来自间充质饲养细胞的旁分泌信号以及使用该旁分泌信号调节肝祖细胞的扩增和分化的制作方法

专利名称：来自间充质饲养细胞的旁分泌信号以及使用该旁分泌信号调节肝祖细胞的扩增和分化的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及肝祖细胞的先体外后体内繁殖和/或分化。更具体地，本发明 涉及来自间充质细胞的可溶性旁分泌信号和不溶性旁分泌信号的识别和选择以及它们在 体外调节肝祖细胞(包括肝干细胞)的扩增和/或分化方面的应用。
背景技术：
肝干细胞和它们的后代细胞(例如，成肝细胞和定向祖细胞)具有相当大的扩增 潜力。因此，这些细胞群是用于细胞疗法的理想的候选细胞，所述细胞疗法包括生物人工肝 脏或细胞移植。尽管具有这样的前景，然而肝细胞疗法的全部潜能仍有待实现。已证实肝干细胞和它们的后代细胞的体外繁殖是富有挑战性的，部分地是因为体外培养条件对于从实验台到临床的转变并非总是最佳的。例如，一些培养条件不利于存活、 可大大阻碍细胞分裂或可促进细胞向不期望的细胞结局分化。同样，一些培养条件需要添 加因子(例如血清)，这些因子可引入污染物，从而限制了它们在治疗人类方面的应用。正常细胞(尤其是祖细胞)的维持需要间充质伴胞的饲养细胞，众所周知该饲养 细胞提供对于祖细胞的存活和功能至关重要的旁分泌信号。需要识别间充质饲养细胞的类 另|J，然后使用所述间充质饲养细胞作为模型以识别它们的旁分泌信号、细胞外基质成分和 可溶性信号，这些信号和成分介导扩增、向特定细胞结局的谱系限制或肝祖细胞向它们的 成熟细胞结局(胆上皮细胞和肝细胞)的分化。限定信号使人们能够在无饲养细胞的情形 下以合适的组合方式使用信号本身，以从肝祖细胞诱导期望的生物响应，所述生物响应包 括生存、扩增、向细胞结局的谱系限制以及向成熟肝细胞的完全分化。因此，需要限定培养 条件以便消除此前所述的饲养细胞的需求。

发明内容
在本发明的一种实施方式中，其提供体外繁殖肝干细胞而不诱导它们分化的方 法，所述方法包括在无血清培养基中和基质组分(matrix components)层上培养分离 的肝干细胞群，所述基质组分选自透明质酸、其他未硫酸化或少量硫酸化的糖胺聚糖 (GAG)、未硫酸化或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚胶原蛋白(例如III型胶原蛋白)和胚基底 粘附分子以及它们的组合物，其中所述层基本不含成熟胶原蛋白(例如I型胶原蛋白)并 且其中所述培养使所述肝干细胞繁殖而不诱导它们分化。所述基质组分中的任何一种或者全部可由成血管饲养细胞、休眠肝星形饲养细 胞、HUVEC饲养细胞或者它们的组合提供。所述基底粘附分子可包含主要在胎儿组织中发现的层粘连蛋白的亚型，并且所述GAG(非透明质酸)可以是硫酸软骨素的形式。所述肝干 细胞可以是人肝干细胞，并可从胎儿肝脏、新生儿肝脏、儿童肝脏或成人肝脏中获得。可以 约0. 1 μ g/cm2至约2 μ g/cm2的浓度提供所述层粘连蛋白，优选地，以约1 μ g/cm2的浓度提 供。类似地，III型或IV型胶原蛋白的浓度各自为约0. 1 μ g/cm2至约15 μ g/cm2。
在本发明的另一种实施方式中，其提供在体外将肝干细胞分化至成肝细胞的方 法，所述方法包括在无血清培养基中和基质组分层上培养分离的肝干细胞群，所述基质组 分选自胚胶原蛋白、基底粘附分子、CS-PG和它们的组合，其中所述层基本不含成熟胶原 蛋白并且其中所述培养使所述肝干细胞繁殖而不诱导它们分化。所述基质组分中的任何一种或者全部可由活化的内皮细胞、活化的肝星形饲养细 胞或它们两者提供。所述胚胶原蛋白可以是IV型胶原蛋白并且所述基底粘附分子可包含 层粘连蛋白的胎亚型(fetal isoform)，可以约0. 1 μ g/cm2至约2 μ g/cm2的浓度提供所述 胎亚型，优选地，以约1 μ g/cm2的浓度提供。在一些实施方式中，所述层还包含透明质酸。 所述肝干细胞可从胎儿肝脏、新生儿肝脏、儿童肝脏或成人肝脏中获得，优选地，从人肝脏 中获得。 在本发明的又一种实施方式中，其提供在体外将肝干细胞或成肝细胞分化成定向 肝祖细胞或胆祖细胞以及它们的后代细胞的方法，所述方法包括在无血清培养基中和基 质组分层上培养分离的肝干细胞群，所述基质组分选自硫酸化的蛋白聚糖、成熟胶原蛋 白、纤连蛋白以及它们的组合物，且其中所述培养诱导所述肝干细胞或成肝细胞分化为定 向肝祖细胞或胆祖细胞以及它们的后代细胞。所述基质组分中的任何一种或全部可由基质 饲养细胞、活化的肝星形饲养细胞、成肌纤维饲养细胞或它们的组合提供。在一些实施方 式中，所述层基本不含透明质酸并且所述硫酸化的蛋白聚糖可以是硫酸乙酰肝素-PG或肝 素-PG或者它们两者。在本发明的再一种实施方式中，其提供一种用于肝祖细胞繁殖或分化的容器。所 述容器包含基质组分层，该基质组分选自透明质酸、其他未硫酸化的或其他少量硫酸化的 糖胺聚糖、未硫酸化或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚胶原蛋白和胚基底粘附分子以及它们的 组合；其中所述层基本不含成熟胶原蛋白；并且其中所述基质组分层基本覆盖所述容器的 至少一个表面。可选地，所述层可包含选自胚胶原蛋白、基底粘附分子、CS-PG以及它们的组合的 基质组分，其中所述层基本不含成熟胶原蛋白；并且其中基质组分的所述层基本覆盖所述 容器的至少一个表面。最后，所述层可包含选自硫酸化的蛋白聚糖、成熟胶原蛋白、纤连蛋 白以及它们的组合的基质组分，其中所述基质组分层基本覆盖所述容器的至少一个表面。 所述容器可以是组织培养平板、生物反应器、实验用细胞或实验用芯片。同样，本领域技术人员将意识到，本发明公开的内容所依据的思想可容易被用作 设计用于实现本发明的数个目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，权利要求 被认为包括了不背离本发明的精神和保护范围的这种等同解释。


