专利名称：重组人红细胞生成素(epo)的纯化方法、由此纯化的epo以及包含纯化的epo的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及红细胞生成素(ΕΡ0)，特别是高纯形式的具有确定的糖型组成、即具有大量O-糖基化EPO同种型的重组人EPO (rhEPO)的生产方法。这通过使用特定组合的层析步骤来实现。
背景技术：
红细胞生成素是调控红系祖细胞的增殖和分化以及维持循环红细胞的生理水平的主要激素。在胎儿中，EPO主要在肝脏中产生，在出生后，其约90%的生产切换到肾脏。当由于慢性或急性肾衰引起EPO水平下降时，必须外部给药EPO以防出现贫血。由于EPO基因的发现及其在啮齿动物细胞中的表达，已经可以获得治疗活性的人红细胞生成素。天然人红细胞生成素由7号染色体上位于7qll_q22处的基因编码(Law等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA (美国科学院院刊)83 (1986) ,6920-6924)。重组人EPO在1989年进入市场，当时FDA给出了它在与慢性肾衰相关的贫血症的治疗中使用的安全调查。与用作药物的其它重组糖蛋白的情况相同，EPO的糖基化模式对糖蛋白的生物利用率、生物活性和免疫原性性质有显著影响。对于rhEPO的生产来说，中国仓鼠卵巢(CHO)和幼仓鼠肾(BHK-21)宿主细胞作为表达系统发挥重要作用，因此已被充分研究(Sasaki等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)262 (1987)，12059-12076 ;Takeuchi 等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)263(1988)，3657-36633 ；Nimtz 等人，Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学杂志)213 (1993)，39-56 ；Tsuda等人，Biochemistry (生物化学)27 (1988), 5646-5654)。已确定，这些细胞系产生与人类糖型最接近类似的糖型。也已公知，糖类在糖蛋白的定向和清除中发挥重要作用(Drickamer 等人,Annu. Rev. Cell. Biol. 9 (1003), 237-264 ；Helenius 等人，Science (白然科学杂志)291 (2001)，2364-2369)。晚些时候，被称为阿法达贝泊汀(darb印oetin alfa)(ARANESP )的具有两个额外的N-糖基化位点的新型红细胞生成素，得到EMEA和FDA的批准。人EPO基因编码27个氨基酸的信号肽以及166个氨基酸的计算分子量为18396道尔顿的蛋白。成熟蛋白通常具有N-端单个氨基酸缺失，长度为165个氨基酸。信号序列将肽引导到参与正确糖基化的细胞区室中，产生具有三个N-聚糖和一个O-聚糖的成熟蛋白。占总分子量约40%的糖组成部分，对于EPO在体内的完整生物活性来说是必需的。几项研究显示，末端唾液酸残基的数量对体内半衰期有正面影响，尽管体外活性、即与受体的结合在未糖基化或部分糖基化形式中最高(Takeuchi和Kobata,Glycobiology (糖生物学)I (1991)，337-346)。唾液酸化的程度与半衰期成正比，其中具有较少唾液酸的同种型以快得多的速率从生物体中清除，因此显示出低活性。在上下文中，Rush等人(Anal. Chem.(分析化学)67 (1995)，1442-1452)描述了红细胞生成素的唾液酸残基的O-乙酰化及其对增加循环时间的影响，并表明唾液酸残基的高O-乙酰化程度通过降低肝脏清除率而增加循环时间。
通常通过在哺乳动物细胞、特别是CHO细胞中重组表达而获得的EPO制剂含有多达50%的缺少O-聚糖并因此失去了每个分子另外两个唾液酸残基的潜力的EPO同种型。因此，提供基本上不含这种缺陷的、未O-糖基化同种型的EPO制剂以及提供它们的方法，将是所希望的。从学术和专利文献中已知的EPO的分离/纯化方法包括不同的层析步骤。最常用的是阴离子交换层析(AEX)和反相HPLC (RP-HPLC)0也使用其它层析方法，例如羟磷灰石、疏水相互作用(HIC)、阳离子交换(CEX)、亲和(即免疫亲和或染料配体)和尺寸排阻(凝胶过滤)(SEC)层析。一些中间步骤例如浓缩，渗滤，超滤，透析，用乙醇、盐等沉淀，也是常用的。EP 205 564描述了使用阳离子交换层析步骤随后进行RP-HPLC来纯化ΕΡ0。EP 228 452和US 4，667，016描述了通过阴离子交换剂随后通过RP层析和凝胶层 析来纯化EPO。EP 428 267描述了 EP 228 452方法的改进，利用RP层析后的另一次阴离子交换剂来进行(特别是酸性)同种型的分离。EP I 394 179描述了包含染料亲和层析、HIC、羟磷灰石、RP-HPLC和阴离子交换剂的纯化方法。EP I 428 878描述了一种纯化高度唾液酸化EPO同种型的方法，所述方法使用了第一阴离子交换层析步骤作为捕获步骤和任选的酸洗步骤、疏水相互作用层析、亲和层析和带有酸洗步骤的第二阴离子交换层析步骤。WO 99/28346描述了将EPO纯化至以糖类结构中的N-乙酰-乳糖胺单元和/或四天线分支型计高的纯度。该纯化方法从细胞培养上清液开始，通过亲和层析进行捕获，通过疏水相互作用层析、羟磷灰石和反相层析进行纯化。WO 03/045996描述了从细胞培养基回收和纯化rhEPO的方法，所述方法包括尤其是阴离子交换层析、反相层析、阴离子交换层析和尺寸排阻层析步骤。WO 03/080852描述了生产EPO的方法，所述方法至少包括染料亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析，任选还包括凝胶过滤层析。