专利名称：人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达技术的制作方法
技术领域：
:本发明提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达技术，属于生物医学技术领域。
背景技术：
:干细胞是具有自我更新能力(Self-renewal)，能不断进行有丝分裂而不“衰老”的细胞，组织或器官的更新和损伤修复都要靠正常干细胞(Normal Stem Cells)分化成祖细胞(Progenitor Cells),由祖细胞进一步分化形成具有一定功能的组织或器官细胞，从而维持机体内环境稳定和正常生理功能的实现。正常干细胞在整个生命过程中都要维持相对稳定的数量，所以干细胞必须要能自我更新，既要产生形态和生物学功能和自己完全相同的子代细胞，又要产生能进一步分化的子代细胞。组织或器官的衰老，以及癌症的发生都与干细胞的自我更新密切相关。目前体外干细胞培养技术多以成纤维细胞为饲养层细胞，将干细胞铺在饲养层细胞上并添加成纤维细胞生长因子2(FGF2)来培养，可见FGF2对于干细胞维持自我更新的重要性，而干细胞和癌症的发生发展有着密切的关系，寻找能够调节内源性FGF-2在干细胞作用的因子必然对癌症病发机理的认识，以及癌症治疗都富有意义。人干细胞自我更新支持因子hSDNSF最初从神经干细胞中分离得到，发现其在低剂量下可以代替FGF2维持干细胞不分化。因此，研究hSDNSF维持 干细胞自我更新和在肿瘤发生发展中的具体作用机制，可以为癌症的治疗提供参考。通过体外重组蛋白表达技术，可在成本较低的情况下积攒足量hSDNSF用于后续科研工作
发明内容
:本发明的目的在于提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达技术。本发明以原核表达常用质粒pET32a +为载体，将带有甲酸切割位点的hSDNSF目的基因克隆到载体上，热激法转入原核表达菌株大肠杆菌BL21 (DE3)中，挑取阳性克隆用于大量表达融合了 hSDNSF的重组蛋白，后经甲酸切割，SDS-PAGE及质谱验证分子量，确认得到了 hSDNSF纯品；利用流式细胞仪检测出表达的蛋白具有干细胞自我更新支持的功能，获得有活性的hSDNSF。本发明的技术方案包括人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达，流式细胞仪检测hSDNSF对干细胞的自我更新支持作用以确定成功表达出有活性的hSDNSF两部分内容。人干细胞自我更新支持因子hSDNSF在2003年以维持神经干细胞干性的身份首次出现在世人的眼中，其前体由146个氨基酸组成，其中1-26位氨基酸(斜体部分)为信号肽部分，该前体全序列一级结构为:
MTMRSLLRTPFLCGLLWAFCAPGARAEEPAASFSQPGSMGLDKNTVHDQEHIMEHLEGVI 60NKPEAEMSPQELQLHYFKMHDYDGNNLLDGLELSTAITHVHKEEGSEQAPLMSEDELINI 120IDGVLRDDDKNNDGYIDYAEFAKSLQ-146hSDNSF⑶S序列5’端至3’端序列如下，其中第79-438位核苷酸编码成熟的hSDNSF 蛋白:atgaccatgagatccctgctcagaacccccttcctgtgtggcctgctctgggccttttgt 60gccccaggcgccagggctgaggagcctgcagccagcttctcccaacccggcagcatgggc 120ctggataagaacacagtgcacgaccaagagcatatcatggagcatctagaaggtgtcatc 180aacaaaccagaggcggagatgtcgccacaagaattgcagctccattacttcaaaatgcat 240gattatgatggcaataatttgcttgatggcttagaactctccacagccatcactcatgtc 300cataaggaggaagggagtgaacaggcaccactaatgagtgaagatgaactgattaacata 360atagatggtgttttgagagatgatgacaagaacaatgatggatacattgactatgctgaa 420tttgcaaaatcactgcagtag441·体外重组表达的hSDNSF理论分子量为13492.7Da。通过Matrix-Assisted LaserDesorption 1nizationTime-Of-Flight mass spectrometry (MALD1-TOF-MS)技术石角定其分子量134502.03Da，二者基本吻合。用流式细胞仪检测rhSDNSF对人胚胎干细胞自我更新的作用确定表达出了有活性的重组蛋白。研究结果表明:体外重组表达技术能够获得有活性的hSDNSF，为其后续在干细胞自我更新及肿瘤发生发展中的作用的研究提供了必要的样品来源。