图1显示培养基中hHpSC和人成肝细胞的集落hHpSC集落(A)和人成肝细胞(B) 都表达EpCAM(显示为绿色)。NCAM(显示为红色，A)沿集落的外围区域和集落的中心表达。成肝细胞高强度地表达甲胎蛋白(AFP，显示为红色，B)。两种细胞均用DAPI (蓝色)染色。 标尺，100 μ m0图2显示hHpSC集落周围的细胞是α SMA+hHpSC 典型的人肝干细胞集落㈧对集落内部的NCAM(B，D)和在集落边缘的伴胞中的α SMA(C，D)呈阳性。放大倍数，10χ。图3显示具有成血管细胞的hHpSC的原代培养物KDR+选择的细胞在EGM-2中培 养7天表达vWF (绿色)(A和B)。⑶31+选择的细胞在EGM-2中培养4天表达vWF (绿色) 和⑶31 (红色)(C)。标尺100μπι。在培养基中成血管细胞与hHpSC集落结合(D)。放大 倍数=IOx0图4比较休眠hHpSTC与活化的hHpSTC 休眠hHpSTC表达低水平的结蛋白、 α SMA+,⑶146、I型胶原蛋白和其他基质分子(纤连蛋白、蛋白聚糖)。损伤过程(injury processes) 一例如，暴露于血清或某种因子(例如PDGF和TGF-B1) —导致hHpSTC活化并 且转变至成肌纤维细胞样基质细胞并提高了 α SMA和基质组分的产量以及释放各种生长 因子(例如HGF)。图示的是由间充质伴胞包围的hHpSC集落(成血管细胞和休眠hHpSTC) 表达低水平的CD146。在相同的平板上，邻近的集落与间充质伴胞一同显示，该邻近集落经 过激活导致产生高水平的⑶146。图5显示不同饲养细胞的形态学和免疫组织化学A :hMSC ；B :hUVEC ；C-D :4天 (C)和7天(D)的来源于人胎肝的饲养细胞；E-H 磁性免疫选择的KDR+细胞(E-F)和去成 纤维细胞的上层细胞(G-H)在无血清条件下的第11天培养物对于α SMA呈阳性(F和H)。 放大倍数10χ。图6显示在EGM-2培养基中培养8天的去成纤维细胞的上层细胞的免疫组织化 学细胞对结蛋白(B和H)、α SMA(I)、层粘连蛋白(C)、纤连蛋白(F)、I型胶原蛋白(L)和 IV型胶原蛋白(E)呈阳性，并且对内皮细胞标记物vWF(K)呈阴性。值得注意的是，表达 α SMA的细胞较表达结蛋白的细胞多。图示了每一个双重染色的相差影像(A、D、G*J)。 标尺50 μ m。图7显示与不同饲养细胞共培养的hHpSC的一些影响。A-F 单独培养hHpSC (A)， 与hUVEC共培养(B)，与hMSC共培养(C)或与人胎肝来源的饲养细胞共培养(D)。放大倍 数:10x。图8显示了与α SMA+上层细胞共培养的人hHpSC，所述α SMA+上层细胞从人胎儿 肝脏中获得，成纤维细胞已从该上层细胞中去除。这些饲养细胞的使用导致谱系限制为成 肝细胞。人肝干细胞集落上的人AFP免疫组织化学(Α和B)和在hHpSC和人胎肝来源的饲 养细胞上共培养八天的人AFP免疫组织化学(C和D)。放大倍数10x。图9显示了用于mRNA编码基质分子的标准化mRNA表达在每种细胞类型中mRNA 表达水平的倍数变化以相同细胞类型中核糖体RNA(ISS)的含量被标准化。图10显示了在纯化的基质组分的基底上hHpSC的行为在塑料或III型胶原蛋白 上hHpSC维持干细胞特性(A和B)。当在IV型胶原蛋白上或层粘连蛋白上培养hHpSC时， hHpSC谱系限制为成肝细胞(C和D)。当在I型胶原蛋白上培养hHpSC时，hHpSC进一步分 化为成熟肝细胞。D使用更高的放大倍数。图11提供分化期间hHpSC和它们的间充质伴胞在基质化学和基质受体方面的变 化。
图12提供在共培养中和在人胎肝细胞培养中产生的人细胞因子之间的比较。在 人胎肝细胞单一培养中产生的人细胞因子的浓度(pg/ml)低(上部)，在STO饲养细胞与人 胎肝细胞的共培养中产生的人细胞因子的浓度(Pg/ml)高(底部)。图13提供在共培养中和在STO饲养细胞培养中产生的小鼠细胞因子之间的比较。 在STO饲养细胞单一培养中产生的小鼠细胞因子的浓度(pg/ml)低(上部)，在STO饲养细 胞和人胎肝细胞的共培养中产生的小鼠细胞因子的浓度(Pg/ml)高(底部)。
图14显示细胞因子对rter6细胞集落形成的影响。图示了具有细胞因子和不具 有细胞因子的激素限量培养基(HDM)中大鼠肝祖细胞(rter6)的集落数量(上部)和面积 (底部，以像素表示)。
