专利名称：用蚕表达重组人的促红细胞生成素制备药物的方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物技术领域。
糖蛋白激素促红细胞生成素(EPO)是调控细细胞生产的主要激素。人体染色体组的红细胞生成素基因存在于一个5.4kb HindⅢ-BamHⅠ性内切酶切片段中，为27个氨基酸信号多肽及166个氨基酸组成的分子量约18KD的成熟蛋白质编码。此蛋白质含3个N键以及1个O键糖基化部位及二组二硫键。中红细胞生成素以单考贝存在，出现于人染色体7q11-q22区域。促红细胞生成素通过与它在红细胞原体细胞膜表面上的受体结合而诱使红细胞原体增殖及分化，这种红细胞形成单位主要是红细胞系集落形成单位(CFU-E)及爆式红系集落形成单位(BFU-E)。
在人体内，红细胞水平受到促红细胞生成素的密切调控，此激素以微小的量存在于循环中，在正常条件下约为10-30mμ/ml血清。在胎儿中，促红细胞生成素主要由肝脏生产，而出生后促红细胞生成素则转由肾脏生产。促红细胞生成素作为活性分子分泌进入循环，它激活带促红细胞生成素受体的红细胞原体，主要促使爆式红系集落形成单位及红细胞系集落形成单位的增殖与分化，使之成为成熟的红细胞一个细胞原体细胞可生产高达几千个红细胞。当肾功能遭到损坏或失去肾的情况下，红细胞生成素的生产会减少，便会出现贫血。
家蚕杆状病毒基因组为共价闭合双链DNA，分子量约为130kb，可以在多角体基因启动子下游插入外源基因，以家蚕作为生物反应器，可以高效表达外源基因，家蚕杆状病毒属真核表达系统，具有分泌信号、糖基化、磷酸化和形成与天然相似的高级结构和功能，产物的天然性好。到目前为止，尚无用从蚕中表达促红细胞生长素制备药物的报道和专利。
从人的肾细胞中获得促红细胞生成素的基因，与家蚕杆状病毒载体重组，在家蚕细胞中进行重组、获得高效表达人的促红细胞生成素的重组病毒，在家蚕幼虫蛹中高效表达，经过纯化可得纯度为95％的促红细胞生成素以及用蛹表达产物，经过初纯化，冷冻干燥制成口服药物，经动物试验证明促红细胞药效显著，具体技术操作过程如下1．人的肾细胞的mRNA的制备人的肾细胞100mg，低温下磨碎，加入GIBCOBRL公司生产Trizol RNA提取液1ml，轻轻摇动10分钟后加入500μl氯仿，在室温下放置10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入上清体积50％的异丙醇，混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，加入由常规的反转录酶及4dNTP进行反转录，37℃,1小时，获得由mRNA反转录合成的cDNA。
2．将第1步获得的cDNA，加入促红细胞生成素基因的上下游引物，5’AAGATCTGAATTCCGGAGATGGGGGTGCACG3’以及5’GGGATCCTTGCGGCTTCCCTTCTGCCAAGGAG3’进行PCR扩增，Taq酶为宝灵曼公司的高保真Taq酶，反应条件为预变性94℃,10分钟，变性温度94℃,45秒，延伸温度为72℃,90秒，复性温度45℃,60秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟。获得长度为600bp的促红细胞生成素基因片段。
3．将PCR产物经过低融点胶分离回收，加1ml饱和苯酚(pH8.0),65℃作用10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，用苯酚再抽提一次。取上清加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍无水乙醇，混合均匀，置-20℃,2小时后再用12000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心1分钟，弃上清，自然干燥，沉淀20μl TE缓冲液溶解，置于-20℃冰箱。
4．用宝灵曼公司pUC19质粒，经SmaⅠ酶切后，与上述促红细胞生成素基因连接，连接酶为GIBCO BRL公司产品，连接条件为20℃,12小时。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株(购自promega公司)，通过兰白斑培养基筛选获得重组白斑，用小批量质粒提取方法(参见“分子克隆”，1989，科学出版社)，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定，有一条约600bp的片段被克隆，证明促红细胞生成素基因已被克隆成功，所获得的重组质粒称之为pUC19 EPO。
