一种具有pH和葡萄糖双重响应的纳米球及其制备和应用
【专利摘要】本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种具有pH和葡萄糖双重响应的纳米球及其制备和应用。所述的纳米球是PAA?PBA?Glu?PAA（PPGP）聚合物，其制备过程为：由3?氨基苯硼酸修饰聚合物分子PAA获得PAA?PBA，然后由葡萄糖胺修饰PAA制得PAA?Glu，再将PAA?PBA和PAA?Glu通过硼酸酯键进行交联，在水/异丙醇混合液中进行自组装，获得PPGP纳米球。所制得的PPGP纳米球对抗癌药物阿霉素及核磁成像剂Gd3+具有很高的负载率，且针对pH及葡萄糖具有刺激响应释放特性，具有诊断、治疗一体化功能等优点。
【专利说明】
一种具有pH和葡萄糖双重响应的纳米球及其制备和应用
技术领域
[0001]本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种具有pH和葡萄糖双重响应的纳米球及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]钆核磁成像造影剂是一类Tl-加权MRI成像造影剂，且钆造影剂是医疗过程中常用的一类造影剂，具有水溶性好、毒性低或没有毒性、体内稳定、能够完全被排出体外、弛豫效能高、具有组织选择性等优点。但是其在体内呈非特异性分布，且静脉注射后迅速漏到血管外并被肾脏清除，因而检查所需剂量高，特别是对于肝、脾等组织病变及肿瘤缺乏特异性，有时为了诊断的目的，不得不加大用药剂量，从而增加了机体出现不良反应的风险。临床上常用的Gd-DTPA造影剂rl值较小(一般3.7 mM—^s—1 )，而根据最近的研究结果表明，如果把钆离子做成纳米颗粒时，其MRI性能会得到提高。所以，发展基于钆离子纳米颗粒制备可降解型多功能药物载体，同时能提高钆造影剂的造影性能，对推动其临床应用具有非常明显的意义。
[0003]理想的纳米药物释放系统应具有生物相容性、生物可降解性、较长的血液循环时间、肿瘤靶向性、高载药率、药物刺激响应释放等特性。因此，利用纳米材料作为抗肿瘤药物的载体，构建新型的智能响应体系，实现定时、定量的将药物导入病变部位，提高药物的利用率，在临床治疗中具有潜在的应用前景。聚合物胶束(Polymeric Micelles，PMs)是近20多年来被广泛关注和快速发展的一种新型纳米载体。响应性聚合物胶束可对药物进行靶向可控缓释，在提高药效的同时减少药物的副作用，同时，能在体内降解为小分子化合物，从而被机体代谢、吸收或排泄，对人体无毒副作用，因而已成为药物传递系统研究的热点。
[0004]另一方面，低分子量的聚丙烯酸盐(PAA)能在水/异丙醇混合液中自组装成球，这种PAA纳米球因包含大量的羧基基团，所以对亲水性带正电的抗癌药物具有很高的负载率。但是，由于PAA纳米球良好的水溶性，易在水溶液中溶胀破裂，造成药物预泄露很严重，不利于其作为药物载体的后续应用。因此，采用化学手段增强PAA纳米球的交联，达到稳定其结构的目的；同时，又能赋予PAA纳米球新功能(如核磁成像、CT成像等)，发展多功能刺激响应型药物释放体系，实现诊治一体化目的，具有极高的研究意义。
【发明内容】
[0005]
本发明的目的在于提供一种具有PH和葡萄糖双重响应的纳米球及其制备和应用。本发明所制得PAA-PBA-Glu-PAA(PPGP)聚合物纳米球具有在肿瘤部位受pH及葡萄糖双重响应药物释放特性，同时，PPGP纳米球对抗癌药物阿霉素及核磁成像剂Gd3+具有很高的负载率，可实现诊断、治疗一体化的目的。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种具有PH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球:其是由3-氨基苯硼酸(PBA)修饰聚丙烯酸钠(PAA)分子制得PAA-PBA;再由葡萄糖胺(Glu)改性聚丙烯酸钠(PAA)获得PAA-Glu，然后将PAA-PBA和PAA-Glu通过硼酸酯键进行交联与自组装，而制得的PAA-PBA-Glu-PAA纳米球。
[0007]一种制备如上所述的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的方法，包括如下步骤:
a)PAA-PBA聚合物材料的合成:
将一定量的H)C和NHS加入至3-氨基苯硼酸溶液中，然后加入聚丙烯酸钠，在室温条件下反应并对所得产物进行透析、冷冻干燥后，获得PAA-PBA聚合物材料；
b)PAA-Glu聚合物材料的合成:
将一定量的H)C和NHS加入至葡萄糖胺溶液中，加入聚丙烯酸钠，在室温条件下反应并对所得产物进行透析、冷冻干燥后，获得PAA-Glu聚合物材料；
c)PAA-PBA-Glu-PAA纳米球的组装:
将步骤a)制得的PAA-PBA聚合物材料分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，加入步骤b)制得的PAA-Glu聚合物材料，室温搅拌12 h，通过硼酸酯键的构建获得PAA-PBA-Glu-PAA聚合物溶液;再往聚合物溶液中逐滴加入一定体积的异丙醇使聚合物分子自组装，然后经甲醇离心、洗涤处理，获得PAA-PBA-Glu-PAA纳米球。
[0008]步骤a)中聚丙烯酸钠与3-氨基苯硼酸的反应摩尔比是7:1?2:1;步骤b)中聚丙烯酸钠与葡萄糖胺的反应摩尔比是7:1?2:1。
[0009]步骤c)中PAA-Glu聚合物材料与PAA-PBA聚合物材料的质量比是1:1;步骤c)中在PAA-Glu-PBA-PAA的自组装反应体系中水和异丙醇体积比是1:20。
[0010]步骤c)制备的PAA-PBA-Glu-PAA纳米球的平均直径为100±10 nm;表面带负电。
[0011]一种如上所述的方法制得的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的应用:作为核磁成像剂Gd3+和抗癌药物的载体。
[0012]在上述应用中，所述的抗癌药物为阿霉素;阿霉素与纳米球复合后，在pH彡6、葡萄糖浓度为I?10 mM的双重刺激条件下释放阿霉素。
[0013]在上述应用中，PAA-PBA-Glu-PAA纳米球和核磁成像剂Gd3+复合时的摩尔比为1:
0.25-1:2，所制得的PAA-PBA-Glu-PAA-Gd3+纳米聚合物球的平均直径为100土 10 nm、表面带正电；更优的，PAA-PBA-Glu-PAA纳米球和核磁成像剂Gd3+复合时的摩尔比为1: 1.5，此时，Gd3+的实际固定量达到74.76% ο
[0014]与其他药物释放体系相比，本发明的显著优点在于:
(1)本发明的聚合物纳米球PPGP制备方法简单，合成颗粒尺寸较为均一，条件温和可控，易于规模化;可负载核磁成像剂Gd3+和抗癌药物，具有pH和葡萄糖双重刺激响应性；
(2)本发明的聚合物纳米球对核磁成像剂Gd3+和抗癌药物的负载率高，对抗癌药物的负载率可达到74.21%，因此可有效降低治疗过程中药物载体的使用量，达到减少副作用的目的；
(3)本发明所述的聚合物纳米球PPGP生物相容性优良，易于在细胞内降解，是可降解型药物载体；
(4)以本发明聚合物纳米球为载体的核磁成像剂PPGP-Gd3+在肿瘤细胞内易受酸性及葡萄糖双重刺激响应，硼酸酯键解离，释放出所负载钆离子，可实现对肿瘤或炎症组织的 MRI成像功能。
【附图说明】
[0015]
图1为PPGP纳米球的低倍透射电镜图(TEM)(A)5PPGP-Gd3+纳米球的低倍透射电镜图(TEMXB)；
图2为PPGP纳米球的红外图谱;横坐标为波数，纵坐标为吸收强度；
图3为PAA纳米球与PPGP纳米球的粒径变化图；横坐标为不同时间组样品(1、甲醇;2、pH=7.4,PBS-O h;3、pH=7.4，PBS-24 h;4、pH=7.4，PBS_72 h)；
图4为PAA-DOX纳米球与PPGP-DOX纳米球的预泄漏实验;横坐标为释放时间，纵坐标为释放百分率；
图5为考察PPGP-Gd3+纳米球的生物相容性测试;横坐标为纳米球浓度，纵坐标为细胞存活率；
图6为考察PPGP-Gd3+纳米球的细胞毒性实验;横坐标为不同样品组，纵坐标为细胞存活率；UControl 2、PPGP-Gd3+3、PPGP-Gd3+-DOX 4、Free DOX；
图7为PPGP-Gd3+纳米球在不同条件下的体外核磁共振成像对比图；横坐标为Gd3+浓度，纵坐标为每秒分之一。
【具体实施方式】
[0016]下面以具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
[0017]实施例1
一种制备具有PH和葡萄糖双重刺激响应的聚合物纳米球的方法，具体步骤为:
a)PAA-PBA聚合物材料的合成:
取4 mg PAA溶解于2 mL去离子水中，按摩尔比4:1加入2.46 mg 3-氨基苯硼酸，2.73mg EDC与1.634 mg NHS，在室温条件下反应24 h，透析处理24 h，冷冻干燥12 h，获得PAA-PBA聚合物材料；
b)PAA-Glu聚合物材料的合成:
取4 mg PAA溶解于2 mL去离子水中，按摩尔比4:1加入3.06 mg葡萄糖胺，2.73 mg EDC与1.634 mg NHS，在室温条件下反应24 h，透析处理24 h，冷冻干燥12 h，获得PAA-Glu聚合物材料；
c)PPGP聚合物纳米球的组装:
将步骤a)制得的PAA-PBA材料分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，按质量比为1:1加入步骤
b)制得的PAA-Glu材料，室温搅拌12 h，通过硼酸酯键的构建获得PPGP聚合物材料;之后再加入16 mL异丙醇使其自聚合，进一步形成PPGP聚合物纳米球；
d)PPGP-Gd3+-D0X聚合物纳米球的组装:
将步骤c)制得的PPGP聚合物纳米球分散于甲醇中，按摩尔比为1: 1.5加入六水硝酸钆，室温搅拌6 h，离心甲醇清洗处理;再按质量比1:2加入D0X，室温搅拌12 h，进一步离心处理得PPGP-Gd3+-DOX聚合物纳米球。通过ICP-MS检测确认Gd3+的实际固定量达到74.76%;荧光数据表明DOX的吸附率是74.21%。
[0018]步骤C)制备的PPGP纳米球相比PAA纳米球具有更好的热稳定性，有利于药物的缓释性能;Zeta粒度分析仪数据表明:在pH=7.4缓冲液中，在0-72h内，PPGP纳米球的粒径从150 nm增大到367 nm，而PAA纳米球则从367 nm增大到1365 nm。在ρΗ=7.4缓冲液中，PPGP-DOX在48 h内的预泄露率为24.18%，而PAA-DOX的预泄露率为98.7%。上述数据说明PPGP纳米球在水中的稳定性更高，更有利于药物的缓慢释放。
[0019]应用实施例1
将实施例1步骤C)制得的PPGP纳米球，取0.5 mg重新分散到0.875 mL甲醇溶液中，加入12.5 uL，0.1 M的六水硝酸钆甲醇溶液，室温反应6 h之后，离心处理得固体，继续用甲醇洗2次，最后获得PPGP-Gd3+纳米聚合物胶束。
[0020]体外核磁成像实验结果表明，在pH=5.0缓冲液中PPGP-Gd3+纳米球造影剂的rl值为14.93 mM—1.S—S在葡萄糖=10 mM，pH=5.0的缓冲液中，PPGP-Gd3+纳米球造影剂的rl值最高可达到34.34 mM—1.S—1，说明PPGP-Gd3+聚合物纳米球可实现针对pH及葡萄糖双重刺激响应触发的Tl加权MRI成像。
[0021]性能检测:
1、将实施例1制得PPGP纳米球甲醇溶液滴在铜网上，晾干后进行TEM扫描(见图1)，结果见图1所示，从图1-A中可以看出PPGP胶束为球形颗粒，尺寸较为均一，分散性较好，平均粒径约为100 ± 1 nm；将应用实施例1制得PPGP-Gd3+纳米球甲醇溶液滴在铜网上，从图1 -B中可以看出PPGP-Gd3+纳米聚合物胶束仍为球形结构，尺寸均一，平均粒径约为100± 10 nm；
2、将实施例1制得不同产物在60°C干燥成固体，取3mg与溴化钾均匀混合，之后利用压片机将其压制成透明均匀的小薄片;红外测试结果如图2所示，其中图2为四种聚合物的叠加图，可知聚合物b和d在波数为3000-3700 cm—1左右有较大宽峰，主要由于此二者聚合物含有较多-0H，并且聚合物b、c、d均有氨基吸收峰，说明PAA-Glu、PAA-PBA、以及PPGP均已通过酰胺键成功交联;在聚合物c、d中波数在1350-1310 cm—1处具有硼氧键吸收峰，进一步证明了PAA- PBA与PPGP成功合成;并且由于PPGP上硼氧键受聚合物影响，导致其发生轻微的红移;
3、分别取PAA纳米球和PPGP(纳米球加入至PBS(pH=7.4)缓冲溶液中，配制浓度为Img/mL，混匀。样品置于25°C恒温箱中，分别于O h~72 h取样测粒径大小变化。结果如图3所示，PPGP纳米球的粒径从90 nm增大到367 nm，而PAA纳米球则从132 nm增大到1365nm，可知PAA纳米球在水中溶胀明显，而PPGP纳米球相对稳定，说明通过硼酸酯键的交联，能够提高这类纳米球的稳定性；
