人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法
【专利摘要】本发明公开了人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，干细胞分泌生物活性因子与裂解液来源于脐带组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质；其包括以下步骤：（1）脐带组织处理；（2）脐带组织干细胞的体外培养、扩增；（3）生物活性因子的制备；（4）裂解液的制备。本发明的生物活性因子或物质中不含任何动物源成分，利用此生物活性因子或物质可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。
【专利说明】
人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞(stemcel I)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得，作为一类多能干细胞，它可以向成骨、软骨、肌肉、神经及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前MSCs主要来源于成人骨髓，但成人骨髓MSCs细胞数量及增殖分化潜能随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，且采集具有创伤，使其来源受限。最近，已开发出从脐带或胎盘组织提取MSCs,它也是一类具有多向分化潜能的干细胞，越来越多的研究表明其极具开发潜质，与骨髓MSCs相比具有明显的优势:(1)来源充足，取材方便，成本低廉；(2)间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的细胞来源；(3)免疫原性极低，免疫排斥的概率极低，且还具有一定的免疫抑制功能；(4)可以支持造血和促进移植功能；(5)旁分泌能力强，在增殖生长过程中会产生大量生物活性因子。
[0004]干细胞不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且干细胞内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF),肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。
[0005]因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。目前实际中利用的干细胞生物活性因子或物质大多存在以下不足:(I)直接利用胎盘等组织提取，致得到的干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质纯度低；(2)利用含有动物源成分的培养液进行干细胞培养扩增(例如，使用胎牛血清)，提取的分泌物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的特定病毒等，若应用于临床或保健美容则存在较大的安全隐患；(3)胚胎干细胞等在增殖分化过程不易控制，致瘤性大，提取此类干细胞的分泌物质中可能含有使正常干细胞恶性转化的因子，而骨髓等组织的干细胞分化程度较高，开始表达相关人白细胞抗原，直接应用可能会产生免疫排斥反应；(4)干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等有重要作用，但在增殖分化过程这类物质并不分泌到细胞外。
为解决这一问题，本发明提供人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，从人脐带组织中提取干细胞，利用无血清间充质干细胞培养基(不含动物源成分)进行体外培养、扩增，然后提取干细胞培养、扩增过程中分泌的生物活性因子和干细胞内的生物活性物质，利用这类生物活性因子或生物活性物质激活人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:
人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，干细胞分泌生物活性因子与裂解液来源于脐带组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质;其包括以下步骤:
包括以下步骤:
(1)脐带组织处理:无菌条件下取足月顺产及剖腹产手术中获得的新鲜脐带I根，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，充分冲洗后将其剪碎至约1.5mmX 1.5mmX 1.5 mm大小组织块，再多次冲洗，至组织块发白放入离心管内；
(2)脐带组织干细胞的体外培养、扩增:
①将上述剪切后的脐带组织小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为100mm)中，滴入少量体积分数10%血清DMEM培养液，让培养液均匀流散，仅湿润培养皿底部，再用镊子将收集的组织块移入培养皿中，并将组织块均匀平铺于培养皿底，添加少量培养液以保持组织块湿润，再加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)离心悬浮，将悬浮液用200目不锈钢筛网过滤后保留组织块，收集消化液，然后将消化液接种于无菌培养皿中，在二氧化碳培养箱中培养；
②每周半量换液，培养15天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；
③当细胞约80%汇合时，加入1.25g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min，以I?3XlO5 cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存，
④当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，避免组织块浮起，放入5%二氧化碳培养箱中37 °C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞从组织块游出的情况，待细胞密度达到80%后按1: 2的比例传代，收集第I代细胞，代后剩下的组织块，再加入培养液，
在二氧化碳培养箱中继续培养，每周换液I次，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；
⑤重复步骤④即可；
⑥分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度；
(3)生物活性因子的制备:将步骤(2)脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩；
超滤和浓缩的处理方法为:利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；
(4)裂解液的制备:将体外培养获得的脐带组织干细胞浓度调整为5X106?1X107个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5?7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