具体实施例方式在本发明的一种实施方式中，细胞外基质组分已被识别，其有利于贴附、存活、先 体外后体内繁殖以及诱导肝干细胞及其后代细胞的分化的其他基质组分。在此使用的术语 “肝祖细胞”被宽泛地定义为包含肝干细胞和它们的后代细胞。“后代细胞”可包括肝干细 胞或成肝细胞、它们两者的多能祖细胞以及仅可分化成一个谱系(导致产生特定成熟细胞 类型(例如，肝细胞))的定向祖细胞。“克隆扩增”是指细胞生长的以下性质可从单一细胞扩增并且可被继代培养和重 复扩增并保持亲代细胞的表型。“集落形成”是指二倍体实质细胞的以下性质可在一星期 或两星期内经过有限次的细胞分裂(通常5-7次细胞分裂)，并且“集落形成”涉及具有进 行继代培养或传代的有限能力的细胞。“多能”是指细胞可形成具有一种以上细胞结局的子 细胞；“单能”或“定向祖细胞”是指具有单一成熟结局的细胞。肝干细胞(HpSC)是在胎儿肝脏和新生儿肝脏的管板(ductal plate)(也称为界 板(limiting plate))以及儿童肝脏和成人肝脏的赫林氏管中发现的多能细胞，并且肝干 细胞显示出用端粒酶的表达实现自身复制的证据并且能够在移植时形成成熟肝细胞。这些 细胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/l+，并且这些细胞对所测试的所有造血 标记物(例如，⑶34、⑶38、⑶45、CD14)、间充质细胞标记物(CD 146, VEGFr、⑶31)和P450 或甲胎蛋白的表达呈阴性。已发现HpSC产生成肝细胞以及定向(单能)祖细胞。成肝细胞(HB)是在整个胎儿肝脏和新生儿肝脏的实质中发现的双能(bipotent) 细胞，该成肝细胞作为单一细胞或细胞的小聚集体固定于赫林氏管的末端。HB来源于 HpSC。HB共享HpSC上存在的许多抗原，但具有重要的差异。例如，HB不表达NCAM，反而表 达ICAMl并且HB表达大量的甲胎蛋白和胎儿P450。这些HB产生单能祖细胞、定向肝祖细 胞和胆祖细胞。定向肝祖细胞是肝谱系或胆谱系的单能祖细胞。它们的抗原轮廓(antigenic profile)与HB的抗原轮廓重叠；然而，胆定向祖细胞表达CK19但不表达AFP或ALB，而肝 定向祖细胞表达AFP和ALB但不表达CK19。定向胆祖细胞直接来源于肝干细胞且也直接来 源于成肝细胞。间充质细胞(MC)包括许多不同间充质细胞类型的处于各种不同谱系阶段的细胞 (以成熟细胞的形式列出，括号中是其前体)包括基质(间充质干细胞)、内皮(成血管细 胞)、星形细胞(星形细胞前体)以及各种不同的造血细胞(造血干细胞)。
虽然本文的大多数(如果不是全部的话)肝祖细胞的讨论和例子将涉及人源细胞 群，但本文的教导内容不应限于人。事实上，可期望本领域的技术人员将本文的教导普遍应 用于从哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗等)扩增肝祖细胞。相应地，本发明的范围预期包括 任何哺乳动物和所有哺乳动物的肝祖细胞。还应注意，根据本发明适于体外繁殖的肝祖细胞不限于那些通过任何特定方法 分离或识别的肝祖细胞。例如，用于肝祖细胞分离和识别的方法已在例如美国专利第 6，069，005号和美国专利申请第09/487，318号、第10/135，700号和第10/387，547号中描 述，通过引用将其中公开的内容全部并入本文。
肝干细胞和成肝细胞具有特有的抗原轮廓，因而可通过前面描述的方案分离。例 如，肝干细胞和成肝细胞共享许多抗原(例如，细胞角蛋白8、18和19、白蛋白、CD133/1和 上皮细胞粘附分子(“EpCAM”))并且肝干细胞和成肝细胞对造血标记物(例如，血型糖蛋 白 A、CD34、CD38、CD45、CD14)和间充质细胞标记物(例如，CD146、CD31、VEGFr 或 KDR)呈 阴性。可选地，肝干细胞和成肝细胞可通过以下方面而相互区分尺寸(肝干细胞为7μπι 至9 μ m ；成肝细胞为10 μ m至12 μ m)、在培养基中的形态学(肝干细胞形成紧密的、形态均 勻的集落，而成肝细胞形成穿插了清晰的通道、假定的小管的带状结构)、特定抗原表达模 式的差异(EpCAM在整个肝干细胞中表达但在成肝细胞中被限制在细胞表面)或不同的抗 原轮廓(在肝干细胞中存在N-CAM，而成肝细胞表达甲胎蛋白(AFP)和ICAM1)。在胎儿的 肝脏和新生儿的肝脏中，肝干细胞位于管板(也称为界板)中，而成肝细胞是实质细胞群的 主要成分(> 80% )。在儿童组织和成人组织中，肝干细胞存在于赫林氏管中，而成肝细胞 是被固定于赫林氏管的末端的细胞。在正常组织中，成肝细胞由少量细胞组成，但在患病的 肝脏(例如肝硬化)中，成肝细胞由大量细胞组成(例如节(nodule))。本发明提供在体外控制HpSC(优选为人HpSC(hHpSC))的先体外后体内维持的方 法。更具体地，本发明的方法能够繁殖HpSC(I)而不诱导分化(例如自身更新)；(2)诱导 HpSC分化(例如“谱系限制”)为成肝细胞；或(3)诱导更“广泛”的分化(例如分化为定 向祖细胞)(本文中集体称为“先体外后体内维持”)。该方法部分地是通过选择性地使用 在共培养中使用的间充质饲养细胞的特定类型而实现的。本发明还提供不溶性组分(例如 基质分子)和可溶性组分(例如细胞角蛋白)，这些组分单独或组合在一起使得HpSC繁殖， 如果优选的话，使得HpSC在不存在饲养细胞的情况下繁殖。表1总结了有关影响上述先体 外后体内维持的模式所发现的不溶性因子。
或肝星形细胞前体组成的伴胞结合时才存活。 *培养形态和抗原轮廓