:图1.A图1中1，2泳道为目的基因KpnI和HindIII双酶切产物，3，4泳道为PET32a基因双酶切产物。图1I为HSDNSF转化入重组质粒后S_tag和T7引物扩增验证。图1.B HSDNSF重组质粒经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳图，I泳道为诱导前菌液，2泳道为诱导后菌液，3泳道为菌体超声破碎后上清，4泳道为经过Resin亲和柱纯化后的上清，箭头处为诱导出的融合蛋白。图2.AhSDNSF S印hadexG-50 层析结果(3 ml/管/10 min)，洗脱峰监测 215/280nm吸收值，箭头标注的峰为目的蛋白峰。图2.BhSDNSF RP-HPLC分离纯化结果，在乙腈梯度达到51%左右时，洗下14000 Da左右的蛋白质分子，箭头所指即为目标蛋白峰。图1.B中还附有RP-HPLC目标峰SDS-PAGE电泳图，图中Marker旁泳道为箭头目标峰。图3.A流式细胞仪检测hSDNSF对人胚胎干细胞自我更新支持作用。A图为无FGF2，B 图为添加 10ng/ml FGF2，C 图为添加 10ng/ml rhSDNSF。图 3.B rhSDNSF 分子量质谱图。
具体实施方式
:实施例一:人干细胞自我更新支持因子hSDNSF的体外重组表达A重组质粒pET-hSDNSF的构建第一步:hSDNSF基因的合成待表达基因加上表达所需的各个位点以后送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并将合同基因克隆到载体PUC57上，插入位点为KpnI/Hindlll，受体菌为大肠杆菌DH5 α菌株，并在基因的两端分别加入酶切保护碱基ATA和AGC以保证正常酶切和切割效率。合成的序列如下，其中GGTACC为KpnI酶切位点，AAGCTT为HindIII酶切位点，GACCCG为甲酸切割位点:ATAGGTACCGACCCGGAGCCTGCAGCCAGCTTCTCCCAACCCGGCAGCATGGGCCTGGATAAGAACACAGTGCACGACCAAGAGCATATCATGGAGCATCTAGAAGGTGTCATCAACAAACCAGAGGCGGAGATGTCGCCACAAGAATTGCAGCTCCATTACTTCAAAATGCATGATTATGATGGCAATAATTTGCTTGATGGCTTAGAACTCTCCACAGCCATCACTCATGTCCATAAGGAGGAAGGGAGTGAACAGGCACCACTAATGAGTGAAGATGAACTGATTAACATAATAGATGGTGTTTTGAGAGATGATGACAAGAACAATGATGGATACATTGACTATGCTGAATTTGCAAAATCACTGCAGTAAAAGCTTAGC第二步:质粒DNA的制备接种pET32a+质粒的大肠杆菌载体菌株(美国Novagen公司)于5ml含氨节的LB培养基中，37°C摇床中培养过夜，使用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，具体步骤如下:I) 5mlpET32a+过夜培养物，12000rpm，离心I分钟，完全弃去上清，菌体收集至一管中。2)柱平衡:吸附柱放入收集管中，加500μ I平衡液，12000rpm离心I分钟，弃去
收集管中的液体。3)先菌体中加入250 μ I溶液I (2_8°C保存)，悬浮菌体。加入250 μ I溶液2，颠倒混匀6-8次，此时，管中应是清亮的液体。否则为裂解不充分，应减少菌体量。再向管中加350μ I溶液3，颠倒混匀6-8次，管中出现白色沉淀，12000rpm离心10分钟。吸取上清至吸附柱中，勿吸取白色沉淀。4) 12000rpm离心I分钟，弃去收集管内的液体。5)向吸附柱中加入500 μ I去蛋白液，12000rpm离心I分钟，弃去收集管内的液体。6)加600 μ I漂洗液，12000rpm离心30秒钟，弃废液。再加入600 μ I漂洗液，12000rpm离心30秒钟，弃废液。12000rpm离心2分钟。7)吸附柱放入一干净离心管中，开盖晾干。8)洗脱液需预先在65_70°C水浴锅中预热。向吸附柱中央加入50 μ I洗脱液。室温下放置2分钟。12000rpm离心2分钟，收集离心管中的液体，即为所提质粒，_20°C保存。第三步:PET32a+质粒和目的基因的双酶切及连接37°C同时双酶切(KpnI和HindIII，Fermantas)pET32a+质粒和带上酶切位点和甲酸识别位点的目的基 因，双酶切总体系体系为20 μ I,酶切程序和具体操作参照Fermantas双酶切工作手册。I %琼脂糖核酸凝胶电泳后，切取目的条带，如图1.A所示。利用凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生物科技有限公司)回收双酶切产物，重溶于PCR水，置-20°C保