5．将pUC19 EPO质粒，用BglⅡ和BamHⅠ酶切，切出促红细胞生成素基因片段，克隆进入pBM030载体(本实验室保存载体)的BamHⅠ位点，外源基因的BamH Ⅰ粘末端与载体的BamHⅠ连接，另外一头与载体的BamHⅠ位点连接，但连接后的位点不能再被酶切，用酶切鉴定方法确定外源基因在多角体基因启动子的直接控制之下，构建成功转移载体pBMEPO。载体大小为11kb。
6．用野生的家蚕杆状病毒BmNPV(杭州浙农大分离株)感染家蚕幼虫3天，取感染后血清，经反复冻融破碎细胞，经35000rpm离心30分钟，弃上清，用TE缓冲液悬浮，重新超离一次，沉淀即为野生的家蚕杆状病毒(BmNPV)，用蛋白酶K(100mg/ml)60℃消化1小时，经饱和苯酚(pH8.0)作用10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，再用饱和酚提取一次，加氯仿异戊醇(24∶1)作用10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清加2倍体积冷乙醇，用清洁玻棒吸附出DNA沉淀，溶于TE中，经电泳鉴定DNA质量，大小为130kb，即可用于共转染。
7．家蚕BmN细胞继代培养，培养基为GIBCO-BRL公司的TC-100，加10％胎牛血清(GIBCO-BRL公司产品)，27.5℃培养于50ml培养瓶中，当细胞生长良好密度达到2×106时，换新鲜培养基过夜，第二天去培养基并用不含血清培养基漂洗三次，加1ml无血清培养基。取野生型BmNPV DNA 1μg，重组转移载体pBMEPO DNA 2μg，加灭菌ddH2O至50μl，另取Dospor 15μl(宝灵曼公司产品)，与35μl ddH2O混合，将上述两种溶液等体积混合，静置30分钟后缓慢加入细胞瓶中的细胞上，混匀后置27℃培养4小时，取出培养基，加新鲜含血清培养基5ml培养5-7天，取上清10μl按10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7稀释，分别取2ml接种于单层BmN细胞培养皿中，混匀后静置1-2小时，吸取培基。经37℃预热的2％低融点琼脂糖与37℃预热的2×Tc-100培养基混合后，快速加入培养皿中，铺平，待低融点琼脂糖凝固后，于27.5℃中倒置培养5-7天。
8．5-7天后，取出倒置培养皿，在解剖镜下挑选空斑，并放在96孔板中培养，用宝灵曼公司的EPO-ELISA试验盒(操作方法见说明书)检测EPO活性，筛选后有活性的孔经过3-6轮筛选(方法同上)后，获得纯的重组病毒。该重组病毒被称为pBMEPO。
9．用重组病毒pBMEPO接种感染家蚕幼虫和蛹体，在家蚕中，重组的促红细胞生成素的表达量达5.16×105单位/ml，蛹中表达量达2.01×106单位/蛹。经SDS电泳鉴定结果表明表达产物约为25-27KD。
10．收集家蚕幼虫中表达后的血清，用50％硫酸铵沉淀，用分子筛过柱，确定活性峰经过超滤(10KD滤膜，密理博公司产品)浓缩经HPLC阳离子交换柱纯化，获得纯度为95％的重组促红细胞生成素，经小鼠动物实验证明，用蚕重组促红细胞生成素的生物活性与Amgen生产的EPO活性相同。
11．将感染重组病毒并高效表达促红细胞生成素的蚕蛹收集，用EPO-ELISA检测活性达2.01×106单位。经匀浆后，用纱布过滤去除粗杂质，经脉冲式超声波处理后(超声波强度30/分钟，每次处理1分钟，停1分钟，反复处理三次)，冷冻干燥成粉剂原料，将原料粉按每kg加水1L的比例溶解，经18000rpm离心1小时，取上清，再经冷冻干燥后成精原料粉，原料粉装入囊胶，制成口服型。称为BEPO胶囊。
12．BEPO胶囊经口给药BalB/c小鼠，小鼠由浙江医科院动物中心提供，4周龄，体重为每只16-18g，按每公斤给药1×106单位，连接给药1周，经血红细胞测定，证明所用囊胶具有升红细胞的功能，有效率为90％，具体操作方法按“卫生部新药研究指南”进行。