Miyake 等人，J. Biol. Chem (生物化学杂志)252 (1977)，5558-5564 描述了通过 7步程序纯化尿液ΕΡ0，所述程序包括离子交换层析、乙醇沉淀、凝胶过滤和吸附层析。Broudy 等人,Arch. Biochem. Biophys.(生物化学与生物物理学集刊)265 (1988),329-336使用转染的BHK细胞系，通过Affi-Gel Blue层析、阴离子交换层析和反相层析来纯化EPO。Gokana 等人，J. Chromatography (色谱分析杂志)791 (1997), 109-118 描述了按照以前通过免疫亲和来纯化EPO之后，利用DEAE层析来分离重组人EPO同种型。EPO同种型的分离是基于其不同的pi。Goto等人，Bio/Technology (生物技术)6 (1988)，67-71描述了利用免疫亲和、凝胶层析和羟磷灰石来纯化ΕΡ0。Hokke 等人，Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学期刊)228 (1995)，981-1008 描述了EPO的聚糖分析，其包括PNGase处理以分别分析N-聚糖和O-聚糖。 Kishino 和 Miyazaki, J. Chromatography (色谱分析杂志)699 (1997), 371-381综述了用于糖蛋白分析的方法，包括使用终端RP层析从尿液纯化ΕΡ0。
Nimtz 等人,Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学期刊)213 (1993), 39-56 描述了包括PNGase F消化的EPO糖基化的分析，显示出在幼仓鼠肾(BHK)细胞中表达并从其获得的重组人EPO仅有60%被O-糖基化。Quelle等人，Blood (血液)74 (1989)，652-657描述了从昆虫细胞纯化ΕΡ0，其中该纯化方法包含阴离子交换层析和RP-HPLC和随后的凝集素亲和层析。Sasaki 等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)262 (1987)，12059-12076 和 Sasaki等人，Biochemistry (生物化学)27 (1988) 8618-8626描述了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达并从其获得的重组人EPO的糖类结构的分析。EPO利用RP-HPLC等方法来纯化。Skibell 等人，Blood (血液)98 (2001 )，3626-3634 描述了来自于人类血清的 EPO的聚糖结构与重组EPO相比的检查，证实了在血液中循环的EPO也发生O-糖基化。Sytkowski 和 Donahue J. Biol. Chem.(生物化学杂志)262 (1987)，1161-1166 确定了借助于单克隆抗体(mAb)(利用中和来间接)确定的EPO受体结合位点。表II显示了 针对EPO的111-129位氨基酸序列的mAb表现出最强的中和效应，表明位于Serl26处的O-聚糖可能参与受体结合。因此，尽管EPO的糖基化的重要性是已知的，但所提到的文献都没有公开提供具有如下特点的EPO制剂的方法(i)基本不含未O-糖基化的同种型，(ii)纯化至医药级，
(iii)不含病毒污染物，并且(iv)适合于大规模生产。通过在权利要求书中进行特征表述并在下文中进一步描述的实施方式，该技术问题得以解决。发明简述本发明提供了从源自重组细胞的细胞培养基中回收和纯化人红细胞生成素(rhEPO)的方法，所述方法包括反相(RP)层析步骤、优选RP-HPLC，以及随后的阳离子交换(CEX)层析步骤，其中优选在RP-HPLC步骤之前进行阴离子交换(AEX)层析步骤。使用几种分析程序对按照本发明的方法纯化的重组人红细胞生成素(rhEPO)进行分析，以对所述EPO的N-和O-糖基化状态进行表征。正如在背景部分中提到的，EPO具有S126处的一个O-糖基化位点和N24、N38与N83处的三个N-糖基化位点。已发现，本发明的EPO制剂的总体糖基化模式与在国际BRP标准品和商业参比产品中发现的模式相当相似。然而对于O-连接的寡糖来说，观察到EPO的未糖基化形式，如果存在的话，其相对量与BRP标准品相比明显更低。这可能使本发明的EPO制剂与其它商业产品相比得到改进。不打算受到理论的限制，相信在HPLC中O-脱糖基化的(Des-0) EPO形式的基本上选择性的分离，由于缺少整个O-糖链这一事实而起作用。在N-聚糖的情况下，差异不是如此显著。在这里，只有偶尔的天线缺失，但是整个聚糖的缺失即使有的话，也是很少。缺少N-聚糖(每个聚糖减去4个唾液酸)的同种型已经在阴离子交换层析(AEX)步骤中被大量排除。在缺失O-链的情况下，通常被糖链遮蔽的疏水性片(约121-130个氨基酸)暴露。事实上，在更精细地检查O-糖基化位点后，可以认识到126位丝氨酸周围疏水氨基酸的密集聚集。直接围绕126位丝氨酸的4个丙氨酸和3个脯氨酸(121、122、129)限定了显著疏水的区域。此外，130位亮氨酸也是疏水的并有助于这种效应。EPO中所述的其它疏水位点增强了与HPLC柱的C4基质的总体结合力。因此，Des-O形式在较晚的时间点洗脱。在本发明的特别优选的实施方式中，提供了 5个柱层析方法，用于将EPO纯化成适合作为药物物质的纯的形式，所述方法包括