4、取2 ml I mg/ml实施例1制得的PPGP纳米球加入至4 ml I mg/ml的DOX(阿霉素)充分混合，室温避光搅拌12 h，离心，水洗两次收集上清液。用荧光分光光度计(Ex=488 nm)，记录波长在500 nm至800 nm间的发射光谱最大吸收值，并根据阿霉素标准曲线计算出每克PPGP纳米球可负载742.1 mg的盐酸阿霉素。考察负载了阿霉素的PPGP纳米球和PAA纳米球在pH=7.4 PBS缓冲溶液中的预泄漏效果，具体的实验步骤如下:将I mg吸附药物后的PPGP纳米球和PAA纳米球分别分散于3 ml PBS (pH=7.4，10 mM)溶液中，放入透析袋后将透析袋加入47 ml PBS溶液中透析48 h，每隔O h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h取3ml溶液测荧光，原溶液再补入3 ml PBS，测试的结果如图4所示。两条曲线分别代表PAA-DOX纳米球和PPGP-DOX纳米球;从图4中可以看出在pH=7.4条件下PAA-DOX所释放出的DOX荧光强度最高，PPGP-DOX在48 h内的预泄露率为24.18%，而PAA-DOX的预泄露率为98.7%。说明PPGP纳米球在水中的稳定性更高，有利于药物的缓慢释放；
5、用HeLa细胞作为目标细胞评价PPGP纳米球的生物相亲性:取已消化成单分散的HeLa细胞悬浊液用培养液稀释，以lOOyL/孔的密度接种到96孔板，每孔的细胞个数控制约为15个。将96孔板置于37 °C，5% CO2的培养箱中培养24 h后，移去培养液，加入含有不同浓度的PPGP纳米球培养液，每组设置4个重复孔。继续培养4h后，移去培养液，用PBS缓冲液(pH=7.4)清洗两次，加入10yL培养液继续培养20 h后，每孔分别加入1yL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培育4 h，小心移去培养液，加入150yL DMS0，37°C培养25 min，震荡均匀后，在酶标仪上测490 nm处的吸收值，计算细胞存活率，评价PPGP纳米球生物相亲性。图5显示PPGP纳米球浓度在5?100yg/ml区间，细胞存活率均在90%以上，说明PPGP纳米球生物具有优异的生物相亲性，适于当药物载体；
6、取已消化成单分散的HeLa细胞悬浊液用培养液稀释，以lOOyL/孔的密度接种到96孔板，每孔的细胞个数控制约为15个，每组设置4个复孔作为重复组。将96孔板置于37 V，5%CO2的培养箱中培养24 h后，移去孔中培养液，分别加入含有I ,Control 2，PPGP_Gd3+(6.7 μg/ml) 3，卩？6卩-6(13+-00父(6.748/1111，00父浓度为548/1111) 4，Free D0X(5yg/ml)，其中3组中DOX的浓度为5yg/ml，加入细胞培养液，继续培养4 h，移去培养液，用PBS缓冲液清洗两次，加入10yL培养液继续培养20 h后，每孔分别加入1yL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培育4 h，小心移去培养液，加入150yL DMS0，37 °C培养20 min，振荡均匀后，在酶标仪上测490 nm处的吸收值，计算细胞存活率，评价各组治疗效果。从图6可以看出PPGP-Gd3+-DOX对癌细胞在
24h内抑制率达到63.68 %，说明该载药体系能有效地用于肿瘤的治疗；
7、PPGP-Gd3+纳米聚合物胶束溶液的体外核磁共振成像:
(1)先取Iml 0.5mg/mL PPGP-Gd3+纳米聚合物胶束加入透析袋中，放入49 ml 2wt%硝酸进行解离24 h，使其完全解离，再取一定量按需要稀释测ICP-MS，根据ICP-MS测试结果计算出I mL PPGP-Gd3+纳米聚合物胶束溶液中含有Gd3+为0.942 mM；
