重组间充质干细胞及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种重组间充质干细胞及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 免疫性疾病（immune diseases)是指免疫调节失去平衡，影响机体的免疫应答而 引起的疾病。广义的免疫性疾病包括先天或后天性原因导致的免疫系统结构上或功能上的 异常。其中多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种常见的由自身免疫反应介导的中 枢神经系统炎性脱髓銷疾病。病灶多发于脑和脊髓的白质，呈多灶性炎性细胞侵润、脱髓銷 及神经元损伤，可导致感觉、运动、意识和神经认知等多方面的功能障碍。该病多发于20~ 40岁的青壮年人，复发率和致残率高，是青壮年人非外伤性神经残疾最常见的原因，迄今为 止还无法完全治愈。
[0003] 其中用间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSCs)移植治疗多发性硬化 (multiple sclerosis,MS)、炎症性肠病，类风湿性关节炎等免疫炎症性疾病，取得了显著 治疗效。间充质干细是指具有自我更新能力、并能分化为骨，软骨和脂肪细胞的一组中胚层 来源的细胞群。近年来许多学者发现MSCs不仅具有多向分化能力，而且MSCs还能很有效地 调节免疫系统的功能，正因为如此，MSCs对于自身免疫性和炎症相关的疾病具有广阔的治 疗应用前景。
[0004] 目前静脉移植干细胞是最为常用和安全方便的移植途径，但是，静脉移植间充质 干细胞后，由于MSCs归巢到疾病或炎症损伤部位的效率低下，W及即使少量的MSCs在达到 疾病部位后，其分泌的抗炎症分子的不可控性，大大地影响了 MSCs治疗免疫炎症性疾病的 效率。运也是为什么在当今已经完成或还在进行中的数百项临床试验的结果往往得出了阴 性的结果。因此，如何开发出针对于增加 MSCs归巢到疾病或炎症损伤的部位和如何提高 MSCs在疾病部位分泌抗炎症分子的能力的有效方法，将对促进MSCs在临床上的应用具有重 要的意义。
[0005] 综上所述，传统的间充质干细胞归巢到疾病或炎症损伤部位效率较低、分泌抗炎 症分子的能力较低。
【发明内容】
[0006] 基于此，有必要提供一种归巢到疾病或炎症损伤部位效率较高、分泌抗炎症分子 的能力较高的重组间充质干细胞及其制备方法和应用。
[0007] -种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞中转染了第一信使RNA、第二信使 RNA和第Ξ信使RNA;
[000引所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾 液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第Ξ信使RNA用于表达白介素-10。
[0009] -种重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 提供第一信使RNA、第二信使RNA和第Ξ信使RNA，所述第一信使RNA用于表达P选择 素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第Ξ信使 RNA用于表达白介素-10;
[0011] 提供间充质干细胞，所述间充质干细胞培养在细胞培养液中；W及
[0012] 将转染试剂、所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第Ξ信使RNA加入所述培 养所述间充质干细胞的所述细胞培养液中进行基因转染，得到所述重组间充质干细胞。
[0013] -种药物的祀向载体，所述祀向载体中包括上述任一项所述的重组间充质干细 胞。
[0014] 上述重组间充质干细胞，通过在间充质干细胞中转染用于表达P选择素糖蛋白配 体-l(P-selectin glycoprotein ligand l，PSGkl)的第一信使RNA、用于表达唾液酸化路 易斯寡糖-X抗原（Sialyl Lewis-X，SLeX)的第二信使RM和用于表达白介素-10 (Interle址in-10，IL-10)的第Ξ信使RNA，得到重组间充质干细胞。实验结果表明，该重组 间充质干细胞可表达分泌PS化-1、SLeX和IL-10，分泌抗炎症分子的能力较高。归巢促进因 子PSGkl W及化eX可显著提高重组间充质干细胞祀向归巢到疾病或炎症损伤部位的效率， 结合抗炎因子IL-10,可增加重组间充质干细胞的炎症抑制能力。
【附图说明】
[0015] 图1为一实施方式的重组间充质干细胞的制备方法的流程图；
