分离的编码popdc1突变体的核酸及其应用

分离的编码popdc1突变体的核酸及其应用
【专利摘要】本发明公开了POPDC1基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码POPDC1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统，用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法。其中，该分离的编码POPDC1突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。
【专利说明】
分离的编码P0PDC1突变体的核酸及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及分离的编码P0PDC1突变体的核酸及其应 用，更具体地，涉及分离的编码P0PDC1突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患肢带型肌营养 不良症的生物样品的系统、用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒、构建 体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。
【背景技术】
[0002] 肢带型肌营养不良症（imb-girdle muscular dystrophy，LGMD)，是临床上以肩胛 带和骨盆带肌不同程度无力或萎缩为主要特点的一组疾病，是进行性肌营养不良症中除杜 氏和贝克型营养不良症（DMD/BMD)外最常见的类型。
[0003] LGMD的发病年龄可以差别很大，从幼儿到50岁均有发病，男女均可患病。首发症 状常为骨盆带及肩胛带肌肉萎缩，腰椎前凸，运动困难；膝腱反射比踝反射早消失；抬臂困 难，出现翼状肩胛：头面颈部肌肉一般不受累，有时可伴腓肠肌假性肥大；病情进展缓慢， 平均于发病后20年左右丧失行动能力；肌电图和肌肉活检均显示肌原性损害，肌酸激酶 CK、乳酸脱氢酶LDH等血清肌酶常显著增高，但通常低于DMD型的水平，心电图正常。正是 由于LGMD的表征十分多变，且有的表征与其他肌肉疾病类似，LGMD的发病率很难统计。普 遍认为，LGMD的发病率大致在1/14500和1/123000之间。
[0004] 在1995年由欧洲神经肌肉病中心工作组根据遗传方式将LGMD分为1型（常染 色体显性遗传）和2型（常染色体隐性遗传），之后由根据不同的基因缺陷分出许多亚型。 截止至2012年，已知的共有25个亚型，其中1型有8个亚型（1A-1H)，2型有17个亚型 (2A-2Q)。LGMD是一组遗传模式和临床症状具高度异质性的常染色体连锁遗传性肌营养不 良，已知涉及到的基因至少有50个。这些位点有些也与心脏有关，包括肌聚糖蛋白、小窝蛋 白3、核纤层蛋白A/C和几种肌节蛋白。
[0005] 由此，肢带型肌营养不良症的早期诊断有待于进一步研究。

【发明内容】

[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种有效筛选肢带型肌营养不良症的生物样品的方法。
[0007] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0008] P0PDC1蛋白功能复杂多样，能与许多其他蛋白相互作用，如双孔钾离子通道蛋白 TREK-1、小窝蛋白3等。P0PDC1在骨骼肌、平滑肌和心肌中皆为高表达；在心脏传导系统的 心肌细胞中，其表达量尤为突出。发明人认为从蛋白功能角度考虑，基因P0PDC1很可能与 肢带型肌营养不良症有关
[0009] 发明人利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针 对每个外显子进行深度测序。并在目标区域测序找到了 P0PDC1基因c. 602C>T突变和 c. 515G>A突变，这两个突变位点分别引起相应多肽的p. S201F突变和p. R172H突变，上述突 变均与肢带型肌营养不良症有关。
[0010] 因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码P0PDC1突变体的核 酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0:1相比，具有c. 602C>T突变、c. 515G>A 突变、c. 385C>T突变和c. 427A>G突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表 示突变。c. 602C>T表示cDNA第602位核苷酸由C变成T ;c. 515G>A表示cDNA第515位核 苷酸由G变成A ;c. 385C>T表示cDNA第385位核苷酸由C变成T ;c. 427A>G表示cDNA第 427位核苷酸由A变成G。发明人惊奇的发现，该突变体与肢带型肌营养不良症的发病密切 相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患 肢带型肌营养不良症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了 P0PDC1基因的 致病突变图谱，更深入阐明了肢带型肌营养不良症的分子发病机制，为肢带型肌营养不良 症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。
[0011] 根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例， 与SEQ ID N0:4相比，所述分离的多肽具有p. S201F突变、p. R172H突变、p. R129W突变和 P.R143G突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。p. S201F表示 蛋白质水平第201位密码子由丝氨酸变成苯丙氨酸；P.R172H表示蛋白质水平第154位密 码子由精氨酸变成组氨酸；P. R129W表示蛋白质水平第129位密码子由精氨酸变成色氨酸； р. R143G表示蛋白质水平第143位密码子由精氨酸变成甘氨酸。具体地，致病基因P0PDC1 上c. 602C>T突变，引起多肽p. S201F突变；c. 515G>A突变，导致p. R172H突变；c. 385C>T突 变，引起p. R129W突变；以及c. 427A>G突变，导致p. R143G突变。通过检测生物样品中是否 表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。
