一种识别胶质瘤干细胞(gsc)的核酸适体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种识别胶质瘤干细胞(GSC)的核酸适体及其制备方法。涉及一种核酸，提供具有高特异性和高亲和力的GSC的核酸适体及其制备方法与应用。所述GSC的核酸适体具有茎环结构，制备方法包括：设计并合成单链DNA随机寡核苷酸库，筛选目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶细胞结合的特异性和亲和力。筛选获得的核酸适体分子量小，渗透性好，无毒性，经济，易于合成与标记，能特异性识别GSC，而对其他细胞系不具有识别功能。
【专利说明】
一种识别胶质瘤干细胞(GSC)的核酸适体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种核酸，特别涉及GSC的核酸适体制备方法及其在肿瘤靶向治疗中 的应用。
【背景技术】
[0002] 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见而又最难治疗的恶性肿瘤，即使运用现代显 微神经外科技术、放疗、化疗等综合治疗措施后，高度恶性的多形性胶质母细胞瘤患者3年 以上的生存率仅为2.2%，无疑给社会、家庭和患者带来了沉重的精神和经济负担。1997年， Bonnet和Dick(l.Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.[J].Nat Med, 1997,3:730-737)从白血病肿瘤细胞中分离出少量细胞，它们是众多肿瘤细胞中惟一具有 致瘤性的细胞，且能分化为其他肿瘤细胞，具有干细胞特征，从而证实了肿瘤干细胞的存 在。2004年Singh等（2?Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,et al.Identification of human brain tumour initiating cells. [J]Nature,2004,432:396-401).从胶质瘤中分离出具 有干细胞样特征的细胞，证明了胶质瘤干细胞(G1 ioma Stem Ce 11 s，GSC)的存在。现有的胶 质瘤治疗方法，包括显微神经外科手术、放射治疗、化学治疗以及免疫和基因治疗，这些方 法往往只针对肿瘤实体中的已分化细胞，而忽视了肿瘤祖细胞和GSC，而这些占少量的GSC 很可能负责肿瘤的起源和生长、侵袭和复发。最新研究表明，GSC的存在是当前胶质瘤治疗 疗效不高、复发性高的一大可能原因之一（3.Cho WC.Updates in cancer research: insights from the AACRIOOth Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn,2009,9: 411-416.)〇
[0003] TSC是肿瘤中具有自我更新能力并能多向分化的肿瘤细胞(3.Cho WC.Updates in cancer research:insights from the AACR 100th Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn, 2009,9:411-416.)。许多研究证实了TSC在胶质瘤的发生、发展、耐药、复发等过程中 起着关键作用。根据TSC理论，肿瘤起源于肿瘤组织中的一小部分具有增殖和转移浸润能力 的TSC，而肿瘤组织中其余大部分的肿瘤细胞并无转移能力。TSC不仅具有干细胞的自我更 新和分化潜能的特性，这些细胞的另一特点就是耐药性。TSC细胞膜上多数表达ABC transporter家族膜蛋白，这类蛋白大多可运输并外排包括代谢产物、药物、毒性物质、内源 性脂类物质、多肽、核苷酸及固醇类等多种物质，使许多对肿瘤非干细胞具有抑制或杀伤作 用的化疗药物却对TSC杀伤作用明显减弱。TSC的耐药性直接影响了肿瘤化疗的成败。目前 肿瘤的常规治疗，如放疗、化疗，可以杀死大部分肿瘤细胞，但是对存在于肿瘤中的数量稀 少的干细胞样细胞群却作用甚微。治疗后残存TSC的增殖，足以促使肿瘤复发和转移。因此 在治疗时，应该针对TSC，从源头上根治肿瘤的发生。
[0004] 当前GSC研究的一个技术难题是如何获得特异性标记物以用于GSC的分离纯化。目 前人们主要是利用GSC特异性抗体来识别GSC，并通过细胞分选技术来分离GSC。现阶段GSC 的标志物主要借助广谱的干细胞标志物(如⑶133 )、黏附分子(如⑶15、CD34、神经细胞黏附 分子11)、神经干细胞标志物(如0)15、42135、11681：；[11、]\11183811；[1)、胚胎干细胞相关标志物(如 SOX家族蛋白、Nanog)等。CD133在人造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、血管内皮祖细 胞、大肠癌、前列腺癌、肝癌中均有表达，它是一种广谱的干细胞标志物(4.Prestegarden L,Svendsen A,ffang J，et al.Glioma cell populations grouped by different cell type markers drive brain tumor growth. [J]Cancer Res，2010,70:4274_4279) D因此， CD133作为GSC标志物的特异性受到了质疑。