专利名称：用蚕表达丙肝抗原制备口服药物的方法
技术领域：
本发明属生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。
全世界约1％人口感染丙型肝炎病毒(HCV)，约50％以上的慢性肝炎是由HCV感染引起的，世界各地的流行病学研究表明，大约90％的输血后肝炎均由HCV引起，HCV是一种十分严重的肝病，是诱发肝硬化、肝癌的重要因素。目前，我国丙肝感染者约有3000万人，还有上升的趋势。
70年代初期，美国首先发现输血后肝炎病例，既非甲肝亦非乙肝，英国发生因注射血友病因子Ⅷ浓缩剂或血透后此类肝炎的持续暴发。1975年Feinsten等首先证实这种肝炎为非甲非乙型肝炎，即丙肝(HCV)的存在。1989年，Kuo和Choo等用酵母来表达HCV的cDNA片段，与HCV病人的血清进行反应来筛选HCV抗原，发现表达产物能与HCV抗体反应，从而捕获到能表达HCV抗原的cDNA克隆，并与人体基因组和甲肝(HAV)和乙肝(HBV)没有交叉杂交。Choo和Kuo等同年用随机引物法建立了HCV的全cDNA文库，用HCV血清来筛选抗原，获得一个互补的DNA克隆，并能编码HCV抗原，证明HCV基因组为一个RNA片段，大小约10000个碱基，为正链RNA。从此揭开了HCV分子生物学研究的序幕。因为HCV在血液中含量极少，而且无法通过细胞培养获得，所以它是完全依赖于基因工程技术来研究的人类病毒之一，Reyes等1990年从慢性肝炎猕猴的血清中获得一个长为7.5Kb RNA片段，经反转录合成cDNA，经氨基酸功能分析认为其功能RNA聚合酶，并确认其来源于HCV RNA。Takamigawa等1991年报道了日本的HCV基因全序列，长为9416bp，编码一个为3010个氨基酸的大蛋白，5’端的调控序列为332个核苷酸，3’端调控序列为54个核苷酸，该HCV株与Choo报道的HCV株的核苷酸同源性为77％，并与黄病毒相似，大蛋白成熟后可形成C、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b和NS5a和NS5b等成份。其中C为外壳蛋白，E为囊膜蛋白，NS为非结构蛋白。HCV存在地区差异，并具有高度变异的特性，所以形成各个亚型。Simmonds等1993年和Mellor等1995年根据HCV基因型和NS5区的系统发生将HCV分成6个亚型。认为两者之间核苷酸相差68-79％者为亚型标准。毕胜利等报道中国HCV河北株的全序列与日本相似。河北株和台北株系，大小分别为9375bp和9425bp，属于第Ⅱ亚型。
C蛋白为21kD,E1为31kD,E2为70kD,NS2为23kD,NS3为70kD,NS4a为8kD,NS4b为27kD,NS5a为58kD,NS5b为68kD,HCV抗血清中还存在E2-NS2联合蛋白，分子量约在82至83kD。
综上所述，由于HCV的多变性，因此预防HCV，研制HCV疫苗相当困难，至今还未能成功的实例。
本发明的目的是提供一种以家蚕为生物反应器，高效表达丙肝病毒的结构基因，制备口服疫苗的方法。
本发明所述的方法以家蚕作为生物反应器，通过家蚕核型多角体病毒表达系统重组带有人的丙型肝炎病毒基因，获得重组的带丙型肝炎病结构基因的家蚕核型多角体病毒，接种家蚕幼虫、蛹和蛾进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，以家蚕血液或蛹为填充料配制成口服防治丙肝肝炎的药物。
PCR方法合成的丙肝基因片段为C+E1+E2，克隆进入pUC19的SmaⅠ位点，获得重组克隆pUCVCE，基因长为2430bp，克隆进入到pUBM-4载体中，在BmNPV多角体启动子的直接控制下，与野生病毒DNA进行共转染，通过重组空斑挑选得重组家蚕核型多角体病毒，表达量为0.5mg/蚕，0.6mg/蛹。
接种重组病毒于家蚕幼虫、蛹、蛾的高效表达丙型肝炎结构蛋白，经过分子筛和MonoQ纯化的含量为80％，分子量分别为75kD和50kD。
下面结合实施例详细描述本发明的内容用两个特异性的引物，我们扩增了河北株HCV的C+E1+E2基因，大小约2430bp。并克隆到pUC19中，重组质粒称为pUHCVCE。将重组质粒pUHCVCE进行亚克隆，并测定了全序列，序列与毕胜利报道的同源性为97％(PCR及测序技术方法详见《分子克隆》，科学出版社，1995)。将所获得的基因克隆到家蚕表达载体pUBM-4(申请人自行构建，病毒学报，1993)的EcoRⅤ和BglⅡ位点，与野生型病毒共转染，在家蚕Bm-N细胞中进行重组(病毒重组技术按Summers等方法，Texas Agricultural Experimenl Station,USA1987)。
经过12轮重组筛选，ELISA鉴定证明纯化的病毒已表达了C+E1+E2基因。PCR检测的结果，说明重组病毒已带有丙肝的C+E1+E2外源基因。该重组病毒称之为BmNPV(C+E)。
以不同量的合成肽(22肽RRGPRLGVRAPRKTSERSQPRG)。确定能抑制≥50％0.D.值作相对比较，估算抗原表达量，结果表明蛹体在感染72h后有较高的表达量。随着感染时间的延长，表达量平衡稍有降低。以72h样品经1∶10稀释后相当于肽20μg/ml抑制的O.D.值来计算，表达量为20-200μg/ml，则每蛹体表达量推算为60-600μg/ml。蚕的最高表达时间为4-5天，表达量为100-500μg/蚕。
用3万头五龄起蚕，每头人工接种重组病毒使之发病，5天后收集蚕血清共20000ml，每瓶500ml贮存于-20℃。
蚕血清先经5000rpm离心1小时，取上清在25000rpm离心30分钟，经硫酸铵沉淀后上Sephadex G100柱分离，每次收集样品均经ELISA测活，确定其活性存在，并通过阴阳性血清分别测定，筛选活性峰。