hHpSC集落是具有均匀形态细胞的单层，核与细胞质的比率高，直径 ~7-9μηι,被由成血管细胞和hHpSTC组成的伴胞紧密包装和环绕。独特的抗 原轮廓NCAM+、密蛋白3+、白蛋白士、AFP-。
成肝细胞表现为更具三维形状的集落，该集落具有穿插清晰的通道(胆 小管)的带状结构并且细胞的直径略大(10-12μιη)。独特的抗原轮廊:ICAM+、 密蛋白3-、白蛋白++、AFP++,
hHpSC和成肝细胞之间共享的抗原轮廓对EpCAM、CK8, 18和19、Ihh 蛋白(sonic, India)、端粒酶呈阳性；对造血蛋白标记物(CD34、CD45、 CD38,血型糖蛋白A)、肝星形细胞标记物(结蛋白和aSMA)和内皮细胞 标记物(VEGFr、CD31、vWF )呈阴性。与上面列举的三种先体外后体内维持的模式一致的三种不同种类的饲养细胞已 被识别。与内皮细胞前体的饲养细胞或无人肝星形细胞(hHpSTC)的成血管细胞(或可选 择地包含休眠hHpSTC)的共培养允许HpSC的扩增不诱导它们分化。充满活化内皮细胞和 hHpSTC的饲养细胞将HpSC谱系限制为成肝细胞。最后，包含成熟内皮细胞或鼠科动物基质 细胞(以STO细胞代表)的饲养细胞导致HpSC分化为成熟实质细胞(包括胆细胞和肝细 胞)。目前认为，已识别的共培养行为与在肝脏发展过程中观察到的共培养行为类似，所述 共培养行为由邻近上皮细胞的间充质细胞的旁分泌信号调控。基质化学可能与胚胎发育相关。在本发明的一种实施方式中，本发明人已经发现 在肝脏的干细胞龛(niche)内或附近发现的细胞外基质组分比现有技术更好地提供用于 肝祖细胞的扩增而不诱导分化。如在2006年11月15日提交的美国专利申请第11/560，049 号中描述的(其公开的内容在此通过引用全部并入本文)，在基质组分上培养的细胞(在肝 脏的干细胞龛内或肝脏的干细胞龛附近发现大量的这种细胞)聚集以在一些基质组分(例 如层粘连蛋白)上形成类球状结构并且在其他的基质组分(例如III型胶原蛋白)上展开 为单层。在干细胞龛内发现的细胞外基质组分的特定类型是肝祖细胞以自身复制模式扩增 所必需的信号的一种，所述自身复制模式是对称的细胞分裂(子代细胞与亲代细胞相同或 几乎相同)。人们还认为，肝干细胞的成熟伴随着至少部分地引导分化的基质组分的特有组 合。一些细胞外基质组分允许肝祖细胞进行带有不对称分裂的扩增，这种扩增伴随一些分 化。其他的位于发现了完全成熟肝脏细胞的肝脏组织区域的细胞外基质组分，诱发细胞生 长抑制和细胞完全分化。所有饲养细胞产生多种基质组分，所述基质组分包括基底粘附分子(纤连蛋白 和/或层粘连蛋白)和几种胶原蛋白。纤连蛋白被证明是基质组分，其不由成血管细胞或 休眠hHpSTC表达，而由所研究的所有其他饲养细胞表达。纤连蛋白由人脐静脉内皮细胞(hUVEC)以最高水平产生，但是HpSC不很好地附着至纤连蛋白。因此，纤连蛋白存在于基质中显得与饲养细胞诱导的生物响应不相关。诱导自身 复制的饲养细胞表达III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和透明质酸(成血管细 胞、休眠HpSTC、HUVEC细胞)。诱导谱系限制为成血管细胞并且具有连续扩增的饲养细胞 产生IV型胶原蛋白和层粘连蛋白(而非III型)、一些透明质酸以及一些硫酸软骨素蛋白 聚糖(原代培养物充满活化HpSTC，由升高水平的α SMA和CD146识别)。诱导最大分化的 饲养细胞表达最大量的基质，包括高水平的I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤 连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。硫酸软骨素蛋白聚糖(CS-PG)蛋白在人成纤维样的、胎肝来源的细胞和骨髓源间 充质干细胞(hMSC)中均是明显的。这两种类型的饲养细胞导致hHpSC的谱系限制为成肝 细胞。因此，类似于CS-PG的信号至少部分地介导该过程。已经假设，干细胞龛主要是具有 很少直至没有硫酸化的糖胺聚糖(GAG)(例如透明质酸)，因此，这些最少硫酸化的CS-PG可 作为将信号最小化地提供给干细胞的障碍物。当干细胞从龛中出来时，它们与GAG和具有 较广泛的硫酸化的蛋白聚糖接触并结合生长因子，所述生长因子可在生长方面或在趋向于 各种分化细胞结局的谱系限制方面影响干细胞。在接种于STO饲养细胞上的hHpSC中观察到了最大程度的分化，在STO饲养细胞上hHpSC进入生长抑制并且分化为成肝细胞和单能祖细胞(例如，定向胆祖细胞和定向肝 祖细胞)。STO饲养细胞产生最高水平的细胞外基质蛋白质并且在产生HS-PG方面是独一
无二的。已确定I型胶原蛋白诱导最大程度的分化。已发现分化程度取决于细胞是接种于 I型胶原蛋白的上层还是嵌入在I型胶原蛋白内。实际上，在那些嵌入在胶原蛋白内的培养 物中发现了与成熟肝细胞形态上类似的细胞(图10)。这种现象可能是由I型胶原蛋白的 直接影响和经由通过I型胶原蛋白来稳定HS-PG的间接影响引起的。图11总结了在基质组分和基质受体中发现的序列变化，所述序列变化与hHpSC经 由成肝细胞最终成为成熟实质细胞的转变同时发生。因此，所界定的本发明可允许在“无饲 养细胞”的培养基中繁殖HpSC。表2提供了由所研究的不同饲养细胞产生的细胞外基质组 分的详细资料。