CD15抗原也称阶段特异性胚胎表面抗原-1，是 一种细胞黏附分子;CD34属于钙黏蛋白家族，在多种干(祖)细胞中表达。2010年Patru等 (5.Patru C,Romao L,Varlet P,et al.CD133,CD15/SSEA-1,CD34or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.[J].BMC Cancer,2010,10:66.)M 47例长期传代的胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤细胞系进行研究发现，各细胞系中存在不同亚 群，其中部分细胞具有干细胞样特征，表达⑶133、⑶15、CD34等，但是⑶133、⑶15、⑶34的表 达情况以及Hoechst着色能力与致瘤性、化疗抵抗均无明显相关，且CD34与CD133几乎不同 时表达，可见上述标志物并非特异性的GSC标志物。A2B5是胶质前体细胞膜表面的一种神经 节苷脂，多用于胶质瘤细胞谱系研究。2008年Ogden检测了 25例WHO分级II~IV级胶质瘤，均 表达A2B5;而且⑶133仅表达于A2B5+细胞，在A2B5-细胞则无表达。但该研究未能说明A2B5+ 细胞的分化特性，未能进一步阐述〇)133+和4285+细胞之间的关系（6.(^(1611八1'，1 &2化1 AE,Lochhead RA,et al.Identification of A2B5+CD133-tumor-initiating cells in adult human gliomas ? [J] .Neurosurgery,2008,62:505-515)。因此，A2B5作为GSC标志物 有待进一步探讨。Nestin在未分化的神经干细胞(Neural Stem Cells,NSC)和未成熟的星 形胶质细胞中表达，成熟的星形胶质细胞中消失，它是NSC的主要标志之一。虽然Nestin作 为GSC的一个重要指标被广泛应用，Nestin高表达的高级别胶质瘤预后差(7. Arai H, Ikota H,Sugawara K,et al.Nestin expression in brain tumors:its utility for pathological diagnosis and correlation with the prognosis of high-grade gliomas ? [J]Brain Tumor Pathol ? 2012,29(3): 160-167 ?)，但能否作为GSC的特异性标志 物还有待商榷。此外，国内有学者用化疗药物长春新碱作用于胶质瘤细胞来筛选TSC，但由 于化疗抵抗机制复杂，该方法得到的细胞目前只能称为"富含TSC" (8. Zhou ZH，Ping YF，Yu SC,et al.A novel approach to the identification and enrichment of cancer stem cells from a cultured human glioma cell line.Cancer Lett,2009,281:92-99) 〇因此 寻找和发现GSC特异性的标记物成为解决问题的关键所在，并将会对胶质瘤的早期诊断、治 疗和预后起着极其重要的意义。
[0005]核酸适配体是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够与靶标高特异 性和高亲和力结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间弱作 用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等，从而特异地识别靶物质甚至影 响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医学应用领域具有诸多优势，如 靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、分子量较小、良好的生物兼容性、无 毒、体外稳定性好等。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选获得，其基本原理是在 体外人工化学合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA或修饰的RNA和ssDNA，通过寡核苷酸 文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过 几轮或数十轮筛选富集过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的在于提供具有高特异性和高亲和力的GSC的核酸适体。
[0007] 其序列如下：
[0008] TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇
[0009] 该序列可以被切短或部分碱基替换，所述的切短为两端碱基分别或同时截短1-20 个碱基。在本发明的优选实施例中，其两端碱基同时截短7个碱基，其也同样具有和GSC的高 特异性和高亲和力。
[0010] 本发明的第二目的在于提供GSC的核酸适体的制备方法。
[0011] 所述GSC的核酸适体的制备方法包括以下步骤：