[0012] 根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患肢带型肌营养不良症的生 物样品的系统。该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的 核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所 述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与 所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQ ID N0 :1相比，是否具有 с. 602C>T突变和c. 515G>A突变之一，判断所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。发 明人惊奇地发现，利用该系统可以对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更 准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。
[0013] 根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患肢带型肌营养不良症 的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测P0PDC1基因突变体 的试剂，其中与SEQ ID N0 :1相比，所述P0PDC1基因突变体具有c. 602C>T突变和c. 515G>A 突变的至少之一。由此，利用该试剂盒，可以对P0PDC1基因突变体进行高精度的检测，从而 对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良 症的生物样品。
[0014] 根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前述的分离的编码P0PDC1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细 胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0015] 根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利 用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0016] 根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些 实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0017] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0018] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0019] 图1显示了根据本发明实施例的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系 统及其组成部分的示意图，其中，
[0020] 图1A为根据本发明实施例的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统的 示意图，
[0021] 图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0022] 图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0023] 图2显示了根据本发明实施例的4个家系的家系图；
[0024] 图3显示了根据本发明实施例的P0PDC1的突变体与心肌蛋白功能的关系，其中
[0025] 图3A为根据本发明实施例的利用蛋白印迹法定量检测cAMP结合亲和力的结果示 意图；
[0026] 图3B为根据本发明实施例的293A细胞转染YFP-TREK-1与Popdcl-CFP(WT)或 S201F-CFP(201F)，采用异丙肾上腺素治疗后FRET信号的相对变化示意图；
[0027] 图3C为根据本发明实施例的TREK-1单独或共表达P0PDC1-WT的后，TREK-1/ Popdcl比分别为5 :1和1 :5的比例时，相对电流振幅示意图；
[0028] 图3D为根据本发明实施例的爪蟾卵母细胞中单独注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分别与 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物 48h 后的电压 关系不意图；
[0029] 图3E为根据本发明实施例的爪蟾卵母细胞中单独注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分别与 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物 48h 后的相对 电流示意图；
[0030] 图3F为根据本发明实施例的卵母细胞在磷酸二酯酶抑制剂茶碱 (phosphodiesterase inhibitor theophylline)中培养 48h，TREK-1 电流振幅分析在 OmV 的条件下，在与P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表达条件下，各卵母细胞的 相对电流示意图；
[0031] 图3G为根据本发明实施例的转染到Cos-7细胞后的突变及P0PDC1-WT正常蛋白 分布的焚光显微图片，
[0032] 图4显示了根据本发明实施例的P0PDC1基因的结构图及预测的二级结构和三级 结构的示意图，
[0033] 其中，
[0034] 图4A为根据本发明实施例的Popeye结构域蛋白的基本结构示意图；
[0035] 图4B为根据本发明实施例的预测的P0PDC1蛋白的Popeye结构域二级结构示意 图；
[0036] 图4C为根据本发明实施例的Popeye结构域的多序列比对的结构示意图；
[0037] 图4D为根据本发明实施例的Popeye结构域接线图；
[0038] 图4E为根据本发明实施例的Popeye结构域结构模型示意图。
【具体实施方式】
[0039] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0040] P0PDC1 突变体
[0041] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码P0PDC1突变体的核酸。根 据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0 :1相比，具有c. 602C>T突变、c. 515G>A突变、 c. 385C>T突变和c. 427A>G突变的至少之一。
[0042] 在本文中所使用的表达方式"编码P0PDC1突变体的核酸"，是指与编码P0PDC1突 变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与P0PDC1突 变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、 RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。
[0043] 对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实 际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数 情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0: 1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之 亦然。