13．BEPO胶囊经口给药猕猴，按每公斤给药1×106单位，研究方法按“卫生部新药研究指南”进行，结果表明，口服胶囊具有明确升红细胞功能，并明显增加红细胞的携氧能力和运输功能。完成证明口服胶囊口服有效，创造了用蚕表达重组促红细胞生成素口服新途径。
14．用纯化的BEPO注射猕猴(每公斤1000单位)，经药效证明BEPO具有与天然EPO相似的药效和功能(操作方法见“卫生部新研究指南”)。
15．综上所述，用家蚕表达的重组促红细胞生成素制备成口服胶囊和注射液均有明确的药效。是首创。
参考文献Lee Huang S(1984)Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in Escherichia coliProc Natl Acad Sci USA 81:2708-2712Lin FK suggs S Lin CH et al(1985)Cloning and expression ofthe human erythropoitin genePracNatl Acad Sci USA 82:7580-7584Maitani Y Hazama M Tojo Y et al(1996)Oral administration of recombinant humanerythropoietin in liposome in rats:influence of lipid composition and size of liposomes onbioavailability.J Pharm Sci 85(4):440-445Powell JS Berkner KL Lebo RV & Adanson JW(1986)Human erythropoietin gene high levelexpression in stably transfected mammalian cells and chromosome localization ProcNatl Acad Sci USA 83:6465-6469Quelle FW Caslake LF Burkert RI & Wojchowski DM(1987)High-level expression andpruification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector.
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权利要求
1．一种用蚕幼虫、蛹、蛾作为生物反应器，通过基因工程技术获得带有人的促红细胞生成素(EPO)重组家蚕核型多角体病毒，生产重组人的促红细胞生成素，制备注射和口服生红细胞药物的技术和方法。
2．根据权利要求书1，其特征在于通过反转录从人的血浆细胞中合成hEPO基因，长为600bp。5’端上端带有BgⅡ和EcoRⅠ酶切位点，3’端下游带有BamHⅠ位点，将hEPO基因克隆进入pBMO30载体中，获得重组转移载体pBMEPO，与野生型家蚕核型多角体病毒基因组DNA重组，筛选出带有hEPO的重组病毒，在家蚕幼虫、蛹、及蛾中高效表达rhEPO，表达产物约为25-27KD。
3．根据权利要求书2，表达产物经过纯化制成精品，装成冷干粉针剂药物，经动物实验证明药物具有明确的生红细胞的效果；表达产物经过超声波处理，冷却干燥后，以家蚕幼虫血及蛹和蛾作为填充料制成口服胶囊。针剂和胶囊药物具有生红细胞作用。
4．根据权利要求3，本发明的针剂和口服药物包括所有用蚕生产基因工程rhEPO药物的技术和方法。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物技术领域。以家蚕幼虫、蛹和蛾作为生物反应器,通过基因工程技术利用家蚕核型多角体病毒表达系统在家蚕细胞中重组获得带有人的促红细胞生成素基因的重组家蚕核型多角体病毒,接种家蚕幼虫、蛹和蛾进行表达。表达产物大小约为25－27KD,经过分离纯化获得精品,冷冻干燥成为针剂,活性10
文档编号C12N15/16GK1218812SQ9812461
公开日1999年6月9日 申请日期1998年10月29日 优先权日1997年11月28日
发明者张耀洲, 沈锦清, 金勇丰, 吴卫东, 林蓉 申请人:浙江农业大学生物化学研究所, 浙江海宁丝绸集团有限责任公司