本发明的范围不应限于任何一种基质组分、可溶性组分或它们的组合。与此处的教导一致，本发明描述并教导任何的和所有的可溶性组分和不溶性组分以及它们的组合在 基底和培养基的生成中的应用，所述基底和培养基可被用于细胞的先体外后体内，以实现 扩增或分化。虽然下文将讨论这些组分中的大多数，但为清楚起见，层粘连蛋白、IV型胶原 蛋白和/或III型胶原蛋白仅仅作为在胚胎组织或干细胞龛内发现的或大量发现的一类细 胞外基质组分的代表被讨论。胚胎基质组分的非限制性实例包括特定类型的胶原蛋白，包括IV胶原蛋白(进 一步包括α 1、α 2、α 3、α 4、α 5、α 6)禾口 III型胶原蛋白；层粘连蛋白(包括1、Y 1、β 2、 α3、α5)；透明质酸；硫酸软骨素蛋白聚糖(PG)的各种形式或它们的糖胺聚糖链；以及硫 酸乙酰肝素-PG的各种形式或它们的糖胺聚糖链(例如某些黏结蛋白聚糖)。在成熟组织中 发现的基质组分的非限制性实例包括胶原蛋白的稳定形式(例如I型和II型胶原蛋白)、 纤连蛋白的各种形式、硫酸乙酰肝素-PG (例如神经集聚蛋白、串珠蛋白聚糖)、肝素-PG、皮 肤素-PG (例如软骨相关的硫酸皮肤素-PG)和弹性蛋白。除不溶性因子之外，可溶性生长因子和/或分化因子可影响细胞繁殖和/或分化 的速率。例如，血清的加入可减慢肝祖细胞的生长并且导致向肝细胞结局的谱系限制，同时 导致与疤痕组织形成相关的间充质细胞群(基质和内皮细胞)的快速扩增。表皮生长因子 的加入导致向肝细胞结局的谱系限制。优选地，在一些实施方式中，本文描述的基质组分结合使用无血清培养基。无血清 培养基之前是为HpSC和成肝细胞开发的并且在美国专利申请第09/678，953号中描述，该 专利申请公开的内容在此全部并入本文。本发明人已发现，白介素-Il(IL-Il)和白血病抑制因子(LIF)促进大鼠肝祖细胞 (rter6)在STO饲养细胞上部的集落形成。因为，IL-Il和LIF都是IL-6细胞因子家族的 成员，这些发现支持IL-6细胞因子家族在体外促进肝祖细胞生长的观点。EGF减缓大鼠成 肝细胞的集落形成但是增加二倍体成年大鼠肝细胞的集落形成(但具有向肝细胞的谱系 限制和对胆上皮细胞的抑制)。同样，当rter6细胞在STO饲养细胞上部生长时，TGF-β 1 增加rter6细胞的集落数量和面积，但是TGF-β 1抑制H印G2在塑料上的生长。hHpSC和STO饲养细胞的共培养诱导几种人细胞因子和小鼠细胞因子的较高表 达，主要包括炎症信号和一些已知的刺激肝生长的因子。白介素_4(IL-4)是在共培养中显 著增加的炎症细胞因子之一。在此更详细讨论这些和其他可溶性因子。不受理论约束或束缚，目前认为，本发明的基质组分和可溶性组分提供许多一般 由饲养细胞提供的存活信号、繁殖信号和/或分化信号。因此，本发明相当程度上可不需要 胚胎基质饲养细胞以维持肝祖细胞的生存能力和扩增潜力。本发明的实施方式将以非限制性实施例的方式被描述。实施例Kubota 氏培养基(KM)所有的培养物都放入KM中，KM是一种为肝祖细胞特制的无血清培养基(除非另有 说明)。该培养基在例如2000年10月3号提交的美国专利申请第09/679，663号中描述， 通过引用将该申请公开的内容全部并入本文。细胞系的来源(sourcim )
hMSC从26 岁男性捐赠者获得。hUVEC从Cam Patterson博士(University ofNorth Carolina ；Chapel Hill, NC)获得。鼠科动物胚胎基质细胞(ST0细胞)的克隆由从ATCC 获得的STO细胞制备。人肝脏组织的来源人胎肝脏(妊娠龄16-20 周)从 Advanced Biological Resources (ABR， SanFrancisco, California)获得。hHpSC的分离和培养人胎儿肝脏按照以上所述进行处理。将新鲜分离的实质细胞以5，000个细胞/cm2的接种密度放入KM中和培养塑料中或预接种的hUVEC、hMSC、ST0细胞的饲养细胞的顶部或 人胎肝来源的细胞的原代培养物中。所述细胞在加有2% FBS的KM中过夜，随后转换到在 KM中。塑料上和KM内的培养物生成被成血管细胞和未激活的hHpSTC前体包围的hHpSC集落。饲养细胞的制备所有间充质饲养细胞的原种(stock)都在培养塑料上和具有2% FBS的内皮细胞 生长培养基(EGM-2) (Cambrex,ffalkersville,MD)中培养。这些条件的唯一例外是hMSC和 成人肝来源的HpSTC，它们按照以下描述生长。所有细胞生长至汇合，用丝裂霉素C抑制生 长，然后将细胞转移至KM用于与hHpSC共培养。进一步的详细信息如下 · hMSC被接种在具有DMEM的组织培养皿上，所述DMEM添加了 1 %抗生素、抗坏血 酸、2mM左旋谷氨酸和10% FBS0 来自成年大鼠和成人肝脏的HpSTC的纯化的制备物由Dr. Yiffei Rong制备。饲 养细胞的原种在塑料上和加有5% FBS的KM中培养。· ST05饲养细胞由从ATCC获得的STO细胞克隆并在啮齿动物肝祖细胞上测试它 们的效力。ST05的冷冻原种在加有5%胎牛血清的KM中解冻并生长。 为制备人胎肝来源的间充质细胞的原代培养物，使用0. 45mg/ml IV型胶原酶和 0. 3mg/ml脱氧核酸酶酶解肝脏，然后通过十字解剖刀机械地将肝脏分离为单细胞悬浮液。 洗涤掉过量的酶之后，所述细胞进行三次持续5分钟的低速离心(20Xg)。