人miR-23a在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞衰老领域。更具体地，人微RNA(microRNAs)miR-23a在制备细胞 生长和衰老调控剂中的应用。
【背景技术】
[0002] microRNAs (以下简称miRNAs)是一类长约20_24nt (少数小于20nt的）的单链小 分子非编码RNA，由一段具有茎环结构的、长度为70-80nt的单链RNA前体（pre-miRNA)经 剪切而生成。miRNAs通过与mRNA分子的3'非编码区域（3'_untranslated region, 3'UTR) 互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到影响或被降解。miRNA的形成始于细胞核内 由RNA聚合酶II或III转录得到片段较长的初级miRNA(pri-miRNA)，然后在核内由 dsRNA特异性核酸酶Drosha剪切为约70nt，具有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA)。 pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5的作用下，从核内运输 到胞质中，再由Dicer酶（双链RNA专一性RNA内切酶）进一步加工成为~22 nt的成 熟双链miRNA (miRNA: miRNA*双螺旋），随即双链中的一条链被整合到RNA沉默复合体 (RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称 RISC 复合物（asymmetric RISC assembly，miRISC)。当miRISC识别互补或部分互补的目标mRNA分子的3' UTR后，就会阻 止蛋白质的翻译或者降解mRNA，从而抑制基因的表达。microRNAs通过调控靶基因的表达， 参与调控许多生物学过程，如细胞周期、肿瘤发生发展、肿瘤转移和干细胞多能性等。
[0003] 端粒是真核生物染色体末端由高度重复DNA序列（TTAGGG)及其相互作用蛋白组 成的高度有序的特殊结构。它起到保护染色体末端、维持基因组稳定性及参与细胞衰老调 控等生物学过程。正常人细胞每分裂一次，由于末端复制问题，端粒长度将逐渐变短，当端 粒缩短到一定界限时，细胞无法继续分裂，进入衰老和死亡过程。端粒结合蛋白是特异结 合在端粒上的特殊蛋白，具有保护端粒，稳定端粒结构，防止端粒间融合，抑制DNA损伤发 生等功能。人类端粒蛋白复合物由6个蛋白组成，分别是TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPPl和 P0T1。在这六个蛋白中，TRF2 处于核心地位。Telomere repeat binding factor 2(TRF2) 也称TERF2, TRF2主要由TRFH结构域、C端的SANT/Myb结构域和N端碱性的GAR结构域组 成。TRF2是端粒复合物中的蛋白相互作用中心，沟通了不同的信号转导通路。TRF2能抑制 ATM介导的DNA损伤修复通路，避免端粒被细胞内检测系统误认为是DNA损伤区。TRF2维 持端粒的T-Ioop结构，防止端粒的同源重组和非同源末端结合的发生。TRF2还能与许多参 与DNA损伤监测和DNA修复蛋白相互作用，如ERCC1/XPF、Apollo、MRN。
[0004] 细胞衰老是一个复杂有序的生物学过程。体外培养的正常细胞经过有限次数分 裂，端粒逐渐缩短，DNA损伤积累，细胞形态和生理代谢活动发生改变，表现出细胞生长减 慢、β半乳糖苷酶活性升高和炎症因子分泌增多等。衰老可引起组织代谢减缓，器官机能 衰退，诱发各种衰老相关的退行性疾病，如阿尔茨海默病亨廷顿病等。此外，由于上世纪80 年代开始的计划生育的实施，人口数量得到控制，却导致现在的中国逐渐进入人口老年化 社会，将引发各种社会保障的危机。因此，研发抗衰老或延缓衰老药物，不仅对衰老相关疾 病的治疗有重要帮助，而且对解决人口老年化问题也有巨大意义。
[0005] 在细胞衰老的过程中，衰老细胞的TRF2蛋白含量比年轻细胞的要显著降低，而在 年轻细胞中下调TRF2将加速细胞衰老，提示了 TRF2的表达量对控制细胞生长和衰老的重 要作用。因此，寻找调控TRF2表达的因子，为我们研究细胞生长衰老过程和抗衰老药物的 开发具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0006] 本发明目的提供了一种新的细胞生长调控剂/衰老调控剂。
[0007] 首先，发明提供了 miR_23a或miR_23a调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂 中的应用。
[0008] 发明人首次发现，miR_23a在调控细胞生长和衰老过程中有重要作用。
[0009] 在衰老的细胞中，miR-23a的表达量显著高于年轻细胞。
[0010] 进一步的研究证明，miR-23a过表达将抑制细胞生长和加速细胞衰老。miR-23a或 miR-23a表达正向调控剂可用于制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂。
[0011] 发明同时发现，抑制miR-23a的表达，将有利于抗衰老。miR-23a抑制剂可用于制 备抗衰老制剂。miR-23a抑制剂可以是miR-23a的表达抑制剂或功能抑制剂，例如，可以是 反义寡核酸抑制剂、包含多个miRNA结合位点的捕获转录本miRNA海绵体。