[0044] 本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被 公开。例如提及P0PDC1基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。
[0045] 该编码P0PDC1突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候 选基因突变验证的方法确定的肢带型肌营养不良症的致病基因P0PDC1的新的致病突变。 该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式"目 标区域捕获测序"是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再 利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标 区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本 发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的 公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。
[0046] 其中，野生型的P0PDC1的cDNA的序列如下所示：

[0048] 本发明的发生c. 602C>T突变的P0PDC1突变体的cDNA序列如下所示，突变位点加 框示出：
[0050] 发生c. 515G>A变异的P0PDC1的cDNA序列如下，其中突变碱基加框示出：

TCAGCTGCCTTGA(SEQ ID N0:5,1083nt)
[0057] 发明人惊奇的发现，该突变体与肢带型肌营养不良症的发病密切相关，从而通过 检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不 良症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了 P0PDC1基因的致病突变图谱， 并且更深入地阐明了肢带型肌营养不良症的分子发病机制，为肢带型肌营养不良症的早期 致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。
[0058] 根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例， 与SEQ ID N0:4相比，所述分离的多肽具有p. S201F突变、p. R172H突变、p. R129W突变和 p. R143G突变的至少之一。具体地，致病基因P0PDC1上c. 602C>T三碱基缺失，引起多肽 р. S201F突变，而c. 515G>A突变，导致p. R172H突变，c. 385C>T突变，导致p. R129W突变， с. 427A>G突变，导致p. R143G突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测 生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。
[0059] 根据本发明的一些具体示例，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。其中，野生 型的P0PDC1的cDNA编码的多肽的氨基酸序列如下：
个氨基酸）[0061] 发生c. 602C>T突变的P0PDC1突变体的氨基酸序列如下： r ) )
个氨基酸）
[0063] 发生c. 515G>A突变的P0PDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示 出：
N0:16, 360个氨基酸）
[0065] 发生c. 385C>T突变的P0PDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示 出：

360个氨基酸）
[0067] 发生c. 427A>G突变的P0PDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示
[0068] 通过比对发现，与SEQ ID N0:1相比，发生c. 602C>T突变的P0PDC1突变体的cDNA 具有c. 602C>T突变，进而，其编码产物与野生型的P0PDC1多肽的氨基酸序列相比，具有 p. S201F突变，即Ser突变为Phe;与SEQ ID N0:1相比，发生c. 515G>A突变的P0PDC1突 变体的cDNA具有c. 515G>A突变，进而，其编码产物与野生型的P0PDC1多肽的氨基酸序列 相比，具有p. R172H突变，即Arg突变为His;与SEQ ID N0:1相比，发生c. 385C>T突变的 P0PDC1突变体的cDNA具有c. 385C>T突变，进而，其编码产物与野生型的P0PDC1多肽的氨 基酸序列相比，具有P. R129W突变，即Arg突变为Trp;与SEQ ID N0:1相比，发生c. 427A>G 突变的P0PDC1突变体的cDNA具有c. 427A>G突变，进而，其编码产物与野生型的P0PDC1多 肽的氨基酸序列相比，具有P. R143G突变，即Arg突变为Gly。综上，上述两种突变均可引起 肢带型肌营养不良症。
[0069] 此外，需要说明的是，本发明的检测突变P0PDC1基因或蛋白的方法也可以用于非 诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性，用于家 族演化研究。本发明可以对肢带型肌营养不良症的发病机理提供重要线索，对肢带型肌营 养不良症的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。
[0070] 需要指出的是，有些个体携带本发明所述的P0PDC1基因突变体中p. S201F突变， 但不患肢带型肌营养不良症，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的 检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结 果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携 带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。
[0071] 筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统和试剂盒
[0072] 根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患肢带型肌营养不良症的生物 样品的系统。参照图1A，该系统包括：