收集上清液并且 将上清液重新悬浮于加有硒(10_9M)、1%抗生素和0. 1% BSA的RPMI-1640中。然后，所述 细胞被接种在培养塑料上和添加有10% FBS的KM中。间充质细胞在几分钟至几小时内贴 附并迅速转变为基质饲养细胞，该基质饲养细胞由活化的hHpSTC组成，活化的hHpSTC可通 过具有高水平结蛋白、⑶14和α SMA来识别。 使用单克隆抗人KDR小鼠IgGl(Cell Sciences, Canton，ΜΑ)、与磁性微珠偶 联的山羊抗鼠IgG或与磁性微珠结合的单克隆抗人CD31小鼠IgGl，通过磁激活细胞拣选 (MACS)系统从胎儿肝脏细胞悬浮液中分离KDR+细胞或⑶31+细胞。KDR+细胞和⑶31+细 胞的接种密度是20，000细胞/cm2。 根据生产商的操作指南(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)使用与磁性微珠结合的 单克隆抗人成纤维细胞小鼠IgG2a，通过成纤维细胞的阴性选择制备无基质细胞的饲养细 胞。无成纤维细胞的上层细胞的接种密度是500，000细胞/cm2。纯化的基质基底(matrix substrata)在2006年11月15日提交的美国专利申请第11/560，049号中描述了用于体外培养的基质基底的制备，该专利申请公开的内容在此通过引用全部并入本文。纤连蛋白以0. 5 μ g/cm2、l. 0 μ g/cm2或2 μ g/cm2的浓度将纤连蛋白(Sigmam， F0895)涂覆在培养皿上并接着中和至pH7. 4。层粘连蛋白在pH7. 4条件下以0. 52 μ g/cm2或1. 0 μ g/cm2的浓度将层粘连蛋白 (Sigmam, L2020)涂覆在培养皿上。III型胶原蛋白和IV型胶原蛋白以5种不同的蛋白质浓度(2. lyg/cm2、4.2yg/ cm2、6. 3 μ g/cm2、8. 3 μ g/cm2和10. 4 μ g/cm2)中的一种在培养皿上制备胶原蛋白涂层。将 基质组分以酸性缓冲液的形式添加到培养皿中。允许所述基质在37°C和5% CO2的条件下 贴附超过10小时的时间。10小时后，通过2小时的紫外照射将所述培养皿消毒并接着用 PBS漂洗三次。用pH为3的醋酸形成III型胶原蛋白(Sigma，C-3511)，用0. 5M的醋酸形 成IV型胶原蛋白(Sigma, C-5533)。 I型胶原蛋白通过添加特定比例的IOx DMEM和0. IM NaOH将 VitrogenlOO (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA)改性为液态 I 型胶原蛋白。因为气 泡可使凝胶不稳定，因而防止气泡的形成。I型胶原蛋白被用于单层细胞或作为“夹层”以 在两层胶原蛋白之间嵌入细胞。在I型胶原蛋白上的单层细胞在将0. 4ml液体I型胶原蛋白分配到6孔培养板 的每孔内之前，该液态I型胶原蛋白被保持在4°C条件下。涂覆后，所述胶原蛋白在37°C和 5% CO2的条件下凝胶化一小时。夹层(嵌入细胞)模型细胞被夹在胶原蛋白层之间。经过10小时的细胞贴附时 间后，未贴附的细胞被移除并添加第二层0.4ml I型胶原蛋白层。该系统被允许在37°C和 5% CO2的条件下凝胶化一小时以固化上层胶原蛋白。人肝祖细胞和人胎肝来源的饲养细胞的免疫组织化学培养1至2周之后，用4%的多聚甲醛固定细胞用于免疫染色。所使用的抗体如下 结合FITC 的抗人 vWF 羊 IgG (US Biologicals, Swampscott，ΜΑ)、结合PE 的抗人 CD56 (NCAM) 小鼠 IgGl、抗人 CD31 小鼠 IgGl、结合 PE 的抗人 CD54 (ICAM-1)小鼠 IgGl (BD, San Jose, CA)、抗人α SMA小鼠IgG2a、抗人I型胶原蛋白小鼠IgGl、抗人III型胶原蛋白小鼠IgGl、 抗人层粘连蛋白小鼠IgGl、抗硫酸软骨素蛋白聚糖小鼠IgM(Sigma，St. Louis, M0)、抗人 纤连蛋白小鼠 IgGl (Oncogene Research Products, Cambridge，ΜΑ)、兔抗人 IV 型胶原蛋 白 IgG(Research Diagnostics Inc.，Flanders, NJ)、大鼠抗人串珠蛋白聚糖 IgG2a(Lab Vision, Fremont, CA)、兔抗人 AFP IgG (Zymed-Invitrogen, South San Francisco, CA)、 抗人 KDR 小鼠 IgGl (Cell Sciences, Canton, MA)、Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgGl 和 Alexa Fluor 488 山羊抗 小鼠 IgG2a(Molecularobes-Invitrogen, Eugene, OR)。定量实时PCR使用RNeasy Mini RNA试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从细胞中提取总 RNA。接 着使用 superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA)将所提取的 RNA 逆转录为 cDNA。 