别为(图2(8)):28.48、33.06、47.51、56.40、69.68、76.08;28.43、33.04、47.53、56.50、69.66、76.19。由于在混合物鉴定中，可能由于含量的下降，导致某些衍射峰的缺失，因此我们选择某些衍射峰来判断。本发明所合成的Q-CD-CeO2 nps和U166-CBA_a-CD-Ce02 Nps与标准衍射图片对比，位置基本一致，可以判断出它们晶型相同。
[0029]3、样品于100°C下抽真空处理，使用仪器美国康塔N0VA2000e表面及孔径分析仪测定了样品在373K的氮气吸附和脱附行为。实验结果显示U166-NH2、U166-CBA和U166-CBA-Q-CD-CeO2 Nps复合纳米颗粒的比表面积分别为804.13 m2/ g,674.29 m2/ g、177.76m2/ g，孔容为0.406 cm3/g、0.388 cm3/g、0.172 cm3/g，孔径为1.867 nm、1.589 nm、0.723nm，说明CBA分子修饰没有影响U166-NH2的比表面积和孔径，后者仍具有较高的吸附能力；而U166-CBA-a-Q)-Ce02复合纳米颗粒比表面积和孔径相比如两者减小，说明a-Q)-Ce02纳米颗粒成功的封堵U166-CBA。如图3所示氮气吸附-脱附等温曲线具有明显的回滞环曲线，说明Ui o66纳米材料是介孔材料。
[0030]4、取2 ml I mg/ml实施例1制得的U166_CBA纳米颗粒加入至2 ml I mg/ml的DOX(阿霉素)充分混合，室温避光搅拌12 h，离心，水洗两次收集上清液，沉淀与α-⑶-CeO2继续反应进行封堵。用焚光分光光度计(Ex=488 nm)，记录波长在500 nm至800 nm间的发射光谱最大吸收值，并根据阿霉素标准曲线计算出每克U166-CBA纳米化合物可负载443 mg的盐酸阿霉素。考察负载了阿霉素的U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02复合纳米颗粒在不同缓冲溶液中的释放效果，具体的实验步骤如下:将I mg吸附药物后的U166-CBA-a-CD-Ce02 Nps复合纳米颗粒分散于3 ml PBS (pH=7.4，10 mM)溶液中，放入透析袋后将透析袋加入47 mlPBS溶液中透析48 h，每隔1.5 h，3 h，5 h，7 h，12 h，24 h，42 h，48 h取3ml溶液测荧光，原溶液再补入3ml PBS，测试的结果如图4所示。曲线I为37 °C，pH=7.4;曲线2为37 °C, pH=7.4,10 mM葡萄糖；曲线3为37 °C，pH=5;曲线4为37 °C，pH=5，10 mM葡萄糖;从图4中可以看出在pH=5，10 mM葡萄糖条件下所释放出的DOX荧光强度最高，说明在此条件下更有利于DOX的释放，可有效的用于肿瘤细胞的药物治疗。
[0031 ] 5、用HeLa细胞作为目标细胞评价U166_CBA-a-CD-Ce02 Nps复合纳米颗粒的生物相亲性:取已消化成单分散的HeLa细胞悬浊液用培养液稀释，以100 yL/孔的密度接种到96孔板，每孔的细胞个数控制约为15个。将96孔板置于37 °C，5% CO2的培养箱中培养24 h后，移去培养液，加入含有不同浓度的U166-CBA_a-⑶-CeO2 Nps复合纳米颗粒细胞培养液，每组设置4个重复孔。继续培养4.5 h后，移去培养液，用PBS缓冲液(pH=7.4)清洗两次，加入200yL培养液继续培养20 h后，每孔分别加入10 度为5 mg/mL的ΜΤΤ，继续培育4 h，小心移去培养液，加入150 yL DMS0，37°C培养25 min，震荡均匀后，在酶标仪上测490 nm处的吸收值，计算细胞存活率，评价U166-CBA- Q-CD-CeO2复合纳米颗粒生物相亲性。图5显示U166-CBA-a-CD-CeO2复合纳米颗粒浓度在5?100 yg/ml区间，细胞存活率均在80%以上，说明U166-CBA_a-⑶-CeO2复合纳米颗粒生物具有很好的生物相亲性，适于当药物载体。
[0032]6、取已消化成单分散的HeLa细胞悬浊液用培养液稀释，以100 yL/孔的密度接种至IJ96孔板，每孔的细胞个数控制约为15个，每组设置4个复孔作为重复组。将96孔板置于37°C，5% CO2的培养箱中培养24 h后，移去孔中培养液，分别加入含有I ,Control 2，U166-CBA-Q-CD-CeO2 Nps (12.5 yg/ml)3,U166-CBA-D0X-a-CD-Ce02 Nps (12.5 yg/ml)4,U166-CBA-D0X-a-CD -CeO2-RGD Nps(12.5 yg/ml) 5,Free DOX(5 yg/ml)，其中3、4组中DOX的浓度为5 yg/ml，加入细胞培养液，继续培养4.5 h，移去培养液，用PBS缓冲液清洗两次，加入200 yL培养液继续培养20 h后，每孔分别加入10 yL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培育4 h，小心移去培养液，加入150 yL DMS0，37 °C培养20 min，震荡均匀后，在酶标仪上测490 nm处的吸收值，计算细胞存活率，评价各组治疗效果。从图6可以看出U166-CBA_D0X-a-CD -CeO2-RGD复合纳米颗粒对癌细胞在24 h内抑制率达到79.05%，说明该药物载体能用于肿瘤的治疗。