[0073] 核酸提取装置100,所述核酸提取装置100用于提取所述生物样品中的核酸样本。 根据本发明的一些具体示例，所述核酸提取装置1〇〇进一步包括：RNA提取单元101，所述 RNA提取单元101用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元102,所述逆转录单元 102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样 本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
[0074] 核酸序列确定装置200,所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相 连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据发明的具体示 例，所述核酸序列确定装置进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针 对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元202,所述测序单元202与所述文库 构建单元201相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。其中，所述文库 构建单元201进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有P0PDC1基因外显子 特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。根据本发明的实施 例，所述特异性引物至少包括以下引物对之一：第一引物对，具有SEQ ID N0 :7和8所示的 核苷酸序列，用于扩增c. 602C>T突变位点；第二引物对，具有SEQ ID N0 :9和10所示的核 苷酸序列，用于扩增c. 515G>A突变位点，第三引物对，具有SEQ ID N0 :11和12所示的核苷 酸序列，用于扩增c. 385C>T突变位点，第四引物对，具有SEQ ID N0 :13和14所示的核苷酸 序列，用于扩增c. 427A>G突变位点。根据本发明的一些具体示例，所述测序单元包括选自 HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种。
[0075] 判断装置300,所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于将 所述核酸的序列与SEQ ID N0:1相比，是否具有C.602OT突变和c. 515G>A突变之一，判断 所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。
[0076] 其中，需要说明的是，本发明中所使用的表达方式"易患肢带型肌营养不良症的生 物样品"，即包含患有肢带型肌营养不良症的生物样品，也包括肢带型肌营养不良症突变基 因携带者的生物样品。
[0077] 发明人惊奇地发现，利用该系统可以对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检 测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。
[0078] 根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于筛选易患肢带型肌营养不良症 的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测P0PDC1基因突变 体的试剂，其中与SEQ ID N0:1相比，所述P0PDC1基因突变体具有具有C.602OT突变和 c. 515G>A突变的至少之一。
[0079] 在发明中，所使用的术语"适于检测P0PDC1基因突变体的试剂"应做广义理解，即 可以是检测P0PDC1编码基因的试剂，也可以是检测P0PDC1突变体多肽的试剂，例如可以采 用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为核酸探针或引物。由 此，能够特异性的检测P0PDC1基因。优选地，所述核酸探针或者引物包括以下至少之一：第 一核酸探针或者引物对，具有SEQ ID N0 :7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c. 602C>T突 变位点；第二核酸探针或者引物对，具有SEQ ID N0 :9和10所示的核苷酸序列，用于扩增 c. 515G>A突变位点，第三核酸探针或者引物对，具有SEQ ID N0 :11和12所示的核苷酸序 列，用于扩增c. 385C>T突变位点，第四核酸探针或者引物对，具有SEQ ID N0 :13和14所示 的核苷酸序列，用于扩增c. 427A>G突变位点。由此，对P0PDC1基因检测的特异性好，准确 性尚。
[0080] 由此，利用该试剂盒，可以对P0PDC1基因突变体进行高精度的检测，从而对肢带 型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生 物样品。
[0081] 构建体和重组细胞
[0082] 根据本发明的第五方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建 体包含前述的分离的编码P0PDC1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞 获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0083] 在本发明中所使用的术语"构建体"是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序 列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构 建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片 段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线 性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本 发明中所使用的术语"核酸"可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构 建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于 操作。
[0084] 根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞，根据本发明的实施例，所 述重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例， 利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0085] 构建药物筛选模型的方法
[0086] 根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施 例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模 型，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。