(2)取0.212mL PPGP-Gd3+制备液，分别加入到Iml ρΗ=7.4、ρΗ=5.0、ρΗ=5.0+10 mM葡萄糖的PBS溶液中(相当于所含Gd3+浓度为0.2 mM),浸泡24h，离心后，取一定量上清液配成5个不同浓度，取出I mL去测MRI。从图7可以看出:在pH=5.0和pH=5.0+10 mM葡萄糖条件下，随着解离出来钆离子的浓度增加，成像的亮度也逐渐变亮;而在pH=7.4条件下，成像的亮度基本没有变化，说明在PH=7.4缓冲液中PPGP-Gd3+纳米球比较稳定，钆离子解离的量较少。由图7可知:在pH=5.0和pH=5.0+10 mM葡萄糖条件下的r 1=14.93 mM—1.S—1 和r 1=34.34 mM—1.S—1均大于pH=7.4条件下的rl=2.54 mM—1.S—1，这说明在酸性以及葡萄糖存在条件下，PPGP-Gd3+纳米球发生解构，释放出较多的Gd3+，即造影剂增多，进而MRI成像效果增强。
[0022]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球，其特征在于:其是由3-氨基苯硼酸修饰聚丙烯酸钠分子制得PAA-PBA;再由葡萄糖胺改性聚丙烯酸钠获得PAA-Glu，然后将PAA-PBA和PAA-Glu通过硼酸酯键进行交联与自组装，而制得的PAA-PBA-GIu-PAA纳米球。2.—种制备如权利要求1所述的具有P H和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的方法，其特征在于:包括如下步骤: a)PAA-PBA聚合物材料的合成: 将一定量的EDC和NHS加入至3-氨基苯硼酸溶液中，然后加入聚丙烯酸钠，在室温条件下反应并对所得产物进行透析、冷冻干燥后，获得PAA-PBA聚合物材料； b)PAA-Glu聚合物材料的合成: 将一定量的EDC和NHS加入至葡萄糖胺溶液中，加入聚丙烯酸钠，在室温条件下反应并对所得产物进行透析、冷冻干燥后，获得PAA-Glu聚合物材料； c)PAA-PBA-Glu-PAA纳米球的组装: 将步骤a)制得的PAA-PBA聚合物材料分散于pH=8.0的PBS缓冲液中，加入步骤b)制得的PAA-Glu聚合物材料，室温搅拌12 h，通过硼酸酯键的构建获得PAA-PBA-Glu-PAA聚合物溶液;再往聚合物溶液中逐滴加入一定体积的异丙醇使聚合物分子自组装，然后经甲醇离心、洗涤处理，获得PAA-PBA-Glu-PAA纳米球。3.根据权利要求2所述的制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的方法，其特征在于:步骤a)中聚丙烯酸钠与3-氨基苯硼酸的反应摩尔比是7:1?2:1;步骤b)中聚丙烯酸钠与葡萄糖胺的反应摩尔比是7:1?2:1。4.根据权利要求2所述的制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的方法，其特征在于:步骤c)中PAA-Glu聚合物材料与PAA-PBA聚合物材料的质量比是1:1;步骤c)中在PAA-Glu-PBA-PAA的自组装反应体系中水和异丙醇体积比是1:20。5.根据权利要求2所述的制备具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的方法，其特征在于:步骤c)制备的PAA-PBA-GIu-PAA纳米球的平均直径为100±10 nm;表面带负电。6.—种如权利要求2-5任一项所述的方法制得的具有pH和葡萄糖双重刺激响应性的纳米球的应用，其特征在于:作为核磁成像剂Gd3+和抗癌药物的载体。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的抗癌药物为阿霉素；阿霉素与纳米球复合后，在PH彡6、葡萄糖浓度为I?10 mM的条件下释放阿霉素。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:PAA-PBA-Glu-PAA纳米球和核磁成像剂Gd3+复合时的摩尔比为1:0.25?1:2，所制得的PAA-PBA-Glu-PAA-Gd3+纳米聚合物球的平均直径为100±10 nm、表面带正电。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:PAA-PBA-Glu-PAA纳米球和核磁成像剂Gd3+复合时的摩尔比为1:1.5。
【文档编号】A61K49/18GK105963277SQ201610512393
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】朱春玲, 曾胚羡, 谢增鸿, 林旭聪
【申请人】福州大学