(a)染料亲和层析，用于捕获和浓缩含有EPO的溶液，并大量减少潜在的污染物；(b)阴离子交换层析，用于富集EPO的酸性同种型，进一步除去污染物(例如DNA、HCP)并消除可能从第一个柱上浙滤下来的任何染料配体；(c)RP-HPLC,其在用于除去在Ser 126残基处没有糖基化的EPO分子和除去污染物的条件下进行；(d)阳离子交换层析，用于除去RP-HPLC溶剂和聚集物质、交换缓冲液和浓缩EPO级份；以及(e)尺寸排阻层析，其作为最后的层析步骤用于除去任何可能的剩余聚集物和其它污染物。此外，在EPO制造方法中包括了两个特异性病毒除去/失活步骤。首先，在RP-HPLC步骤之后，将洗脱液在22±3°C下、在酸性的乙腈水加O. l%(v/v)TFA混合物中保留60至 180分钟。其次，在最后的层析步骤后包括纳滤步骤，以增加药物物质的病毒安全性。此外，已证实阴离子交换层析也是用于除去病毒的有效步骤。得到的EPO药物物质可以使用例如蠕动泵分发到容积为250ml或30ml的原料药物物质储存容器中，并可以储存在< _70°C下。因此，本发明的方法提供了 EPO的分布情况指导性生产以及高度均匀的高质量产品。此外，本发明能够大规模制备大量具有高纯度和希望的O-糖基化EPO同种型分布情况的生物活性EPO。当通过HPLC和凝胶电泳测定时，EPO的纯度高达超过总蛋白的至少99%，有利地超过总蛋白的99. 9%的纯度。此外，通过降低感染风险，改进了产品被病毒等污染的风险，并因此提高了临床安全性。在本发明上下文中，在纯化方法中，使用RP-HPLC以及使用有机溶剂来洗脱和在前进到下一步骤之间储存EPO样品的有利副作用，在于使病毒失活，否则病毒可能在用于例如疏水相互作用或离子交换层析的其它溶剂中保持存活。在本发明的上下文中，本领域普通技术人员将会认识到，本发明的一个基本特点在于进行RP-HPLC和随后的CEX层析步骤，而任何其它层析步骤可以被改变或完全省略。这也适用于AEX步骤，其尽管优选包括在本发明的方法中，但取决于所用的EPO样品，和/或在例如希望提供非均质或低唾液酸化但仍O-糖基化的EPO制剂的情况下，其可以被不同的纯化步骤代替或者也可以被省略。按照本发明的方法分离的EPO的O-糖基化比BRP标准品更加完全这一事实，表明EPO制剂的半衰期可能有很大增加。因此，可以审慎地预期，本发明的EPO制剂与迄今为止可商购的重组EPO产品相比，其体内半衰期如果没有增加，至少也是相近的。这也暗示药物动力学和药效学性质也将与市场产品的相似。因此，按照本发明的方法获得的EPO特别适用于人类医药中。
专利或申请文件可以包括一张或多张用彩色制成的图和/或一张或多张照片。本专利或专利申请公开的带有彩色图和/或照片的拷贝，可以在提出请求并付出必需费用后，由欧洲专利局(European Patent Office)或美国专利和商标局(United StatesPatent and Trademark Office)提供。图I :用于分离高度唾液酸化和O-糖基化EPO同种型的特定混合物的纯化程序的流程图。在说明书中进一步解释了各个纯化步骤的重要性和所打算的目的。图2 =HPLC级份在用PNGase消化后的考马斯亮蓝染色的12. 5%SDS_PAGE凝胶的照片。每个槽装载5 μ g蛋白。MW，分子量标志物；BRP，BRP标准品批次I (=生物学参比制剂=α -和β -依伯汀的混合物);I =阴离子交换层析后(AEX合并物)并进行RP-HPLC步骤之前的EPO样品；2-10=在将AEX合并物进行RP-HPLC并应用如实施例中所述的溶剂的线性梯度后获得的EPO洗脱液级份的样品；也参见表6。显示了用多肽N-糖苷酶(PNGase)消化后的各个EPO批次，所述N-糖苷酶除去所有N-聚糖，但是留下附着的O-聚糖，如果这些聚糖存在的话。靠下的较薄条带是未O-糖基化(Des-O)形式。酶本身也可以作为凝胶中部的痕量条带在凝胶中被检测到。左侧的道显示了 BRP标准品,接下来的道显示了上柱样品(含有Des-O形式，与BRP标准品类似)，随后是梯度洗脱的9个级份。可以看出，前5个级份明显不含Des-O形式，Des-O形式主要存在于后3到4个级份中，证实了 Des-O同种型保持结合在层析材料上并在较晚的时间点从柱上洗脱。合并物标准用于调节Des-O同种型的剩余比例。图3 :考马斯亮蓝染色的12. 5%SDS-PAGE凝胶的照片。MW，分子量标志物；1_4=通 过实施例中所述方法获得的EPO制剂；5+6=BRP标准品批次I (=生物学参比制剂=α -和β-依伯汀的混合物)；7=空白。显示了用PNGase消化之前(1、3、5)和之后(2、4、6)的各个EPO批次。酶本身也可以作为痕量条带在凝胶中被检测到。BRP标准品在消化后表现出双条带。靠下的较薄条带是未O-糖基化(Des-O)形式。可以看出，按照本发明的方法获得的EPO制剂明显缺少靠下的条带，证实了 Des-O形式已在HPLC步骤中被除去。发明详述本发明提供了改进的EPO制剂的分离和纯化方法，所述制剂如果有的话，仅具有少量未O-糖基化的同种型，并且基本上不含聚集物。这个目标通过在适当条件下经反相(RP)高压液相层析(HPLC)并随后使用阳离子交换层析(CEX)步骤减小未O-糖基化的EPO同种型含量来实现。更具体地，本发明涉及从复杂的蛋白质混合物纯化糖基化红细胞生成素(EPO)同种型的方法，其中所述方法包括阴离子交换(AEX)层析步骤和阳离子交换(CEX)层析步骤，其通过反相(RP)层析步骤来分离。当在本文中使用时，术语“同种型”是指如下的糖蛋白制剂/级份，其包含的糖蛋白具有一致的氨基酸序列，但是具有例如通过等电聚焦(IEF)凝胶所揭示的不同等电点或例如通过毛细管区带电泳(CZE)所揭示的不同电荷数。这些差异反映出糖基化模式的不均匀性。各个EPO分子可能在附着的糖基、唾液酸基和乙酰基的程度、复杂性、特性、天线型和次序方面有所不同。即使是带电荷的非有机基团例如磷酸酯和硫酸酯，也对特定同种型的特性有贡献。因此，本发明的糖蛋白同种型由它们不同的等电点及其一致的氨基酸序列定义，并且因此在严格的化学意义上，各种同种型事实上可以包含多种不同的EPO分子。按照本发明的方法，优选使用阴离子交换层析来选择EPO同种型，特别是高度唾液酸化的酸性EPO同种型；也参见图I。