[0087] 其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动 物的至少一部分细胞表达前述的多肽即可。例如，采用分子生物学技术，对受体细胞产生 精确的目标基因定点突变，获得患有肢带型肌营养不良症的动物，该动物可以作为模型用 于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑 技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码P0PDC1突变体的基因，进而构建 P0PDC1突变体基因的重组载体，将该重组载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源 的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重 组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而P0PDC1突变体基因在细胞中得以表达。再 将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动 物，嵌合体动物和纯化体动物均可用于药物筛选模型，从而有效地筛选治疗肢带型肌营养 不良症的药物。
[0088] 本发明至少具有以下有益效果：
[0089] (1)本发明发现了 LGMD相关基因的4个新的突变位点，对该基因位点的检测可以 用于LGMD患者的辅助诊断，并且可进一步应用于LGMD患者的分子诊断。因此，本发明的检 测突变P0PDC1基因或蛋白的方法可以可用于早期筛查肢带型肌营养不良症致病突变携带 者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊 断率高等优点。
[0090] (2)本发明可以对LGMD的发病机理提供重要线索，对LGMD的诊断治疗具有十分重 要的意义。
[0091] (3)本发明发现的P0PDC1基因可以作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基 因突变或家族演化。
[0092] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明 性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0093] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或 仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公 司。
[0094] 实施例1
[0095] 确定肢带型肌营养不良症突变基因的方法，具体如下：
[0096] 1、样本采集
[0097] 本实施例收集了不同地区的4个家系的样本，每个家系中均有肢带型肌营养不良 症患者。其中，家系中的患者信息如下：
[0098] -号家系，家系图如图2A所示，该家系是意大利南部卡拉布里亚地区的一个家 系，该家系表现为伪显性遗传，该家庭源于一个有大概3000人口的阿尔巴尼亚飞地的小镇 上。祖父为患者，他有2个表型正常的兄弟和7姐妹；其中一个的姐妹的两个外孙有类似的 症状，其父母双方均认定并非近亲结婚。其中，患者的具体情况如下
[0099] I 1患者，祖父患有类似Emery-Dreifuss肌营养不良症的肢带型肌营养不良症， 同时伴有房室传导阻滞，现年80岁。他40岁时，开始出现一些下肢带虚弱；60岁时，丧失 独立行走的能力，检测发现血液肌酸激酶（CK)浓度升高（750-1300IU/L)，左三角肌活检发 现有肌肉萎缩症病变，如直径变化、中央核增加，纤维极少坏死更新；用免疫组化法检测肌 营养不良蛋白、肌糖、伊默菌素、分区蛋白、小窝蛋白3,结果显示为正常；69岁时，开始出现 经常性昏厥，并发现有第二度房室传导阻滞；70岁时，检测发现CK浓度在600U/L，安装了 心脏起搏器，超声心动图结果排除了患有心肌症的可能；72岁时，肌力测试显示：颈部屈肌 MRC评分为5,腰大肌MRC评分右侧为3. 5、左侧为4,四头肌MRC评分为2,臀肌MRC评分为 1，腓肠肌MRC评分为5,足背屈肌MRC评分为5。
[0100] III 2患者，患有轻度心肌症，并伴有严重房室传导阻滞，12岁时安装了心脏起搏 器，无肌肉病变征兆，但CK浓度在3000UI/L。在12岁时出现昏厥以及颂面创伤，当时经过 长时间运动后CK浓度达7643IU/L，休息时为3183IU/L ;住院治疗期间，心电图记录到了二 度房室传导阻滞（Mobitz 1)的初次发作和经常性发作。平视式倾斜测试显示窦性心动过 缓和交界性逸搏性心律，无昏厥或昏厥发生前症状。超声波心动图结果正常，排除了心肌病 的可能。心内心电图记录到了正常的HV间期（30s)，在心房起搏周小于600ms时，结下AV 传导阻滞提前。从那以后，Pt2植入了 VVI心内膜起搏器。肌肉活检结果正常，最近一次肌 力测试是在19岁的时候，排除骨骼肌的参与。目前，这名患者正在接受定期检查，没有再发 生昏厥或其他症状了。
[0101] III 1患者，患有轻度心肌症，并伴有严重房室传导阻滞，17岁时安装了心脏起搏 器，无肌肉病变征兆，但CK浓度在3000UI/L。在17岁时出现昏厥，CK浓度上升到1216IU/ L。当时的心电图显示在希式束下部有二度房室传导阻滞，心室内传导无异常；超声心动图 结果正常。肌力测试正常，最近一次肌力测试是在25岁，结果正常。
[0102] 二号家系，家系图如图2B所示，起源于德国，患者II 2参与该研究时有80岁，二战 后期作为难民进入德国鲁尔区，未表现出明显的肌肉或神经系统疾病的迹象。
[0103] 三号家系，家系图如图2C所示，来自中国，患者II 1父母表型正常，妊娠及分娩过 程均正常。在约1岁时该患者表现出进食及呼吸困难，几天后患者出现长期晕厥，心电图和 超声心动图显示心房扑动伴有完全的房室传导阻滞及严重的左心室扩张，随后展开抗充血 性药物治疗及植入心外膜双腔起搏器。进一步检查排除代谢性疾病。一个月后患者出院， 随访期间，左心功能不全得到改善，心脏节律由起搏器及药物控制。患者现在5岁，为表现 出肌肉疾病症状。
[0104] 四号家系，家系图如图2D所述，来自意大利，患者II 2,68岁，30岁时表现出步态困 难及小腿肥大，57岁时患者表现出不行及上楼梯困难。住院后诊断显示双上肢及下肢腰带 的近端肌肉无力，肌肉活检显示核集中及典型的营养不良现象。患者血清肌酸激酶正常，肌 电图呈弥漫性疾病模式，感觉诱发电位正常。问及家族史时，患者提到其母亲（70岁时由于 心脏节律紊乱死亡）曾有心脏病发生史。
[0105] 样本来源如下：
[0107] 上述患者均具有LGMD特征。由于目前LGMD的发病机理和遗传方式尚不清楚，发 明人利用 NimbleGen 序列捕获技术（SeqCap EZ library)结合 HiSeq2000(Illumina, San Diego, CA)高通量测序技术，以一号家庭为例，对一号家系中的患者III 1和III 2及其父母 II 5、II 6 (两个患病的兄弟和他们的表型正常的父母）进行了全外显子测序。
[0108] 2、样品制备