使用下面表3所示的序列特异性引物和探针进行行实时定量PCR并通过ABI Prism 7000序 列检测系统(Applied Biosystems,Foster City, CA,USA)分析实时定量PCR。来自每种细 胞类型的核糖体RNA(ISS)被用内部对照。测定mRNA相对于18s的表达水平并使用2_ΔΔετ方法计算倍数变化。所使用的引物如下表所列 用于MdSC的“天然”饲养细胞新鲜分离的hHpSC细胞在存在成血管细胞(VEGFR2+、CD31+、CD133/1+、CD117+)和休眠hHpSTC(⑶146-低、结蛋白和aSM)的情况时(图1至图3)，该细胞先体外后体内存 活在KM中的组织培养塑料上。hHpSC的集落由在它们的侧边界彼此紧密结合的细胞构成但 该细胞具有最小的培养皿本身贴附。然而，在集落的周边(成血管细胞所处的位置)，hHpSC 贴附于培养皿上。因此，贴附或是单独通过间充质伴胞(例如成血管细胞)来实现的，或是 通过与hHpSC结合而实现的。用于樽拟“天然”饲养细胞的饲养细胞系和原代饲养细胞 制备几种形式的胚胎间充质细胞(原代培养物或细胞系)作为“天然”饲养细胞 (例如，成血管细胞和HpSTC)的模型。在KM内，在这些饲养细胞上培养hHpSC。尽管最小 化地暴露于血清对于阻止hHpSC的自发分化是必要的，但间充质饲养细胞需要来自血清的 因子来存活。为了克服这个技术困难，本发明人在培养基中接种了间充质饲养细胞的原种， 例如EGM-2(在转换为无血清培养基(例如KM)之前补充2%血清)，以用于需要饲养细胞 和hHpSC的共培养物的分析。当hHpSTC被维持在无血清培养基内时(图1-图3)，发现hHpSTC是休眠的，表达 低水平的⑶146、结蛋白和α SMA。然而，一旦暴露于血清，即使在低血清水平(1_2% )或者 在血清中维持5天，如⑶146、结蛋白和α SMA的高水平所证实的(图4)，也导致hHpSTC的 活化。hHpSTC暴露于血清也诱导胎肝细胞或免疫选择细胞(S卩，本文下面讨论的KDR+细胞 或⑶31+细胞)的原代培养物分化为hHpSTC。所测试的饲养细胞系是hMSC(图5A)、hUVEC(图5B)和鼠科动物胚基质细胞 (STO)，所述饲养细胞系通常用于培养基中ES细胞的维持。通过免疫选择从16-20周龄的人 胎肝细胞的悬浮液来制备原代培养物。利用MACS来选择表达KDR (也称为flk-l/VEGFR2) 或⑶31(也称为PECAM)的细胞或保持对于成纤维细胞呈阴性分类(negative sorting)从 而减少或消除基质细胞的细胞。整个肝脏分别包含0. 5% KDR+细胞和⑶31+细胞。这 些免疫选择的细胞群在EGM-2培养基中培养。免疫选择的KDR+细胞在培养基中迅速变化。在第一周内，细胞在形态上和抗原上 表现为成血管细胞或内皮细胞(图3D)。然而，到第二周，HpSTC占培养基的主要部分。实 际上，在11天时培养物汇合，并且大部分细胞对α SMA、hHpSTC的标记物呈阳性和对vWF、 内皮细胞的细胞内标记物呈阴性(图5F和图5H以及图61和图6K)。即使在接种前所述细 胞悬浮液被阴性分离以消除基质，仍观察到同样的现象(图5C-图5E以及图5G)。在培养基中的第一个五天，⑶31+细胞在形态上表现为铺路石样细胞并且是vWF 阳性，这表明细胞是内皮细胞。然而，在培养5-7天后，肝星形细胞(高强度表达α SMA和 结蛋白)在培养皿中占主要成分并且在9到10天时迅速达到汇合。该结果表明尽管EGM-2 是为内皮细胞特别设计的，然而EGM-2允许hHpSTC的生长。成血管细胞的饲养细胞上或hUVEC的饲养细胞上的hHpSC仍为干细胞培养塑料上和KM内(其中成血管细胞和休眠HpSTC紧密结合)的hHpSC的分离 和克隆扩增导致细胞仍为具有最小分化的hHpSC (图3)。在接种之后两周可看到hHpSC集 落并且该集落对NCAM、EpCAM,结蛋白、CK19和CLDN-3呈阳性，但对AFP呈阴性。在KM内 和hUVEC顶部或KDR+饲养细胞上培养的hHpSC紧接在分选后还保持hHpSC为具有EpCAM+、 NCAM+、ICAM-1-、AFP-、CLDN-3+ 的抗原轮廓的干细胞(图 7B)。
在活化hHpSTC上培养的hHpSC导致hHpSC在几小时内快速转变为成肝细胞(图 4)。在hMSC上、原代人胎肝基质细胞上、去成纤维细胞的原代人胎肝基质细胞上、原代 KDR+细胞上或者原代⑶31+细胞上培养的hHpSC在培养基中也在一周多后转变至成肝细 胞。在与这些饲养细胞中的任何一种共培养8-9天之后，肝祖细胞集落形态包含穿插了清 晰的通道、假定的胆小管的带状结构(图7和图8)并且所述带状结构具有指示为成肝细胞 (EpCAM+,NCAM-, ICAM-I+, AFP+)的抗原轮廓(图1)。此外，成肝细胞集落的形态更加呈三 维结构，导致当通过亮视野(图7和图8)评价时，成肝细胞集落发生折射，这可能是由多层 细胞和/或细胞外基质累积所导致的。接种在STO饲养细胞上的hHpSC