[0012] 1)合成单链DNA随机寡核苷酸库，人胶质母细胞瘤细胞系U87为反筛细胞，去除DNA 随机寡核苷酸库中的非特异性结合部分，以GSC为正筛细胞筛选得到与GSC特异结合的核酸 序列；
[0013] 2)将步骤1)所得与GSC特异结合的核酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链酶亲 和素微珠为基质进行分离，通过碱变性解链，过滤，纯化，即得用于次轮筛选的单链DNA文 库；
[0014] 3)将步骤2)所得的单链DNA文库进行下一轮筛选，经过20轮筛选后获得目的寡核 苷酸序列；克隆测序所述目的寡核苷酸序列，并鉴定其与GSC结合的特异性和亲和力，获得 GSC的核酸适体。
[0015]在步骤1)中，所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的 随机序列，即为5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，库容量为1015以上。
[0016] 在步骤2)中，所述PCR扩增的引物为：
[0017] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；
[0018] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'；
[0019] 所述PCR扩增产物为3 '端带有生物素标记、5 '端带有FAM标记的双链DNA文库。
[0020] 本发明的优点在于:CELL-SELEX技术与流式细胞分析法相结合的筛选方法使筛选 获得的核酸适体无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。通过SELEX方法筛选获得的 核酸适体只特异性识别GSC，对其他细胞系不具有识别功能。上述优点使得所述核酸适体成 为GSC检测的有力工具，识别GSC的核酸适配体在胶质瘤的诊断和靶向治疗中具有重要的意 义。
【附图说明】
[0021] 图1为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对GSC的富集图。在图1中， 横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，曲线A为初始DNA随机寡核苷酸库，曲线B为第8轮DNA 随机寡核苷酸库，曲线C为第14轮DNA随机寡核苷酸库，曲线D为第20轮DNA随机寡核苷酸库。
[0022]图2为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对于U87细胞的富集图。在 图2中，横坐标为焚光强度，纵坐标为细胞数，曲线A为初始DNA随机寡核苷酸库，曲线B为第8 轮DNA随机寡核苷酸库，曲线C为第14轮DNA随机寡核苷酸库，曲线D为第20轮DNA随机寡核苷 酸库。
[0023]图3为流式细胞仪测定所得核酸适体W5对GSC的解离常数。在图3中，横坐标为DNA 浓度(nmol/L)，纵坐标为平均荧光强度。
[0024] 图4为流式细胞仪测定所得核酸适体W5对GSC的荧光偏移。在图4中，横坐标为荧光 强度，纵坐标为细胞数。
[0025] 图5为流式细胞仪测定所得核酸适体W5对多种其他肿瘤细胞系的荧光偏移。在图5 中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1体外筛选与GSC特异结合的核酸适体
[0027] 1)将合成好的5nmol单链DNA核酸库溶于结合缓冲液（lxPBS，4.5g/L葡萄糖， 0.5mmol/L MgCl2,0.1g/L tRNA，lg/L BSA)中，进行热处理：95°C加热5min，在冰上放置 lOmin;所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即为 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，库容量为 1015 以上。
[0028] 2)将处理好的单链DNA核酸库与用roS洗涤后的U87细胞进行孵育，收集未与U87细 胞结合的液体；
[0029] 3)将未与U87细胞结合的液体加入GSC中于冰上孵育40min;
[0030] 4)使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的GSC，95°C加热10min，13000g离心5min，获取结合 了 GSC的寡核苷酸，然后做PCR反应；
[0031] PCR 反应程序为：94°C 预变性 3min，94°C30s，60°C30s，72°C30s，扩增 16 个循环，最 后72°C终延伸5min，
[0032] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3,；
[0033] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3,；
[0034] 5 )PCR反应结束后，产物为3 '端带有生物素标记，5 '端带有FAM标记的双链DNA，加 入链酶亲和素微珠，反应30min，然后用0.2mol/L NaOH进行单链化，经脱盐柱纯化即得到用 于下一轮筛选的单链DNA文库；
[0035] 6)之后每轮使用200pmol的单链DNA文库，并且逐步增加洗涤次数以增强筛选强 度。共进行20轮筛选，而后通过流式细胞仪检测单链DNA文库的富集情况，结果显示第20轮 库与GSC有比较明显的结合(参见图1)，而与U87细胞没有结合(参见图2)，最后把第20轮库 进行克隆测序。所得的序列为