[0109] 采集的上述家系患者及正常人的样本（2个患者样本，即III 1和III 2,以及2个正常 样本，即II 5和II 6)的外周血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，研究中所有患者 及正常人均与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同意书。 利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及 纯度，所得的每个样本基因组DNA的0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200ng/ y 1，总量不少于30 y g。所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。
[0110] 3、芯片设计、文库构建和高通量测序
[0111] 用 NimbleGen 44M kit (SeqCap EZ Human Exome Library v2. 0)结合 IIlumina HiSeq 2000高通量测序技术对上述5个患者及两个正常人的外显子组序列进行了测序，具 体如下：
[0112] 1)利用捕获芯片NimbleGen 44M kit (SeqCap EZ Human Exome Library v2. 0)对 基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。
[0113] 2)将基因组DNA随机打断成100-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上 接头，制备测序文库（参见http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库 说明书）。
[0114] 3)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与custom capture array进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序测序平台为 IlluminaHiseq 2000,读取长度为90bp，双端测序。
[0115] 3、变异检测、注释及与数据库比较
[0116] 1)测序后获得的原始数据由Illumina base calling Software 1. 7进行处 理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用S0APaligner/S0AP2(可参见： Li R，Li Y，Kristiansen K，et al，SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008, 24(5):713-714 ；Li R, Yu C, Li Y, et al.,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.， 通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组Hgl9(snpl32)，以便获得比对到基 因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009, 19(6) :1124-1132.，通过参照将其全文并入本文）确定靶区域的基因型D
[0117] 2)对于检出的SNP和indel变异，本实施例中采用BWA(version 0? 7. 5)(可参 见 Li H，Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-ffhee1er transform. Bioinformatics2010;26 (5): 589-595)和 GATK(version2.8_l)(可参见 DePristo MA，Banks E，Poplin R，et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat Genet 2011 ;43:491_8.， 通过参照将其全文并入本文）确定indel的类型。
[0118] 同时，关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三 类最有可能与疾病相关的突变。将检出的变异和dbSNP135数据库、千人基因组数据库和 HapMap数据库，YH数据库等公共数据库）等公共数据库和CAG数据库进行了比较，保留了 低频的变异（MAF < 0. 005)。
[0119] 3)在一号家系中，该疾病为隐性遗传模式，且双亲来自同一个非常小的城镇，可能 存在类似近亲结婚的情况，故优先考虑纯和突变位点。去掉同义突变，将剩下的非同义/剪 接位点突变和微小插入缺失进行优先选择：最后剩下4个SNPs和1个Indel位点为可能 的致病突变。然而，经过 SIFT (http://sift.bii. a-star. edu. sg)、Pmut (http://mmb. pcb. ub. es/PMut)和 Polyphen2 (http://genetics, bwh. harvard. edu/pph2)软件进行突变位点 危害性预测后发现，仅一个纯和错义突变P0PDC1基因c. 602C>T，p. S201F被预测为有害突 变。
[0120] 在二、三、四号家系中，发明人利用上述方法，又分别在三个家系的三个患者中 发现了该基因上的另外三个杂合突变位点（c. 515G>A，p. R172H ;c. 385C>T，p. R129W ; c. 427A>G，p. R143G)。
[0121] 综上所述，发明人认为本实施例中的P0PDC1基因的突变位点，极可能是LGMD (肢 带型肌营养不良症）的致病变异位点。
[0122] 实施例2
[0123] 由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，本实施例利用Sanger测序方法，对实 施例1中的4个家系中发现的P0PDC1基因的突变位点进行验证，具体方法如下：
[0124] 利用实施例1中4个家系，采用Sanger法对肢带型肌营养不良症致病突变位点进 行验证，包括针对P0PDC1基因3号和4号外显子及其周围的序列设计引物，通过PCR扩增、 产物纯化、测序的方法获得P0PDC1基因有关序列，并根据序列测定结果属于突变型还是野 生型，验证P0PDC1与患者临床表型之间的相关性。具体步骤如下：
[0125] 1、DNA 提取
[0126] 采集的一号家系两个患者兄弟及其父母和祖父、二号家庭的患者II 2、三号家庭的 患者II 1以及四号家庭的患者II 2的外周静脉血，另采集无亲缘关系的107个患有肌营养 不良症和/或心脏疾病患者的外周静脉血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，参与 本研究的患者均与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同 意书。利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的 浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于 200ng/ y 1，总量不少于6 y g。