根据本发明，EPO的“酸性同种型”包含具有高的糖基、优选为唾液酸基程度或含量，因此表现为具有低的(酸性)pl的那些同种型。当通过IEF从细胞培养上清液分析时，重组人EPO显示出宽的等电点(pi)同种型分布，在pi 3-9的范围内具有多达最多14种不同的同种型(Gokana等人，J. Chromatogr.(色谱分析杂志)791(1997)，109-118XEP0同种型主要由它们不同的糖基含量以及带负电荷的端基唾液酸残基的不同数量引起。已知具有更多唾液酸残基并因此具有更酸性Pl的EPO形式具有更高的生物活性和治疗价值，这是由于糖结构上的末端唾液酸残基阻止EPO在体内通过去唾液酸基-受体途径快速清除。阴离子交换层析步骤可以使用含有二乙氨基乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)、季铵基(Q)、二甲氨基乙基(DMAE )和/或三甲氨基乙基(TMAE )作为功能基的阴离子交换树脂或膜来进行。示例性的阴离子交换材料是可以从Dow chemical company (陶氏化学)获得的Dowex l,可以从 BioRad Laboratories(伯乐试验室)获得的 AG (例如 1、2、4 型)、Bio-Rex
5、DEAE Bio-Gel I>Macro-Prep DEAE,可以从 Eichrom Technologies Inc. (Eichrom 技术有限公司)获得的I型阴离子交换树脂，可以从GE Healthcare(通用医疗)获得的SourceQ、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose (例如 CL_6B、FF 型)、Q Sepharose> Capto Q、CaptoS，可以从PerkinElmer (拍金埃尔默公司)获得的AX-300,可以从Shoko America Inc. (Shoko 美国有限公司)获得的 Asahipak ES-502C、AXpak WA (例如 624、G 型)、IEC DEAE,可以从 Tosoh Bioscience GmbH (Tosoh 生物技术有限公司)获得的 Amberlite IRA-96>Toyopearl DEAE>TSKgeI DEAE,可以从 Pall Corporation (颇尔公司)获得的 Mustang Q。在本发明方法的优选实施方式中，阴离子交换层析步骤使用Q-Sepharose来进行；也参见实施例。正如所述，排除低唾液酸化的碱性EPO同种型和选择高度唾液酸化的酸性EPO同种型，分别优选使用在PH约7. O的包含20mM Tris-HCl的缓冲液中O至200mM NaCl的线性盐梯度来进行。此外，根据本发明的方法，使用反相层析步骤来选择O-糖基化的EPO同种型。正如在实施例中所示，这样的EPO同种型可以使用有机溶剂的线性梯度、优选为O至70%的乙腈在水中并含有约O. 1%TFA来洗脱。此外或可选地，使用在水中含有乙腈和约O. 1%TFA的溶剂进行EPO的等度洗脱。用于进行反相(RP)层析的手段和方法对于本领域普通技术人员来说是公知的；也参见在上面背景部分中叙述的现有技术。优选地，RP层析步骤包括反相高效液相层析(RP-HPLC)。通常所述RP-HPLC使用含有甲基、丁基、苯基、丙基和/或辛基作为功能基的树脂来进行。在本发明方法的优选实施方式中，所述RP-HPLC使用可商购的C4反相层析材料来进行。示例性的反相材料是可以从Grace Davison获得的Vydac 214TPB 1015、C4 ;可以从 DAISO Fine Chem. GmbH (DAIS0 精细化学有限公司)获得的 Daisopak SP-300-15-C4-BI0 ;可以从 YMC Europe GmbHCYMC 欧洲有限公司)获得的 YMCGel Butyl Sphiirisch C4,15 μ , 300Α ;可以从 Phenomenex (菲罗门公司)获得的 Jupiter15 μ，C4，300A。最优选地，使用由表面带有C4-烷基链的硅胶粒子构成的VydacC4 (Vydac)0 EPO与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差异。洗脱使用在稀三氟乙酸存在下乙腈在水中的梯度来进行。通常，必须通过分级分离截去“EP0峰”的一部分。例如，在数量约9或10个含有EPO的洗脱级份中，必须舍弃通常可能占总EPO峰的40%的最后的I至4个样品，同时将剩余的洗脱液合并物在随后的步骤中进一步纯化；也参见图2。根据本发明，制备型RP-HPLC通常在> 10巴的高压(根据制备规模高达30_40巴)和通常为硅胶的珠粒(5-10μπι)下进行，其产生更好的分辨率。优选地，使用TFA酸化的溶剂的PH约为2。在低的乙腈浓度(例如10%或纯水)下应用AEX洗脱液并增加乙腈浓度梯度，将洗脱EPO同种型。
在本发明上下文中，观察到当按照本发明的方法使用RP-HPLC时，与在低压下进行的普通RP层析(RPC)(也被称为中压方法，〈10巴，通常为3-5巴)显著不同。例如，RPC通常使用15 μ珠粒或30 μ珠粒来进行，正如在国际申请W003/045996中所述(RP-Source30)。此外，尽管与HPLC中类似可以使用有机溶剂，但W003/045996中的RPC步骤，在样品中使用O. 24Μ硫酸铵进行硫酸铵沉淀之后开始，所述硫酸铵沉淀对于HPLC是不利的，但是非常适合于通常使用降低的盐梯度进行洗脱的HIC (疏水相互作用层析)。因此，如国际申请TO03/045996中所述的RPC在完全水性溶剂系统、即pH 7的Tris/HCl缓冲液中进行，因为迄今为止还未描述用于快速分离有机溶剂并避免在EPO制剂中形成/引出聚集物的适当方法。然而，省却使用有机溶剂的HPLC步骤，其代价是EPO同种型分离的效率降低，这是由于例如在RPC中使用的珠粒颗粒较大并且分离条件严苛性较低。