专利名称：一种间充质干细胞分泌素的培养方法
技术领域：
本发明涉及间充质干细胞分泌素的培养技术。
背景技术：
现有的间充质干细胞分泌素的美容产品(如苹果干细胞)已经为大众所接受，而且学术界对于来自间充质干细胞的分泌素的潜在医疗用途正展开深入的探讨，近年已有分泌素的正面医疗效果的文献出现，如改善皮肤皱纹，心衰竭，脑退化，视力，寿命延长，等等。近年有大量文献亦指出分泌素的其它潜在医药价值，暂时研究得最深入的便是其改善心脏衰竭的功用，研究指出干细胞分泌物中所含的外吐小体(exosome)具有一定医疗用途如美国专利2011/0003008A1所揭示的。虽然间充质干细胞分泌素的市场潜力很大，但是其大量培养存在较大的困难，主要表现为人类间充质干细胞在生长时所需要较大的表面积。 现有间充质干细胞分泌素的培养主要是让间充质干细胞在培养瓶中生长数天，而后将培养液更换为不含牛血清的培养基，培养24至48小时后取其上清液便是间充质干细胞分泌素。现有技术的缺点主要表现为I、主要利用细胞培养瓶去收集分泌素，而由于间充质干细胞的依附生长之特性，大量生产分泌素所需要的细胞数目会花上非常多的培养瓶及空间，培养起来花时而且成本闻昂；2、收集分泌素时需要大量的培养液，成本非常高；3、分泌素中的蛋白质在浓缩时会大量流失，而且产品中带有高盐分及细胞培养液等杂质。
发明内容
本发明为克服上述现有技术的缺点，提供一种能大量生产，且生产成本低、产品纯度高的间充质干细胞分泌素的培养方法。本发明实现发明目的采用的技术方案是，一种间充质干细胞分泌素的培养方法，所述培养方法包括以下步骤a.在生物反应器中对间充质干细胞进行培养，得到目标数量的间充质干细胞，以磷酸盐缓冲液对生物反应器中的间充质干细胞和微载体进行清洗；b.向生物反应器中注入细胞培养基底液和磷酸盐缓冲液继续培养；c.收集生物反应器中的上清液，并将所述上清液浓缩得到蛋白质浓缩液；d.以纯水稀释所述蛋白浓缩液，置于生物反应器中，重复步骤b、c，得到的蛋白浓缩液中的蛋白即为间充质干细胞分泌素。优选地，所述步骤a之前还包括培养得到间充质干细胞，并将间充质干细胞注入到含有细胞培养液和微载体的生物反应器中，生物反应器中的间充质干细胞不少于I千万个每升。优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙龈间充质干细胞。优选地，所述细胞培养液包含MEM培养基底液、牛血清以及抗生素。优选地，所述步骤a中控制生物反应器转速为40_60rpm，温度36_38摄氏度，并提供二氧化碳气体供应的条件下对间充质干细胞进行培养。优选地，所述步骤a还包括在对间充质干细胞进行培养的过程中，于第24小时和第72小时分别向生物反应器中注入新的细胞培养液。优选地，所述步骤b中细胞培养基底液为DMEM细胞培养基底液，所述DMEM细胞培养基底液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1/5至1/2。
优选地，所述步骤c中通过以下方法进行浓缩将上清液通过切向流过滤膜的方法进行浓缩，得到蛋白浓缩液。优选地，所述步骤d还包括对所述间充质干细胞分泌素进行蛋白定量和分装的步骤，最后通过冷冻干燥将所述间充质干细胞分泌素制成粉末，低温保存。本发明的有益效果是I、本发明利用了生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素，大幅缩减成本及所需空间；例如要制作来自两亿个干细胞的分泌素，在传统的方法上需要500个T150的细胞培养瓶；而本发明只需要一个3公升的生物反应器，只相等于20个T150细胞培养瓶的体积；2、本发明的间充质干细胞兼容性高，可配合不同的间充质干细胞作为源材料而制作出不同的间充质干细胞分泌素如脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，牙髓间充质干细胞，胎盘间充质干细胞等等；3、本发明于收集间充质干细胞分泌素的过程中，通过向生物反应器中注入细胞培养基底液和磷酸盐缓冲液可以稀释生物反应器中的培养液，达到安全地持续刺激间充质干细胞细胞分泌蛋白的作用，从而能提高充质干细胞细胞分泌素的产量；4、传统的方法只针对蛋白的浓缩而没有去盐的考虑，但是培养液中残余的离子会让产品使用者的血液离子浓度在短时间内被大幅提升，影响体内器官(尤其是心脏)的健康；本发明通过纯水稀释蛋白浓缩液的步骤，使产物得到去盐纯化处理(去盐效果达95%以上)，能有效地去除分泌素中的非间充质干细胞，大幅提高产品的安全性及效果，让所生产出的分泌素能够适合各方面的应用。5、本发明所制作出的间充质干细胞分泌素冻干粉含有完整的外吐小体，是间充质干细胞分泌素的有效成份。