存备用。将回收到的双酶切产物线性pET32a+质粒和目的基因在T4 DNA Ligase (Takara)作用下连接，16 °C连接过夜。B.重组质粒的转化
将连接产物转化至用CaCl2-MgCl2法制备的大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，取适量转化产物涂布至含100 μ g/ml氨苄青霉素(以下简写为Amp)的LB培养基平板上，经37°C培养16小时，用PCR检测，将阳性克隆送生物公司进行测序并确认包含有hSDNSF基因序列，且含有接头和甲酸切割位点序列。C.目的基因的诱导表达37°C, 100 μ g/ml Amp液体LB培养基(Iml)中培养用AnSF重组质粒12小时以上，当OD600达到0.6时，转入2 L 100 μ g/ml Amp液体LB培养基，37°C培养3小时，OD600达到0.6，加入IPTG至终浓度0.6mM，28°C低转速(120 rpm)诱导2.5小时。诱导产物冰浴30分钟，于40C 8000 Xg离心5分钟，用50 mM ρΗ8.0的Tris-HCl，洗涤沉淀3次，每次洗涤结束都于4°C 8000 X g，离心5分钟，收集沉淀，置-20°C保存备用。取少许诱导沉淀物，用2 X Loading Buffer裂解，沸水煮5分钟，进行12%SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白是否诱导表达成功。结果如图1.B所示，在35KDa左右有一条明显的诱导蛋白条带。D.分离纯化重组表达的hSDNSF第一步:含hSDNSF的His-Tag融合蛋白分离将收集到的诱导沉淀物重悬于Binding Buffer中(50 ml/1 L发酵产物)，超声充分裂解诱导产物(超3 sec，停3 sec，共10min)，4°C 12000 X g离心20分钟，取上清，经0.45 μ m滤膜过滤，上样于用Bin ding Buffer平衡好His-Bind Resin (Merck)亲和柱层析(亲和层析的程序具体参照Merck提供的His-Bind Resin说明书)，除去其他杂蛋白后，洗脱收集His-Tag融合蛋白。第二步:甲酸化学切割释放hSDNSF将上一步收集到的HiS-Tag融合蛋白按照50%甲酸的比例，50°C，切割24小时，切割完后低压冻干化学切割产物，置-20°C保存备用。第三步:hSDNSF分离纯化Sephadex G-50 凝胶过滤层析，将冻干粉溶解于 ρΗ6.0,0.1M 的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(以下简写为PBS)，12000Xg离心10 min，取上清上样于已用溶解冻干粉的pH 6.0PBS平衡好的Sephadex G-50 ( Pharmacia)凝胶过滤柱(1000 mmX 26 mm)，用同样缓冲液洗脱，自动部分收集器进行收集，流速为3.0 ml/管/10 min，于280 nm和215 nm紫外检测收集液中蛋白的浓度，洗脱结束后跑12 %的SDS-PAGE电泳，将含有目的条带大小的分子筛的峰收集起来，冻干备用。反相高压液相层析(RP-HPLC)，将Sephadex G-50凝胶过滤所得到的含有目的条带大小的冻干峰溶于双蒸水中，4°C, 12000 Xg离心IOmin,取上清液,经0.22 μ m滤膜过滤，收集滤液于Waters 600 Controller (Waters,美国)液相色谱仪上分析，采用反相C8柱(Waters C8, 30X0.46 cm)，以双蒸水(含0.1 %三氟乙酸):乙腈(含0.1 %三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，280/215 nm紫外检测蛋白浓度，流速0.7 ml/min。收集所得到的各个组分，低压冻干取部分溶解于双蒸水后跑12 %的SDS-PAGE电泳，确认与hSDNSF理论分子量大小基本吻合，为14000Da，对应峰用MALD1-T0F再次确定其精确分子量(AXIMA CFR光谱仪，Kratos Analytical)为13502.03Da，如图3.B所示，故推断该洗脱峰为 rhSDNSFο