将过Sephadex G100柱的活性部分混合后，上MonoQ柱(高25cmφ=1cm)，流速0.5ml/分钟，5ml/管收集。先用20mM Tris-HCl,pH7.5缓冲液淋洗，当没有蛋白被洗脱下来时，再用75ml pH7.5 20mM Tris-HCl缓冲液+75ml含1M NaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱。据计算及ELISA结果产物的纯度在80％左右。在蚕、蛹、蛾中表达的丙肝抗原，经过过滤(100KD超滤)，30000rpm离心后经冷冻干燥后，在无菌条件下装入胶囊制成口服药物。
采用本发明所述方法制备的丙肝抗原口服药物(简称BHC)，其药效如下将BHC(含量2ml)给药8周龄SD大鼠，每只SD大鼠平均体重为200g，连续给药4周，采血后用HCV抗体检测试剂盒测抗体(检测方法按上海复华公司试剂盒操作说明书进行)，检测的结果如表1、表2所示。结果表明鼠体内产生了较强的抗体。
表1给药BHC后4周SD大鼠血的HCV抗体水平检测
表2给药BHC后4周SD大鼠的HCV抗体水平检测
将4周龄，平均体重16～18g的BalB/C小鼠，雌雄各半，每天给药(含量500μl)连续4周，每天一次4周后采血，用HCV抗体检测试剂盒检测结果如表3所示(检测方法按卫生部兰州生物制品研究所生产的试剂盒说明书进行)，结果表明雌雄个体80％以上均产生了较强的抗体水平，相当于丙肝感染者的抗体水平，说明BHC口服剂型的HCV抗原可以通过肠道被老鼠吸收，并具有抗原活性，能在体内产生较强的抗体，产生了免疫应答。
表3
检测条件酶标板为已包被好的标准丙肝测活板，一抗稀释度为1∶100，二抗稀释度为1∶3000，底物为邻苯二胺，以稀释液作对照、检测时间96.10.7。机型5001型酶标仪本发明所述的丙肝口服药物的方法与现有技术相比，原料易得，生产成本低，具有良好的预防丙型肝炎疗效，具有十分重大的市场开发应用前景。
参考文献1．M Houghton,et al.Molecular Biology of the Hepatitis C Virus.Hepatology,1991,12:381-3882．Chien DY,et al.Diagnosis of hepatitis C virus(HCV)infection using an immunodominantchimeric polyprotein to capture circulating antibodies.Proc Natl Acad SciUSA,1992,89:10011-100153．Choo QQ L,et al.Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus.Proc NatlAcad Sci,1991,88:2451-24554．Silva Cardoso M Da,et al.The serology of hepatitis C virus(HCV)infection:antibldycrossreaction in the hypervariable region l.Arch Virol.1995,140:1705-17135．毕胜利，等，中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异。病毒学报，1993,9:114-12权利要求
1．一种用蚕表达丙肝病毒蛋白制备口服药物的方法，其特征在于以家蚕幼虫、蛹和蛾作为生物反应器，将人的丙型肝炎病毒基因重组进入家蚕核型多角体病毒表达系统，获得重组的带丙型肝炎病毒结构基因的家蚕核型多角体病毒，接种家蚕幼虫、蛹和蛾进行表达，所获得的表达产物经分离纯化，冷冻干燥，以家蚕血液、蛹和蛾为填充料配制成口服防治丙型肝炎的药物或纯化产物制成注射药物。
2．根据权利要求1，所述的方法，其特征在于将PCR方法合成的丙肝C+E1+E2基因片段，克隆进入pUC19的SmaⅠ位点，获得重组克隆pUCVCE，基因长为2430bp，克隆进入到pUBM-4载体中，在BmNPV多角体启动子的直接控制下，与野生病毒DNA进行共转染，通过重组空斑挑选得重组家蚕核型多角体病毒。
3．根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于接种重组病毒于家蚕幼虫、蛹、蛾的高效表达丙型肝炎病毒结构蛋白，经过分子筛和MonoQ纯化的含量为80％，分子量分别为75kD和50kD。
4．根据权利要求1、2、3，表达所生产的丙型肝炎病毒蛋白，与家蚕血液、蛹和蛾的主要成分，经冷冻干燥后，制成胶囊或片剂经钴60灭菌，成为防治丙型肝炎的药物或疫苗。
5．根据权利要求1、2、3、4，本专利应包括任何其它途径所获得的丙肝抗原制成口服药物或疫苗的途径。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。以家蚕幼虫、蛹和蛾作为生物反应器,通过家蚕核型多角体病毒表达系统重组带有人的丙型肝炎病毒基因,将获得的重组病毒,接种家蚕幼虫、蛹和蛾进行表达,经分离纯化,冷冻干燥,制成口服预防丙型肝炎的药物,首次实现丙肝抗原口服药物的发明。与现有技术相比,原料易得,生产成本低,预防效果良好,具有十分重大的市场开发应用前景。
文档编号C12N15/51GK1218691SQ9812461
公开日1999年6月9日 申请日期1998年10月29日 优先权日1997年11月5日
发明者张耀洲, 吴祥甫, 杜广希 申请人:浙江农业大学, 中国科学院上海生物化学研究所, 浙江海宁丝绸集团有限责任公司