[0036] 5'-TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC-3'。
[0037] 该序列命名为W-5。
[0038]实施例2以流式分析法检测所得单链DNA与GSC的结合能力
[0039] 首先PCR扩增带荧光标记的单链DNA，使用引物2:5'-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；引物3:5'-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，PCR产物为5'端带有FAM 并且3 '端带有生物素的双链DNA，加入链酶亲和素微珠，反应30min，然后用0.2mol/L NaOH 进行单链化，经脱盐柱纯化即得到用于流式分析的带FAM标记的单链DNA。
[0040]使用 lnmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L， 200nmol/L浓度梯度的单链DNA与GSC来测定解离常数(Kd)。用200yl结合缓冲液配置上述各 浓度的DNA溶液，95°C加热5min，冰上放置lOmin。加入到50xl0 4个GSCs，冰上孵育40min。使 用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，而后把细胞重悬在250yL结合缓冲液中。设置未经过筛选的初 始DNA随机寡核苷酸库作对照。
[0041 ] 使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行焚光测定，而后用sigma plot软件 作图，计算出所得核酸适体的解离常数(结果参见图3)。
[0042]实施例3筛选得到核酸适配体与其他各种细胞系结合情况
[0043] 1)将合成好的5nmol单链DNA溶于结合缓冲液中，进行热处理:95°C加热5min，冰上 放置l〇min。
[0044] 2)将处理好的单链DNA与500000个细胞种于24孔板24小时进行孵育，冰上孵育 40min〇
[0045] 3)孵育好后，洗涤缓冲液溶液洗3次，再将细胞刮下来溶于200iiL结合缓冲液中，使 用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定(结果参见图5)。
【主权项】
1. 识别胶质瘤干细胞的核酸适体，其特征在于，其序列如下： TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇2. 基于权利要求1所述的胶质瘤干细胞的核酸适体的切短或部分碱基替换的GSC的核 酸适体，所述的切短为两端碱基分别或同时截短1-20个碱基。3. 如权利要求1所述的识别胶质瘤干细胞的核酸适体的制备方法，其特征在于包括以 下步骤： 1) 合成单链DNA随机寡核苷酸库；以人胶质母细胞瘤细胞系U87为反筛细胞，筛选除去 DNA随机寡核苷酸库中的非特异性结合部分，以GSC为正筛细胞筛选得到与GSC特异结合的 核酸序列； 2) 将步骤1)所得与GSC特异结合的核酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链酶亲和素 微珠为基质进行分离，通过碱变性解链，过滤，纯化，即得用于次轮筛选的单链DNA文库，形 成次一级核酸库； 3) 将步骤2)所得的单链DNA文库进行下一轮筛选，经过20轮筛选后获得目的寡核苷酸 序列；克隆测序所述目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶细胞结合的特异性 和亲和力。4. 如权利要求3所述的识别胶质瘤干细胞的核酸适体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即为 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC 40nt GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，库容量为 1015 以上。5. 如权利要求3所述的识别胶质瘤干细胞(GSC)的核酸适体的制备方法，其特征在于在 步骤2)中，所述PCR扩增的引物为： 引物1:TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC; 引物2: GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC。6. 如权利要求1所述的识别胶质瘤干细胞的核酸适体的用途，在制备胶质瘤干细胞识 别试剂的应用。7. 如权利要求1所述的识别胶质瘤干细胞的核酸适体的用途，在制备胶质瘤干细胞诊 断试剂的应用。8. 如权利要求1所述的识别胶质瘤干细胞的核酸适体的用途，在制备胶质瘤干细胞治 疗药物的应用。
【文档编号】A61K48/00GK105821043SQ201610048666
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月25日
【发明人】康德智, 吴巧艺, 吴亮, 王煜喆, 杨朝勇, 朱志
【申请人】福建医科大学附属第医院, 福建医科大学附属第一医院