实施例二:流式细胞仪检测hSDNSF对干细胞的支持作用A.人胚胎干细胞的常规培养:第一步:饲养层细胞(mouseembryonic fibroblasts, MEF)的做法取怀孕13.5天的ICR小鼠胚胎，将胎鼠的头、四肢、尾巴和内脏去掉，剩余组织用5mg/ml的IV型胶原酶(Gibco)消化为单细胞(37°C ；30分钟)，接种于0.1%明胶(Amresco)包被的培养皿上，培养基为DMEM (Gibco)加10%胎牛血(Hyclone)，I X非必须氨基酸(non-essential amino acid; Gibco), 2Mmol/L L-谷氨酸胺(sigma),0.1πιΜβ-巯基乙醇(sigma)和青链霉素(sigma)，培养于37°C，5%C02培养箱(HEPA)中。等原代细胞生长至融合后，按1:3进行传代，传代24小时后进行冻存，冻存液为常规培养基加10% DMSO (sigma)，细胞冻存于液氮中。第二步:接种胚胎干细胞前饲养层的准备解冻饲养层细胞，生长至融合状态时用lOPg/ml丝裂霉素C (sigma)处理3个小时，按4 X IOVcm2接种于明胶包被的培养皿中。第三步:接种胚胎干细胞人胚胎干细胞接种于准备好的饲养层细胞上，培养基为Knockout DMEM (Gibco)加20%血清替代品(Gibco)，IX非必须氨基酸，2μΜ L-谷氨酰胺，0.1 πιΜβ-巯基乙醇，10ng/mlFGF2 (Millipore)和100U/ml青链霉素,每天更换新鲜培养基。第四步:胚胎干细胞传代用lmg/mllV型胶原酶消化后收集集落，反复吹打至较小团块后再接种于新的饲养层细胞上继续培养，或进行相关的分化或更新等实验。B.hSDNSF对人胚胎干细胞自我更新的维持第一步:设计实验组合设定三个组合，分别是:没有FGF2、10ng/ml FGF2、10ng/ml hSDNSF，在上述培养条件下进行胚胎干细胞培养，每天换液。四天后收集细胞样品进行流式细胞仪分析0ct4(Santa Cruz)阳性率分析。第二步:流式细胞仪分析集落的消化方式与传代时相同，消化获得的集落用干细胞培养基重悬，在明胶包被的培养皿上贴壁半小时以除净多余的饲养层细胞，收集集落进行离心，细胞培养用磷酸缓冲液PBS清洗三次，再用0.05%胰蛋白酶(Gibco)消化为单细胞，4%多聚甲醛(sigma)固定10分钟，离心后用5%PBS洗一遍，0.2%Triton X-100孵育10分钟以增加抗体对细胞膜的通透性，离心后再洗一遍。分为两份，转入小管，一份作为对照，另一份作为样品。加一抗，0ct4 (Santa Cruz )按1:100稀释于1%牛血清白蛋白(sigma)中，37°C孵育30分钟；染完一抗后离心，洗一遍。加二抗，鼠IgGl-FITC (1: 100稀释；Santa Cruz)，室温孵育I小时，离心洗一遍 ，用500 μ I 5%Ν-氯代丁二酰亚胺一磷酸缓冲液(NCS-PBS)重悬细胞，进行流式细胞仪(Becton Dickinson, FACS Vantage SE)分析。流式细胞仪的结果显示:hSDNSF同FGF2—样可单因子维持人胚胎干细胞的自我更新。说明成功表达出了有活性的hSDNSFο
权利要求
1.人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达技术，其特征在于该技术以原核表达常用质粒pET32a +为载体，将带有甲酸切割位点的hSDNSF目的基因克隆到载体上，热激法转入原核表达菌株大肠杆菌BL21 (DE3)中，挑取阳性克隆用于大量表达融合了hSDNSF的重组蛋白，后经甲酸切割，SDS-PAGE及质谱验证分子量，确认得到了 hSDNSF纯品；利用流式细胞仪检测出表达的蛋白具有干细胞自我更新支持的功能，从而表明体外重组表达技术能够获得为其后续研究工作 提供量的保证的有活性的hSDNSF。
全文摘要
本发明提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)体外重组表达技术，属于生物医学技术领域。本发明以原核表达常用质粒pET32a＋为载体，将带有甲酸切割位点的hSDNSF目的基因克隆到载体上，热激法转入原核表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆用于大量表达融合了hSDNSF的重组蛋白，后经甲酸切割，SDS-PAGE及质谱验证分子量，确认得到了hSDNSF纯品。利用流式细胞仪检测出表达的蛋白具有干细胞自我更新支持的功能，从而表明体外重组表达技术能够获得有活性的hSDNSF，为其后续在干细胞自我更新及肿瘤发生发展中的作用的研究提供了必要的样品来源。
文档编号C12N15/70GK103224948SQ20131012534
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者赖仞, 郝雪, 刘欢 申请人:中国科学院昆明动物研究所