[0016] 图2a为免疫巧光检测重组间充质干细胞的PSGkl的表达量的结果图；
[0017] 图化为免疫巧光检测重组间充质干细胞的化eX的表达量的结果图；
[0018] 图2c为Elisa检测重组间充质干细胞上清中的IL-10的表达量的结果图；
[0019] 图3为流式细胞仪检测重组间充质干细胞抑制T淋己细胞的增殖情况的结果图；
[0020] 图4a为流动腔Idyn/cm2条件下检测转染了 PS化-1和化eX的重组间充质干细胞间 对内皮细胞的粘附能力的结果图；
[0021] 图4b为流动腔Idyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附 能力的结果图；
[0022] 图4c为流动腔Idyn/cm2条件下检测化-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果 图；
[0023] 图4d为流动腔2dyn/cm2条件下检测转染了 PS化-1和化eX的重组间充质干细胞间 对内皮细胞的粘附能力的结果图；
[0024] 图4e为流动腔2dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附 能力的结果图；
[0025] 图4f为流动腔2dyn/cm2条件下检测化-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果 图；
[00%]图4g为流动腔5dyn/cm2条件下检测下转染了 PS化-1和化eX的重组间充质干细胞 间对内皮细胞的粘附能力的结果图；
[0027] 图4h为流动腔5dyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附 能力的结果图；
[0028] 图4i为流动腔5dyn/cm2条件下检测化-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果 图；
[0029] 图4j为流动腔lOdyn/cm2条件下检测转染了 PS化-1和化eX的重组间充质干细胞间 对内皮细胞的粘附能力的结果图；
[0030] 图4k为流动腔lOdyn/cm2条件下检测未转染的间充质干细胞间对内皮细胞的粘附 能力的结果图；
[0031] 图41为流动腔lOdyn/cm2条件下检测化-60细胞间对内皮细胞的粘附能力的结果 图；
[0032] 图4m为图4a~图41的统计结果图；
[0033] 图5a为巧光显微镜检测重组间充质干细胞归巢到脊髓中的细胞数量的结果图；
[0034] 图5b为巧光显微镜检测未转染的间充质干细胞归巢到脊髓中的细胞数量的结果 图；
[0035] 图5c为图5a和图化的统计结果图；
[0036] 图6为重组间充质干细胞移植的MS动物模型的临床症状评分的结果图；
[0037] 图7为免疫巧光检测重组间充质干细胞移植的EAE动物模型的炎症程度的结果图； [003引图8为Lxuol速蓝染色检测重组间充质干细胞移植的EAE动物模型的脊髓的脱髓銷 程度的结果图。
【具体实施方式】
[0039] 下面主要结合附图及具体实施例对重组间充质干细胞及其制备方法和应用做进 一步的解释说明。
[0040] -种重组间充质干细胞，该重组间充质干细胞中转染了第一信使RNA、第二信使 RM和第Ξ信使RM。第一信使RM用于表达P选择素糖蛋白配体-l(P-selectin glycoprotein ligand 1，PS化-1)，第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原 (Sialyl Lewis-X，SLeX)，第Ξ信使RNA用于表达白介素-10(Interleukin-10，比-10)。
[0041 ]信使RNA(message RNA，mRNA)携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板，易于转染 到细胞中。
[0042] 在一个实施例中，第一信使RNA的基因序列包括：（a)、SEQ ID No.l所示的核巧酸 序列；（b)、与SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列具有至少98%同源性的核巧酸序列；或（C)、 SEQ ID No.1所示的核巧酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核巧酸序 列。
[0043] 第二信使RNA的基因序列包括：（a)、SEQ ID No.2所示的核巧酸序列；（b)、与SEQ ID No.2所示的核巧酸序列具有至少98%同源性的核巧酸序列；或(c)、SEQ ID No.2所示的 核巧酸序列，其中一个或多个碱基被缺失