无论如何RP-HPLC的分离性能优于RPC0纯化流程的有效性的另一个重要因素在于在紧接HPLC后的第三个步骤中进行阳离子交换层析(CEX)。该步骤在应用方式方面是新颖的。在RP层析之后，必须将EPO快速进行缓冲液交换，因为它在酸性乙腈中不稳定，即随时间和温度的升高而逐渐形成聚集物。此外，对于随后用作最后的精制步骤的凝胶层析来说，样品体积必须非常小，即RP合并物 中EPO的浓度必须被极大地提高。另一方面，由于分离Des-O形式所需的相对平的梯度，RP-HPLC合并物具有相当大的体积。根据本发明，开发了使用所选材料(Macroprep S)的CEX层析步骤而不是使用标准的超滤/渗滤步骤，后者是常用但相当耗时的方法。该CEX层析允许特别高的流速并耐受高浓度的酸性乙腈。由于EPO在酸性环境中带正电这一事实，EPO是强结合物，并且以非常陡的梯度、以小体积和高浓度洗脱在所希望的缓冲液中。令人吃惊地，CEX层析也引起在乙腈中不可避免地形成的EPO聚集物的分离，因为它造成EPO聚集物不洗脱而是保留在柱上，并随后在再生中用CIP溶液洗脱。因此，根据本发明，在RP层析、特别是RP-HPLC后使用阳离子交换层析步骤进行缓冲液交换、EPO浓缩和EPO聚集物的消除；也参见图I。不同类型的阳离子交换材料可以在不同名称下并从许多公司获得，例如可以从BioRad Laboratories (伯乐试验室)获得的 Bio-Rex (例如 70 型)、Che I ex (例如 100
Macro-Prep (例如 CM、High S、25S 型)、AG (例如 50W、MP 型);可以从 Ciphergen (赛弗吉)获得的WCX 2,可以从Dow chemical company (陶氏化学)获得的Dowex MAC-3,可以从 Pall Corporation (颇尔公司)获得的 Mustang C 和 Mustang S,可以从 Whatman pic获得的 Cellulose CM (例如 23、52 型)、hyper-D、PartiSphere,可以从 Tosoh BioscienceGmbHCTosoh 生物技术有限公司)获得的 Amberlite IRC(例如 76、747、748 型)、Amberlite GT 73、Toyopearl (例如SP、CM、650M型)，可以从BioChrom Labs (生物色谱试验室)获得的CM 1500和CM 3000,可以从GE Healthcare (通用医疗)获得的SP-S印harose 、CM-Sepharose ,可以从 PerSeptive Biosystems (PerSeptive 生物系统公司)获得的多孔树脂，可以从Shoko America Inc. (Shoko美国有限公司)获得的Asahipak ES (例如502C型)、CXpak P、IEC CM (例如 825、2825、5025、LG 型)、IEC SP (例如 420N、825 型)、IEC QA(例如LG、825型)，可以从Eichrom Technologies Inc. (Eichrom技术有限公司)获得的50W阳离子交换树脂。优选地，所述阳离子交换材料是强阳离子交换材料例如Macro-Prep High S 或 25S、MacroCapSP、Toyopearl SP 650M,Source S、SP S印harose 或P0LYCAT A。在一个实施方式中，所述阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。在本发明方法的优选实施方式中，所述阳离子交换层析步骤使用Macro-Prep High S来进行；也参见实施例。在本发明方法的优选实施方式中，在上面描述的层析步骤之前使用亲和层析步骤作为捕获步骤。通常，所述亲和层析步骤使用染料层析树脂，例如使用可商购的Blue-Sepharose来进行；也参见实施例。优选地，本发明方法中的层析步骤以下列次序进行(a)作为捕获步骤的亲和层析步骤；(b)阴离子交换层析步骤；(C)反相(RP)层析步骤；以及
(d)阳离子交换层析步骤；也参见图I和实施例。在第一步骤中，染料层析主要通过蛋白酶除去污染物。优选使用蓝色三嗪染料例如Cibachron 蓝作为染料。其它的三嗪染料也是适当的。用于染料层析的载体材料并不关键，然而，优选使用基于多糖的载体材料例如Sepharose,优选为Sepharose 6Fast Flow。根据本发明，在随后的层析步骤中进行高度唾液酸化和O-糖基化的EPO同种型的富集；也参见图I。在本发明方法的优选实施方式中，在一个或多个层析步骤中通过分步或梯度洗脱来进行EPO的洗脱。可以在本申请中互换使用的术语“分步洗脱”和“分步洗脱方法”，是指在方法中，引起洗脱、即被结合化合物从材料上的解离的物质浓度被立即升高或降低，即直接从一个值/水平变到下一个值/水平。在该“分步洗脱”中，一种或多种条件例如pH、离子强度、盐浓度、有机化合物浓度和/或层析的流速，全部立即从第一、例如初始值变化到第二、例如最终值。这意味着条件以增量、即逐步变化，这与稳定的线性或非线性变化相反。在“分步洗脱方法”中，在离子强度或有机溶剂含量每次增加后收集新的级份。该级份含有分别使用离子强度和疏水性的相应增加从离子交换材料上回收的化合物。在每次增加后维持条件，直到进行洗脱方法中的下一步骤。通常，在大规模生产中，只要可能，使用分步或等度洗脱代替梯度洗脱。在本发明的上下文中，按照本发明的方法进行的任何层析步骤，可以以梯度或等度方式来进行；对于综述参见例如Schellinger和Carr, J. Chromatography (色谱分析杂志)，1109 (2006)，253-266。具体来说，对于RP-HPLC和阴离子层析(AEX)步骤来说，设想了用等度洗脱代替直线梯度。因此，在本发明方法的一个实施方式中，RP和/或AEX步骤通过等度洗脱来进行。