[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体，其特征在于:所述的药物释放载体是U166-CBA-a-CD-Ce02-RGD复合纳米颗粒;其是先由苯硼酸改性金属有机框架材料U166-NH2制得U166-CBA，再以环糊精修饰CeO2纳米颗粒制得a-CD-Ce02，然后将U166-CBA和a-⑶-CeO2通过硼酸酯键进行组装，并且在组装的材料表面修饰RGD靶分子而获得的复合纳米颗粒。2.—种制备如权利要求1所述的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:包括如下步骤: a)苯硼酸修饰的U166-CBA材料合成: 将一定量的EDC，NHS加入至4-羧基苯硼酸溶液中，加入U166-NH2，在室温条件下反应12h，离心，去离子水洗2次，获得U166-CBA材料； b)表面α-⑶修饰的Ce02纳米颗粒合成: 将六水硝酸铈与α-CD在水中搅拌Ih，之后加入30ml浓氨水，在25?100° C搅拌24h，3000rpm离心处理得上清液，然后将上清液继续18000rpm离心处理，得到浅黄色a-⑶-CeO2纳米颗粒； c)U166-CBA_a-CD-Ce02复合纳米颗粒的合成 将步骤a)制得的U166-CBA材料分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按一定质量比加入0.2mg/mL步骤b)制得的Ct-CD-CeO2纳米颗粒，室温搅拌12h，通过硼酸酯键的构建获得U166-CBA-a-CD-CeO2 复合纳米颗粒； d)U166-CBA-a-CD-Ce02_RGD复合纳米颗粒的制备 在pH=7.4缓冲液中将R⑶靶分子与CBA分子按1:1摩尔比混合后，加入EDC与NHS分子活化，通过酰胺反应获得CBA-RGD分子，透析后，冷冻干燥； 然后将一定量步骤c)制得的U166-CBA-a-CD-Ce02复合纳米颗粒分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按一定摩尔比加入CBA-R⑶分子，反应4h，获得U166-CBA-a-CD-CeO2-R⑶复合纳米颗粒。3.根据权利要求2所述制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:步骤a)中U166-NH2与4-羧基苯硼酸的反应摩尔比例是1:1。4.根据权利要求2所述制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:步骤b)中六水硝酸铺与α-⑶的摩尔比为1:2?1:8。5.根据权利要求2所述制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:步骤c)中U166-CBA与Q-CD-CeO2的质量比为1:2?1:10。6.根据权利要求2所述制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:步骤d)中CBA-R⑶分子与U166-CBA-a-CD-Ce02的反应摩尔比是1:10。7.根据权利要求2所述制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的药物释放载体的方法，其特征在于:步骤a)制备的U166_CBA纳米颗粒直径为100± 10 nm； 步骤b)制得的α-⑶-Ce02纳米颗粒直径为5±2 nm，表面带负电荷。8.—种如权利要求2所述的制备方法制得的药物释放载体的应用，其特征在于:U166-CBA-Q-CD-CeO2-RGD复合纳米颗粒在酸性及葡萄糖的双重响应刺激条件下释放所负载的抗癌药物。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:酸性条件为pH< 6，葡萄糖浓度I?10mM，所述的抗癌药物是为阿霉素、柔红霉素、紫杉醇中的一种或多种。
【文档编号】A61K47/02GK105902519SQ201610400817
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】朱春玲, 曾胚羡, 谢增鸿, 林旭聪
【申请人】福州大学