[0012] 进一步地，本发明发现miR-23a可作为TRF2表达抑制剂。发明解析了 miR-23a在 调控细胞生长和衰老过程中的功能。miR-23a通过抑制TRF2的表达，进而抑制细胞生长和 加速细胞衰老。
[0013] 发明人发现，miR_23a与端粒蛋白TRF2的表达呈负相关。这样的机制不论是在年 轻还是衰老的细胞中都是成立的。
[0014] TRF2端粒蛋白及其机制在人体细胞中普遍存在。本发明的研究过程以人成纤维细 胞为代表，本领域技术人员可以合理预期，在具有TRF2端粒蛋白机制的细胞中，miR-23a将 起到类似的作用。
[0015] 人成纤维细胞是人体正常细胞的一种较为典型的代表。在人体多种组织器官中， 存在人成纤维细胞。
[0016] 本领域技术人员可以合理预期的是，miR_23a抑制剂可以起到抗衰老的作用，其作 用对象包括人体多种组织、器官，包括但不限于人体皮肤器官。
[0017] 进一步地，miR-23a可作为TRF2的3' UTR的结合制剂。研究发现，miR-23a通过 直接作用于TRF2的3' UTR，抑制TRF2的表达，进而抑制细胞生长和加速细胞衰老。
[0018] 具体地，miR_23a通过其第2-8位种子序列（seed region)与TRF2的3'UTR的第 687-693位碱基互补配对，降低TRF2的mRNA和蛋白水平，导致细胞生长速度减缓，加速细胞 衰老。
[0019] 因此，miR_23a在调控细胞生长和衰老过程中有着重要功能，可以针对其调控机制 制备有效的细胞生长和衰老调控剂或抗衰老药物。
[0020] 优选地，所述应用是miR_23a在制备以端粒蛋白TRF2为靶点的细胞生长和衰老调 控剂方面的应用。
[0021] 优选地，本发明提供了 miR_23a的正向调控剂在制备细胞生长和衰老调控剂方面 药物方面的应用。
[0022] 另外，本发明还提供了一种细胞生长和衰老调控的药物制剂，包括有效量的 miR-23a，还可进一步包括药学上可接受的辅料。
[0023] 优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。
[0024] 优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。
[0025] 优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0026] 除此，如果需要检测或预测细胞生长速度/衰老速度，可以采用miR_23a检测试 剂，检测miR-23a的表达量，以其来检测或预测细胞生长速度/衰老速度。
[0027] 本发明克服了现有miRNAs关于细胞生长和衰老的问题和技术不足，提供了人 微RNAmiR-23a在制备细胞生长和衰老调控剂上的应用。本发明发现在人成纤维细胞中 miR-23a抑制端粒蛋白TRF2表达，抑制细胞生长和促进细胞衰老。因此，根据miR-23a的这 种功能，开发应用抗衰老药物，对延缓衰老具有举足轻重的意义。
【附图说明】
[0028] 图1为内源TRF2蛋白在年轻和衰老的人成纤维细胞MRC-5和BJ中的表达情况； GAPDH作为上样内参。
[0029] 图2为内源miR_23a在年轻和衰老的人成纤维细胞MRC-5和BJ中的表达情况。
[0030] 图3为miR-23a在TRF2的3'UTR作用碱基互补示意图及荧光素酶报告系统结果； wTRF2为野生型TRF2 3' UTR，mTRF2位作用位点突变型TRF2 3' UTR。
[0031] 图4为内源TRF2在对照、TRF2敲低和miR-23a过表达的MRC-5细胞中mRNA表达 情况。
[0032] 图5为TRF2在对照、TRF2敲低、miR_23a过表达和挽救（rescue)细胞中的蛋白表 达情况；GAPDH作为上样内参。GFP为挽救（rescue)实验的对照。
[0033] 图6为对照、TRF2敲低、miR_23a过表达和挽救（rescue)细胞的生长曲线结果。
[0034] 图7为对照、TRF2敲低、miR_23a过表达和挽救（rescue)细胞的衰老相关β半乳 糖苷酶染色结果。
[0035] 图8为miR_23a的作用机制示意图。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何 形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备；未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
[0037] 本发明为了验证人微RNA(microRNAs)miR-23a对细胞生长和衰老的调控功能，具 体实验设计如下：
[0038] SI.免疫印迹实验，检测细胞内源TRF2、GAPDH和外源TRF2、GFP水平；
[0039] S2.实时荧光定量PCR实验，检测细胞TRF2和miR-23a水平；
[0040] S3.双荧光素酶报告系统实验，研究miR23a与TRF2的3' UTR相互作用情况。
[0041] S4.构建miR_23a过表达细胞和TRF2挽救（rescue)细胞系。
[0042] S4.细胞生长曲线实验，研究miR_23a对细胞生长的影响。
[0043] S5.衰老相关β半乳糖苷酶染色实验，研究miR_23a对细胞衰老的影响。
[0044] 实施例1免疫印迹实验
[0045] 1、实验材料
[0046] 试剂：本实验所用TRF2内源抗体（购于Merck公司，产品货号0P-129)，使用时用