在本发明方法的其它层析步骤中，将从阳离子交换层析(CEX)获得的EPO制剂通过尺寸排阻层析(SEC)进行精制，所述尺寸排阻层析除去可能的二聚体、较大的聚集物和不希望的小分子例如过程相关的杂质，并且如果适合，也为最终制剂进行缓冲液交换。通常，所述尺寸排阻层析步骤使用选自 Superdex、Sephacryl、Sephadex、Sepharose> Fractogel、Toyopearl和Bio-Gel的凝胶过滤介质来进行。优选地，所述尺寸排阻层析步骤使用可商购的Superdex_S200来进行；也参见实施例。为了在CEX层析后获得的EPO制剂中实现更高的产物浓度，优选在凝胶过滤(SEC)之前将洗脱液进一步浓缩。这通常使用5-10kDa的UF膜通过超滤步骤来进行，产生浓缩约10倍的每ml具有约5至20mg EPO的UF渗流物，以得到SEC合并物；也参见实施例。
为了除去可能的病毒负载，在本发明的方法中进行了另外的最终病毒过滤步骤。该过滤使用被设计用于除去小至15nm粒子的特制膜例如Planova 15N(Asahi)来进行。可选的最终纳滤装置是 PALL Ultipor VF Grade DV20 或 Millipore Viresolve NFP 滤芯或滤囊。特别是对于小的无包膜病毒(例如细小病毒)来说，几乎没有其它的病毒除去或失活工具。使无菌过滤后的SEC合并物通过带有适当膜的最终过滤器，滤液代表最终的原料药物物质。可选地，可以将纳滤插入到UF浓缩与尺寸排阻层析之间。因此，本发明的方法可以在一个或多个层析步骤之前包含超滤步骤和任选的纳滤步骤，后者优选作为最终步骤；也参见图I。在特别优选的实施方式中，本发明的方法包括下列步骤(a)作为捕获步骤的亲和层析步骤；(b)阴离子交换层析步骤；
(c)反相(RP)层析步骤；(d)阳离子交换层析步骤；(e)尺寸排阻层析步骤；(f)纳滤步骤；以及(g)步骤(a)、(b)和/或(e)之前的超滤步骤。可以通过SDS-PAGE来确定不同级份的内含物以作为过程中的对照，并且如果适合，将所选的级份合并或丢弃；对于从RP-HPLC步骤洗脱的EPO对照，参见例如图2。在优选实施方式中，按照本发明方法纯化的EPO是人重组ΕΡ0。因此，优选通过在宿主细胞中诱导EPO编码基因的表达来提供EPO分子。“宿主细胞”被理解为动物或人类细胞，其基因组含有活性EPO基因并且该EPO基因在细胞在无血清培养基中培养期间被转录和翻译。EPO基因可以作为外源基因、优选与调控元件一起被导入该宿主细胞中(参见例如欧洲专利申请EP-B O 148 605和EP-B O 209)，可以作为活性内源基因已经存在于宿主细胞中，或者可以作为内源的无活性基因并被激活。内源基因的这种激活可以通过例如将调控元件经同源重组特异性导入到基因组中来实现。国际申请WO 91/09955和W093/09222描述了这类方法的实例。通常使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。如果要导入外源人EPO基因，可以使用例如CHO或BHK细胞作为宿主细胞。如果使用内源EPO基因进行表达，使用人类细胞例如肾脏、肝脏或淋巴细胞是有利的。优选地，所述EPO是在CHO细胞中生产的人重组EPO。EPO在CHO的重组生产通常通过在培养基中添加胎牛血清和任选的牛胰岛素来进行。结果，以这种方式生产的EPO制剂具有被病毒或TSE诱导剂感染的潜在风险，因为即使在纯化后它也可能含有至少痕量的这种动物来源的制剂。已知可以使用现有技术方法来进行含EPO基因的重组CHO细胞的无血清发酵；参见例如欧洲专利申请EP I 394 179,EP O 513 738和EP O267 678,通用形式参见 Kawamoto 等人,Analytical Biochem.(分析生物化学)130 (1983)445-453, Kowar 和 Franek, Methods in Enzymology (酶学方法)421 (1986) , 277-292,Bavister, Expcology (生态学)271 (1981 )，45-51，欧洲专利申请 EP O 248 656,EP O 48179UEP O 307 247,EP O 343 635和国际申请TO 88/00967，其公开内容在此引为参考。具有类似活性并在产EPO宿主细胞培养后产生的EPO衍生物和片段，也可以通过本发明的方法以纯的形式生产。人EPO的DNA和蛋白质序列，描述在例如欧洲专利申请EP O 205 564和 EP O 209 539 中。为了生产ΕΡ0，可以通过将含有EPO基因的宿主细胞在小体积培养中传代，使其适应于不含天然来源蛋白的培养基。适应后的细胞任选进行低温保存，在需要时从已建立的细胞库中取出并按照例如欧洲专利申请EP I 394 179中所述在无血清培养基中扩增。为了纯化，优选分离宿主细胞的无细胞培养上清液，并在过滤后将其按照本发明进行纯化过程。在进行纯化过程之前，如果需要，可以进行另一过滤以分离混浊物或碎片和/或通过超滤进行浓缩。另一方面，本发明涉及通过如上所述并优选如实施例中的说明来进行的本发明方法纯化的糖基化EPO同种型制剂。通常，所述EPO是人重组ΕΡ0。有利地，本发明的EPO制 剂基本上不含未O-糖基化的EPO同种型。术语“基本上不含未O-糖基化的EPO同种型”是指本发明的EPO制剂通常含有少于10%的未O-糖基化的EPO同种型，优选少于5%、有利地少于1%的未O-糖基化的EPO同种型。换句话说，本发明的EPO制剂通常含有至少90%的O-糖基化EPO同种型，优选至少95%、最优选至少99%的O-糖基化EPO同种型，通过这种特征可以将本发明的EPO制剂与按照本领域已知的方法纯化的EPO制剂区分开；参见例如通过图2和图3中所示的SDS-PAGE。表征糖基化状态的主要分析技术是MALDI/T0F-MS和HPAEC-PAD。