具体实施例方式实施例I:培养2亿个脂肪间充质干细胞分泌素首先将4百万个脂肪间充质干细胞置于含有细胞培养液的T-150培养瓶中培养，细胞培养液包含有10%的牛血清、1%的抗生素以及alpha-MEM培养基底液，培养出3千万个脂肪间充质干细胞；然后将上述脂肪间充质干细胞转移至放有3克微载体和400亳升细胞培养液的3公升生物反应器中，在转速维持于40rpm的条件下培养；于第24小时及第72小时分别向生物反应器中注入200毫升及500毫升的细胞培养液.持续细胞培养至脂肪间充质干细胞数目到达2亿个的水平(约需6天)；当脂肪间充质干细胞数目达标时利用磷酸盐缓冲液将脂肪间充质干细胞及其附着的微载体清洗三次，然后向生物反应器中注入2升磷酸盐缓冲液及I升DMEM/F12培养基底液，继续培养，于48小时后收集生物反应器中的上清液，利用0.22um的滤膜过滤上清液以移除当中残余的脂肪间充质干细胞，再使用带有滤孔为5kDa的滤膜的切向流过滤器将上清液中的蛋白浓缩及去盐，最后将浓缩液的蛋白利用冷冻干燥机制成粉末并保存于-80度，得到脂肪间充质干细胞分泌素成品。实施例2:培养2亿个牙髓间充质干细胞分泌素本实施例与实施例I的培养方法大致相同，只是利用了牙髓间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于3公升生物反应器中的生长时间可由总时间9天减少至6天，而收集牙髓间充质干细胞分泌素的时间可增加至72小时。实施例3:培养2千万个脐带间充质干细胞分泌素本实施例的培养方法与实施例I也大致相同，只是利用了脐带间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，将刚解冻的4百万个脐带间充质干细胞直接放入含有0. 8克微载体和300亳升培养液的500亳升生物反应器中培养，于72小时生物反应器更新细胞培养液，生物反应器中的生长时间可由总时间9天增长至10至12天.实施例4:培养2亿个牙龈间充质干细胞分泌素本实施例的培养方法与实施例I也大致相同，只是利用了牙龈间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，收集牙龈间充质干细胞分泌素后的微载体上的牙龈间充质干细胞可用胶原蛋白酶消化I小时以释出其中的牙龈间充质干细胞，得到的细胞可被再培养或冷冻备用。作为上述实施方式中培养方法的替代方案，还可以用透析膜代替切向流过滤器将间充质干细胞分泌素进行去盐，以及可以用食品干燥机代替冻干粉机将充质干细胞分泌素制成粉末。最后应说明的是以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。权利要求
1.一种间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤 a.在生物反应器中对间充质干细胞进行培养，得到目标数量的间充质干细胞，以磷酸盐缓冲液对生物反应器中的间充质干细胞和微载体进行清洗； b.向生物反应器中注入细胞培养基底液和磷酸盐缓冲液继续培养； c.收集生物反应器中的上清液，并将所述上清液浓缩得到蛋白质浓缩液； d.以纯水稀释所述蛋白浓缩液，置于生物反应器中，重复步骤b、c，得到的蛋白浓缩液中的蛋白即为间充质干细胞分泌素。
2.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤a之前还包括培养得到间充质干细胞，并将间充质干细胞注入到含有细胞培养液和微载体的生物反应器中，生物反应器中的间充质干细胞不少于I千万个每升。
3.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙龈间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述细胞培养液包含MEM培养基底液、牛血清以及抗生素。
5.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤a中控制生物反应器转速为40-60rpm，温度36-38摄氏度，并提供二氧化碳气体供应的条件下对间充质干细胞进行培养。
6.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤a还包括在对间充质干细胞进行培养的过程中，于第24小时和第72小时分别向生物反应器中注入新的细胞培养液。
7.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤b中细胞培养基底液为DMEM细胞培养基底液，所述DMEM细胞培养基底液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1/5至1/2。
8.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤c中通过以下方法进行浓缩将上清液通过切向流过滤膜的方法进行浓缩，得到蛋白浓缩液。
9.根据权利要求I所述的间充质干细胞分泌素的培养方法，其特征在于，所述步骤d还包括对所述间充质干细胞分泌素进行蛋白定量和分装的步骤，最后通过冷冻干燥将所述间充质干细胞分泌素制成粉末，低温保存。
全文摘要
本发明提供一种能大量生产，且生产成本低、产品纯度高的间充质干细胞分泌素的培养方法，利用了生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素,大幅缩减成本及所需空间；且使用的间充质干细胞兼容性高，能安全地持续刺激间充质干细胞细胞分泌蛋白，提高了充质干细胞细胞分泌素的产量。
文档编号C12P21/00GK102732586SQ20121021313
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者周向荣, 邓铭权, 陈詠敏 申请人:亚太干细胞科研中心有限公司