[0127] 2、引物设计及PCR反应
[0128] 参考人类基因组序列数据库GRCh37/hgl9设计P0PDC1基因外显子特异性引物，具 体见下。
[0129] a)引物序列：
[0130]
[0131] b)反应体系：25yL
[0132] 模板 DNA lOOng Tris-HCl (pH8.4,20mM) lj.il 1<(：丨溶液（5〇1池1) 0.5 ul MgCh溶液（l.5mM) 1.25ul dNTP (0.2mM) 0.5 pi Taq fe (invhrogc'rt) ：5U 上游引物（100 ng/pL ) 0.4pL K游'j|物（lOOng/jiL) 0.4uL
[0133] dH20 加至 25 u L
[0134] c)反应条件：
[0135] 94°C，5 分钟，一个循环；94°C，45 秒；60°C，45 秒；72°C，45 秒，35 个循环；72°C，5 分钟，一个循环。
[0136] 由此，获得患者和家系内正常人的PCR扩增产物。
[0137] 3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABI Prism 3130XL进行DNA测序。
[0138] Sanger测序的结果验证了 S201F的SNP突变位点确定了其以杂合的形式存在于1 号家系的两个表型正常的父母中，且以纯和的形式存在于1号家系的两个患者兄弟和其祖 父体内。二、三、四号三个家系的三个患者中三个突变位点（c. 515G>A，p.R172H;c. 385C>T， р. R129W ;c. 427A>G，p. R143G)均为杂合突变，并且突变所在的区域为保守区域。
[0139] 发明人认为P0PDC1蛋白与心脏病变相关，并进行以下实验进行验证，对实验结果 进行P检验，其ns表示无显著差异，*代表p〈0. 05, **代表p〈0. 01，#*代表p〈0. 001。利用 蛋白印迹法定量检测cAMP结合亲和力，结果如图3A所示，变异S201F表现出cAMP结合亲和 力显著降低；采用293A细胞转染YFP-TREK-1与Popdcl-CFP(WT)或S201F-CFP(201F)，并检 测采用异丙肾上腺素治疗后FRET信号的相对变化，结果如图3B所示，同样观察到了 S201F 突变体cAMP敏感性的降低。利用TREK-1单独或共表达的P0PDC1-WT，以TREK-1/Popdcl 比分别为5 :1和1 :5的检测相对电流振幅，结果如图3C所示，结果显示TREK-1外向电流 升高:仅相对于TREK-lp〈0. 001);在爪蟾卵母细胞中被单独注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分别与 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物后，48h 的电压 关系如图3D所示，由图中可看出突变S201F以及R127H引起的TREK-1外向电流升高比野生 型与R143G、R129W突变一起的TREK-1外向电流升高要显著，相对的电流振幅如图3E所示 (*:p〈0. 05, ***:p〈0. 001);当爪蟾卵母细胞在磷酸二酯酶抑制剂茶碱（phosphodiesterase inhibitor theophylline)中培养48h后，在TREK-1电流振幅在OmV的条件下，分别在与 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表达后，检测共表达细胞的相对电位，结果如 图3F所示，电位出现显著降低；转染到Cos-7细胞后的突变及P0PDC1-WT正常蛋白的分布 情况如图3G所示，结果显示突变蛋白与野生型无明显差别。上述结果表明，P0PDC1基因与 心脏病变相关，进而可能导致肢带型肌营养不良症，由此，P0PDC1基因可能是LGMD的致病 基因。P0PDC1蛋白的Popeye结构域蛋白的基本结构如图4A所示，发明人对突变蛋白的结 构进行预测，P0PDC1蛋白的Popeye结构域二级结构如图4B所示，图4(：所示为Popeye结构 域的多序列比对，显示R172和S201位点的高保守性；图4D所示为Popeye结构域接线图， 显示R172和S201位点所在位置；图4E所示为Popeye结构域结构模型示意图。通过对突 变蛋白的上述结构模型的研究，发明人发现突变P. S201F、p. R172H、p. R129W和p. R143G均 能影响保守的Popeye结构域的功能。Popeye结构域类似于一个cAMP结合结构域，并且与 核苷酸结合后能引起构象变化，因此Popeye结构域可能是引发蛋白相互作用的一个功能 结构域。在Popeye结构域的3D模型中，S201位于朝向cAMP分子的那部分核苷酸结合区 域；而R172则在紧接着Popeye结构域，很接近cAMP结合口袋；R129和R143则位于Popeye 结构域的N末端。通过cAMP亲和沉淀，发明人发现，突变体蛋白对cAMP的亲和力下降。可 见突变体很可能通过影响Popeye结构域的cAMP亲和能力，改变了 P0PDC1蛋白的功能，从 而引发疾病。
[0140] 因此，综上所述，发明人认为本发明找到的P0PDC1基因的4个突变位点，即 с. 602C>T、c. 515G>A、c. 385C>T和c. 427A>G位点，极可能是LGMD (肢带型肌营养不良症） 的致病变异位点。
[0141] 实施例3
[0142] 对实施例1中检测到二号、三号和四号家庭的突变基因检测结果进行基因相互作 用分析，具体分析内容如下：
[0143] 在对在二号家系的分析中，发明人利用临床外显子分析检测到LMNA基因的错义 突变（c. 1070A>C，p.D357A)以杂合的形式出现在患者II 2及其患病的姐妹和一个健康的儿 子身上，而LMNA突变以及其另一个亚型在相似的案例中被发现与DCM(扩张型心肌病）相 关。
[0144] 在三号家系中，发明人利用临床外显子分析检测到4个杂合的错义突变在以下四 个基因中 ：30拟〇?465〇)，05?(11216￥)，&11(111^(633394〇311(13359391')，共分离分析显示 这些突变遗传自母亲I 2.在来自意大利的四号家系中，根据Polyphen软件预测SDHA的突 变为有害突变，根据双基因遗传模型，预测P0PDC1/SDHA双杂合在全部人口中出现的频率 为0. 0016,而在亚洲人中出现频率上升为0. 076.但基因型的频率没有达到对于单基因病 人群中基因型频率小于1/2000的要求，因此两个基因之间相互作用出现频率可能需要进 一步更大量散发人群中的研究支撑。
[0145] 在四号家系中，临床外显子测序的结果显示，四个杂合突变：位于MYH6上的Indel 突变（c. 5476_5477delinsAA)、TTN上的两个错义突变（D25814Y，V3925L)和一个缺失突变 (c. 44427_44429delGGT)都在患者中发现并且有极高的致病性，共分离分析的结果显示， TTN上的错义突变在其他家系成员中没有出现，而MYH6的缺失突变以杂合的形式出现在了 患者的一个健康儿子III 2身上而另一个III 1没有。另外，已有MYH6 (c. 5476_5477delinsAA) 对扩张型心肌病的致病性报道。因此，综上所述发现在该家系中只有当P0PDC1和MYH6两 个基因的突变同时存在并发生双基因遗传时，心脏的病例表型才会出现。