表征样品的其它技术包括SDS-PAGE、IEF、UV、CD、荧光光谱法和NMR。例如，可以通过按照Eur. Pharm.(欧洲医药)的专论将EPO分子的胰蛋白酶肽的混合物通过RP-HPLC C4-相分离后进行MALDI/T0F-MS分析，来进行EPO制剂的O-糖基化的测定。含有Ser-126部分的未糖基化的胰蛋白酶肽具有1466. 6的质量，而相应的带有GalNAc部分的肽(Hex-NAc)应该具有 203 的质量增量(m/z=1669)，并且 Gal-GalNAc (Hex-NAc-Hex)衍生物应该具有365的质量增量，对应于m/z=1830的质量。在本发明的范围内使用MALDI/T0F-MS分析进行的相应实验证实，在通过多肽-N糖苷酶(PNGase)释放出N-聚糖后，在EPO制剂的SDS-PAGE图样中基本上只能专一地观察到EPO蛋白的O-糖基化形式，与此相比在标准的EPO制剂中存在约15%的未O-糖基化的同种型。在本发明的上下文中，EPO比活性的最小值通常为每mg (糖蛋白)100，000IU。在一个实施方式中，由于高度唾液酸化的EPO同种型的富集，可以获得具有>110，000IU/mg的活性的本发明的EPO制剂。 因此，本发明的EPO制剂特别适用于治疗应用。因此，本发明还涉及包含如上定义的本发明的EPO制剂的药物组合物。在本发明的上下文中，本发明还涉及药物组合物的制造方法，所述方法包括制备和分离如上所定义的糖同种型混合物形式的ΕΡ0，以及提供由此制备和分离的EPO与可接受的药用载体的混合物。在一个实施方式中，本发明涉及含有三羟甲基氨基甲烷作为稳定剂的EPO制剂的稳定药物制剂，由此所述制剂不含氨基酸或人血清白蛋白，最优选地所述制剂包含磷酸钠缓冲液作为PH缓冲剂，量为10至200mM的三羟甲基氨基甲烷和/或量为20-150mM的NaCl作为稳定剂，以及药用量的纯化的ΕΡ0。对于本发明的EPO制剂的其它实施方式，参见欧洲专利申请EP 1537876，其公开内容在此引为参考。本发明的药物组合物的特征在于至少是无菌和无热原的。当在本文中使用时，“药物组合物”包括人类使用和兽医用制剂。制备本发明的药物组合物的方法在本领域的技术范围内，例如如在《Remington 制药学》(Remington’s Pharmaceutical Science,第 17 版,MackPublishing Company (麦克出版公司),Easton,Pa. (1985))和更新版的《Remington 药物科学与实践〉〉(Remington:The Science and Practice of Pharmacy (2000), the Universityof Sciences in Philadelphia (费城科学大学)，ISBN 0-683-306472)中描述的,两份文献的全部公开内容在此引为参考。本发明的说明书和实施例公开并涵盖了这些以及其它实施方式。可以从公共图书馆和数据库检索关于在本发明中使用的任一种材料、方法、应用和化合物的其它文献。例如，可以利用公共数据库“Medline”,其由美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)和/或国家医学图书馆(National Library of Medicine)主办。其它数据库和网址,例如作为欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute) (EBI)的数据库和网址，对于本领域普通技术人员来说是已知的，并且也可以使用因特网搜索引擎来获得。生物技术领域专利信息的概述和可用于回溯检索和新近资料通告的专利信息相关资源的调查，在Berks, TIBTECH 12 (1994)，352-364 中给出。、
上面的公开内容总体描述了本发明。除非另有陈述，否则对本文中使用的术语给出的定义如《牛津生物化学和分子生物学词典》(Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology, Oxford University Press(牛津大学出版社)，1997, 2000年修订，2003年重印，ISBN 0198506732)中所提供的。在本说明书的文本中引用了几篇文献。所有引用的参考文献(包括在本申请中引用的文献参考、出版的专利、公开的专利申请和制造商的技术规格、说明书等)的内容，在此明确引为参考；然而，并不承认任何引用的文献事实上是本发明的现有技术。参考下面的具体实施例可以获得更完整的理解，在本文中提供所述实施例仅仅是出于说明的目的，并不是旨在限制本发明的范围。具体说来，所述实施例涉及本发明的优选实施方式。
具体实施例方式实施例除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与所述技术领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术、蛋白质化学和生物化学)中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。使用分子、遗传和生物化学方法(总的来说，参见SambiOOk等人，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版，(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，Ν·Υ·(纽约)和Ausubel等人，《分子生物学简要方法》(Short Protocols inMolecular Biology) (1999)第四版,John ffiley&Sons, Inc.，以及标题为《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)的完整版本,上述文献在此引为参考)以及化学方法的标准技术。