[0008]本发明的有益效果:第一，克服了现有技术直接从脐带等组织中提取的有效生物活性物质纯度、产量和活性不高的缺点，本发明从脐带组织提取的干细胞进行培养、扩增，收集高产量、高纯度的干细胞，利用超低温等现代技术进行提取、分离、纯化等，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性因子或物质;第二，克服了现有技术中利用含动物源成分培养基的不足，因为利用含有动物源成分的培养基进行干细胞培养、扩增(例如，使用胎牛血清)，提取的分泌物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的特定病毒等，若应用于临床或保健美容则存在较大的安全隐患；第三，本发明干细胞来源为脐带组织间充质干细胞，增殖分化能力强，易于控制，生物学性状稳定，从而保证了产品质量的稳定；第四，本发明通过对干细胞的物理性裂解破碎，提取了干细胞内的生物活性物质，因为干细胞在增殖分化过程很多生物活性物质并不分泌到细胞外，而这些物质对干细胞的增殖分化等有着重要作用。
【具体实施方式】
[0009]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0010]实施例1:脐带组织的处理
无菌条件下，取足月顺产及剖腹产手术中获得的新鲜脐带I根，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，充分冲洗后将其剪碎至约1.5_X 1.5mmX1.5 mm大小组织块，再多次冲洗，至组织块发白放入离心管内。
[0011 ]实施例2:脐带组织干细胞的体外培养、扩增
处理方法为:①将上述剪切后的脐带组织小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为100mm)中，滴入少量体积分数10%血清DMEM培养液，让培养液均匀流散，仅湿润培养皿底部，再用镊子将收集的组织块移入培养皿中，并将组织块均匀平铺于培养皿底，添加少量培养液以保持组织块湿润，再加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)离心悬浮，将悬浮液用200目不锈钢筛网过滤后保留组织块，收集消化液，然后将消化液接种于无菌培养皿中，在二氧化碳培养箱中培养； ②每周半量换液，培养15天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；
③当细胞约80%汇合时，加入1.25g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min，以I?3XlO 5 cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；
④当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，避免组织块浮起，放入5%二氧化碳培养箱中37 °C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞从组织块游出的情况，待细胞密度达到80%后按1: 2的比例传代，收集第I代细胞，代后剩下的组织块，再加入培养液，
在二氧化碳培养箱中继续培养，每周换液I次，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；
⑤重复步骤④即可；
⑥分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度。
[0012]实施例3:生物活性因子的制备
将实施例2中脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；
超滤和浓缩的处理方法为利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩。
[0013]实施例4:裂解液的制备
将实施例2中脐带干细胞培养、扩增过程中获得的脐带组织干细胞浓度调整为5 X 106?1X10 7个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5?7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
[0014]实施例5:脐带组织干细胞分泌生物活性因子和裂解液的活性验证
将干细胞生物活性因子或裂解液按15微克/毫升浓度加入到培养基中，并以此种浓度的培养基培养正常传代至第8代的脐带或胎盘间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3天收集细胞，与对照组相比，添加干细胞生物活性因子或裂解液的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。
[0015]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，其特征在于:干细胞分泌生物活性因子与裂解液来源于脐带组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质;其包括以下步骤: (1)脐带组织处理:无菌条件下取足月顺产及剖腹产手术中获得的新鲜脐带I根，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，充分冲洗后将其剪碎至约1.5mmX 1.5mmX 1.5 mm大小组织块，再多次冲洗，至组织块发白放入离心管内； (2)脐带组织干细胞的体外培养、扩增: ①将上述剪切后的脐带组织小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为10mm)中，滴入少量体积分数10%血清DMEM培养液，让培养液均匀流散，仅湿润培养皿底部，再用镊子将收集的组织块移入培养皿中，并将组织块均匀平铺于培养皿底，添加少量培养液以保持组织块湿润，再加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)离心悬浮，将悬浮液用200目不锈钢筛网过滤后保留组织块，收集消化液，然后将消化液接种于无菌培养皿中，在二氧化碳培养箱中培养； ②每周半量换液，培养15天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存； ③当细胞约80%汇合时，加入1.25g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以I?3XlO5 cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存， ④当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，避免组织块浮起，放入5%二氧化碳培养箱中37 °C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞从组织块游出的情况，待细胞密度达到80%后按1: 2的比例传代，收集第I代细胞，代后剩下的组织块，再加入培养液， 在二氧化碳培养箱中继续培养，每周换液I次，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存； ⑤重复步骤④即可； ⑥分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度； (3)生物活性因子的制备:将步骤(2)脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩； 超滤和浓缩的处理方法为:利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物； (4)裂解液的制备:将体外培养获得的脐带组织干细胞浓度调整为5X106?1X107个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5?7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
【文档编号】A61Q19/08GK106038598SQ201610376240
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】张正亮
【申请人】张正亮