[0146] 因此，该分析进一步证明了 P0PDC1基因的四个突变位点，即c. 602C>T、c. 515G>A、 c. 385C>T突变和c. 427A>G位点突变，是LGMD (肢带型肌营养不良症）的致病变异位点。
[0147] 实施例4
[0148] 制备一检测试剂盒，其包含能够检测P0PDC1基因的c. 602C>T、c. 515G>A、 c. 385C>T突变和c. 427A>G突变的引物，用于筛选肢带型肌营养不良症的生物样品，其中这 些引物为P0PDC1基因外显子特异性引物，本实施例中采用实施例2的P0PDC1基因外显子 4和3的引物对。
[0149] 利用上述试剂盒筛选肢带型肌营养不良症的生物样品的具体步骤为：按照实施例 2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述P0PDC1基因的外显 子特异性引物进行PCR反应，PCR反应的反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领 域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是 否具有 c. 602C>T、c. 515G>A、c. 385C>T突变和c. 427A>G突变之一，能够有效地检测本发明 的P0PDC1基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患肢带 型肌营养不良症，进一步，能够从待测者中筛选出肢带型肌营养不良症的生物样品。
[0150] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0151] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种分离的编码P0PDC1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO :1相比， 具有c. 602OT突变、c. 515G>A突变、c. 385C>T突变和c. 427A>G突变的至少之一， 任选地，所述核酸为DNA。2. -种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO :4相比，所述分离的多肽具有p. S201F 突变、p. R172H突变、p. R129W突变和p. R143G突变的至少之一， 任选地，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。3. -种筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核 酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列 与 SEQ ID N0:1 相比，是否具有 c.602C>T 突变、c.515G>A 突变、c.385C>T 突变和 c.427A>G 之一，判断所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。4. 根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；以及 逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转 录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。5. 根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括： 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，通过对所述文库进行测序，以便确 定所述核酸的序列。6. 根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括： PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有P0PDC1基因外显子特异性引物，以便利用所 述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物至少包括以下引物对之一： 第一引物对，具有SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c. 602OT突变位点； 第二引物对，具有SEQ ID NO :9和10所示的核苷酸序列，用于扩增c. 515G>A突变位 点， 第三引物对，具有SEQ ID NO :11和12所示的核苷酸序列，用于扩增c. 385C>T突变位 点， 第四引物对，具有SEQ ID NO :13和14所示的核苷酸序列，用于扩增c. 427A>G突变位 点， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一 种。7. -种用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有： 适于检测P0PDC1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0:1相比，所述P0PDC1基因突变 体具有c. 602OT突变、c. 515G>A突变、c. 3850T突变和c. 427A>G突变的至少之一， 任选地，所述试剂为核酸探针或者引物， 任选地，所述核酸探针或者引物包括以下至少之一： 第一核酸探针或者引物对，具有SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列，用于扩增 c. 602OT突变位点； 第二核酸探针或者引物对，具有SEQ ID NO :9和10所示的核苷酸序列，用于扩增 c. 515G>A突变位点， 第三核酸探针或者引物对，具有SEQ ID NO :11和12所示的核苷酸序列，用于扩增 c. 3850T突变位点， 第四核酸探针或者引物对，具有SEQ ID N0:13和14所示的核苷酸序列，用于扩增 c.427A>G突变位点。8. -种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码P0PDC1突变体的核酸。9. 一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过表达权利要求8所述的构建体转 化受体细胞而获得的。10. -种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括： 使动物的至少一部分细胞表达权利要求1所述的核酸， 任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。
【文档编号】C12N5/10GK105821047SQ201510013324
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】张建国, 亚历山大·费利利, 方明艳, 蒋慧, 徐讯, 王俊
【申请人】深圳华大基因股份有限公司