起始材料含有EPO蛋白的培养基如本技术领域中所述，通过含有扩增的人类EPO基因的转化的中国仓鼠卵巢细胞系(CH0 dhfrO的大规模灌注培养来生产；参见例如上面引用的文献。培养基中EPO蛋白的浓度与细胞生长相关。在实际中，产物表达的水平(单位体积的mg数)受到获得的最大细胞数量的限制。因此，使用允许在长的培养时期内进行高密度细胞培养的连续灌注培养系统，使培养最大化。在确定的细胞密度时开始灌注，并通过针对细胞数量手动调节速率，将灌注速率维持在确定范围内。通过标准程序例如声波沉降器、过滤或离心来实现细胞持留。将灌注液收获物在冷冻温度下分份收集。整个一批生产通常由几周的灌注培养构成，产生5-10份收获物。通过深度过滤从灌注液收获物除去灌注液中残留的细胞和碎片，并优选以30kDa的截留分子量通过切向流超滤浓缩蛋白。将浓缩物分成等分试样，并储存在< _70°C下，直到所有收获物都已收集。从冰箱中取出浓缩的收获物并置于冻融装置中。通过经0.45 μ m深度滤器进行过滤，使合并和融化的收获物澄清。解冻后的所有下游纯化步骤在室温(17至25°C )下进行。缓冲液和溶液组成用于各个纯化步骤的缓冲溶液描述在下面的表I中。
表I:缓冲液组成
权利要求
1.一种从复杂的蛋白质混合物中纯化糖基化红细胞生成素(EPO)同种型的方法，其中该方法包括阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，其通过反相(RP)层析步骤来分离。
2.权利要求I的方法，其包括下述步骤 Ca)作为捕获步骤的亲和层析步骤； (b)阴离子交换层析步骤； (c)反相(RP)层析步骤；以及 (d)阳离子交换层析步骤。
3.权利要求I或2的方法，其还包括下述步骤 (e)尺寸排阻层析步骤。
4.权利要求I至3中任一项的方法，其中在一个或多个层析步骤中EPO的洗脱通过分步或梯度洗脱来进行。
5.权利要求I至4中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析步骤使用含有二乙氨基乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)、季铵基(Q)、二甲氨基乙基(DMAE)和/或三甲氨基乙基(TMAE)作为功能基的阴离子交换树脂或膜来进行。
6.权利要求5的方法,其中所述阴离子交换层析步骤使用可商购的Q-Sepharose来进行。
7.权利要求I至6中任一项的方法，其中所述反相(RP)层析步骤是反相高效液相层析(RP-HPLC)0
8.权利要求7的方法，其中所述RP-HPLC使用含有甲基、丁基、苯基、丙基和/或辛基作为功能基的树脂来进行。
9.权利要求8的方法，其中RP-HPLC使用可商购的C4反相层析材料来进行。
10.权利要求I至9中任一项的方法，其中所述阳离子交换层析步骤使用含有磺丙基阳离子交换材料的树脂来进行。
11.权利要求10的方法,其中所述阳离子交换层析步骤使用可商购的Macro-PrepHigh S来进行。
12.权利要求2至11中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤使用染料层析树脂来进行。
13.权利要求12的方法,其中所述亲和层析步骤使用可商购的Blue-Sepharose来进行。
14.权利要求3至13中任一项的方法，其中所述尺寸排阻层析步骤使用选自Superdex、Sephacryl、Sephadex、Sepharose> Fractogel、Toyopearl 和 Bio-Gel 的凝胶过滤介质来进行。
15.权利要求14的方法,其中所述尺寸排阻层析步骤使用可商购的Superdex-S200来进行。
16.权利要求I至15中任一项的方法，其中使用所述阴离子交换层析来选择EPO同种型。
17.权利要求16的方法，其中使用在pH约为7.O的包含20mMTris-HCl的缓冲液中O至200mM NaCl的线性盐梯度。
18.权利要求I至17中任一项的方法，其中使用所述反相层析步骤来选择O-糖基化EPO。
19.权利要求18的方法，其中使用有机溶剂的线性梯度来洗脱ΕΡ0。
20.权利要求19的方法，其中使用在水中O至70%乙腈的线性梯度，并且所述溶剂含有约 O. 1%TFA。
21.权利要求20的方法，其中使用在水中含有乙腈和约O.1%TFA的溶剂进行EPO的等度洗脱。
22.权利要求I至21中任一项的方法，其在所述一个或多个层析步骤之前包括超滤步骤，以及任选作为最终步骤的纳滤步骤。
23.权利要求I至20中任一项的方法，其包括下列步骤 Ca)作为捕获步骤的亲和层析步骤； (b)阴离子交换层析步骤； (c)反相(RP)层析步骤； (d)阳离子交换层析步骤； (e)尺寸排阻层析步骤； (f)纳滤步骤；以及 (g)步骤(a)、(b)和/或(e)之前的超滤步骤。
24.权利要求I至23中任一项的方法，其中所述EPO是人重组ΕΡ0。
25.权利要求I至24中任一项的方法，其中所述EPO是在CHO细胞中生产的人重组EPO。
26.通过权利要求I至25中任一项的方法纯化的糖基化EPO同种型制剂。
27.权利要求26的制剂，其中所述EPO是人重组ΕΡ0。
28.权利要求26或27的制剂，其基本上不含未O-糖基化的EPO同种型。
29.—种药物组合物，其包含权利要求27至29中任一项的EPO制剂。
全文摘要
本发明提供了红细胞生成素(EPO)，特别是高纯形式的具有确定的糖型组成、即具有大量O-糖基化EPO同种型的重组人EPO(rhEPO)的生产方法。
文档编号C07K1/16GK102712688SQ201080051883
公开日2012年10月3日 申请日期2010年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者斯特凡·阿诺德, 沃尔特·因德雷尔 申请人:百奥杰诺瑞克斯股份有限公司