导致最大分化的饲养细胞模拟系统被证明是STO饲养细胞。接种在这些饲养细胞 上的hHpSC显著减缓它们的生长，并且从集落边缘处产生成肝细胞和定向祖细胞。通过饲养细胞的基质分子的基因表汰选择三种饲养细胞类型以代表以下三种饲养细胞维持hHpSC表型(hUVEC细 胞)；导致分化为成肝细胞(人胎肝间充质细胞和CD31+细胞的原代培养物)；或沿着肝细 胞途径导向更高级的分化(培养一周以上的胎肝来源的内皮细胞，在hHpSTC是主要细胞群 时分析)。使用实时PCR，发现编码纤连蛋白分子的I型组件的纤连蛋白mRNA是在所分析 的三种饲养细胞(尤其在hUVEC中)中最高表达的基质组分(图9)。支持hHpSC表型维 持的hUVEC饲养细胞产生IV型胶原蛋白、层粘连蛋白(α4、β 和γ 链)且极少或者不 表达I型和III型胶原蛋白、不同于上面提及的那些层粘连蛋白链的亚型或者蛋白聚糖核 心蛋白质。诱导谱系限制为成肝细胞的那些细胞(人胎肝来源的α SMA+成纤维样细胞和 ⑶31+细胞)产生I型、III型和IV型胶原蛋白、层粘连蛋白(β 、但不是V型胶原 胶原蛋白)、其他层粘连蛋白链或者所分析的蛋白聚糖核心蛋白质基因中的任何一种(磷 脂酰肌醇蛋白聚糖_3和磷脂酰肌醇蛋白聚糖_5和黏结蛋白聚糖-1和黏结蛋白聚糖_2)。通过饲养细胞的基质分子的蛋白质表达对饲养细胞进行以下七种不同的基质分子的免疫组织化学(IHC) 1型胶原蛋白、 III型胶原蛋白和IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HS-PG) (即，串珠蛋白聚糖和黏结蛋白聚糖)以及硫酸软骨素蛋白聚糖(CS-PG)。所有饲养细胞 产生细胞外基质分子的混合物，但在成血管细胞/内皮细胞的原代培养物中发现了水平 最低的总基质分子产量；其次低的是在hUVEC细胞系或者hHpSTC已被培养选择(culture select)的原代培养物。最高水平的基质分子是由STO细胞产生的。在所有饲养细胞中都 发现基底粘附分子、纤连蛋白并且在STO细胞中水平最高。感兴趣的是，之前发现III型胶 原蛋白仅在STO细胞内表达，而通过RT-PCR在其他饲养细胞内发现了 III胶原蛋白。不受理论的约束或束缚，当在包含具有整联蛋白α 4和整联蛋白i3 6、IV型胶原蛋 白、CS-PG并且无HS-PG的层粘连蛋白形式的细胞外基质上培养hHpSC时，hHpSC保持它们 的表型。诱导谱系限制为成肝细胞的基质具有高水平的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和 IV型胶原蛋白、层粘连蛋白(无α4且β 亚型无增加)、CS-PG并且无HS-PG。最后，诱导 最显著分化(即超过成肝细胞阶段)的基质也具有所提到的所有基质组分但是水平高于在 其他饲养细胞中观察到的水平。然而，这些基质均包含HS-PGS (图11)。纯化的基质分子对hHpSC和成肝细胞的影响
在KM内并在被涂覆在塑料培养皿上的以下5种基质组分的每一种上培养hHpSC 纤连蛋白、层粘连蛋白和I型胶原蛋白、III型胶原蛋白或IV型胶原蛋白。很少的hHpSC细 胞贴附在纤连蛋白上，并且那些贴附在纤连蛋白上的细胞不生长。如果在层粘连蛋白和/ 或IV型胶原蛋白上培养hHpSC或者如果在I型胶原蛋白凝胶的表面接种hHpSC，hHpSC谱 系限制为成肝细胞(图10)。当hHpSC被嵌入I型胶原蛋白内时，hHpSC分化最大，且集落 的形态和抗原轮廓与成熟肝细胞的类似。在门管周带(periportal zone)内和肝干细胞龛内的基质组分不同于那些已发现 与成熟实质细胞相关的基质组分，并且诱导不同于人肝干细胞/祖细胞的纯化亚群的生物 响应。这些差别可能提供修饰细胞响应和激活动态表达的各种信号。通过确定不同类型的 细胞外基质组分怎样在体内和体外诱导细胞活性，可在体外复制微环境以扩增和分化HpSC 群，用于患病组织的替代和恢复。除了基质蛋白质之外，饲养细胞被认为提供对于HpSC存活、繁殖和/或分化是必
需的可溶性因子(例如，细胞因子、生长因子)。相关因子 的非限制性实例列举如下 间充质细胞,条件培养某对大鼠肝相细胞,(rter6)禾Π人肝母细胞,瘤(HePG2) MM落形成的影响rter6不能在惰性底物(例如塑料)上或在细胞外基质涂覆的平板上有效地生成集落，但当接种在STO饲养细胞上时，rter6可产生集落。因此，进行实验来确定rter6细胞 在由STO饲养细胞为“条件”的培养基内可生长得怎样好。为生成“条件”培养基，饲养细胞 (ST0细胞或人胎肺成纤维细胞系(MRC5))的原种在添加了血清的培养基中生长直到汇合， 漂洗以移除任何血清，并接着转移至无血清的KM。细胞被允许在无血清培养基中生长另外 48小时，因此，用由所述饲养细胞产生的因子“调节”所述细胞。随后在试验中使用这种条 件培养基。与STO饲养细胞和STO条件培养基共培养10天的rter6细胞的集落数量与在KM 中培养的rter6细胞的集落数量相比增加2. 39倍(表4和表5)。当与MRC5饲养细胞和 STO条件培养基共培养10天时，rter6集落数量与在KM中培养的rter6细胞的集落数量相 比增加1. 57倍(表4和表5)。与STO饲养细胞相比，在无血清的HDM中，MRC5细胞表现出 促进更多的rter6细胞集落形成。在STO条件培养基中，rter6细胞在MRC5和STO两种饲 养细胞上具有相似的集落形成能力。
人肝母细胞瘤0fepG2)细胞可在未涂覆的组织培养塑料上形成集落。来自四 种不同饲养细胞类型的无血清条件培养基被用于测试H印G2细胞的集落形成，所述四种不同饲养细胞类型为(I)STO细胞；(2)MRC5细胞；(3)无限增殖的成人肝星形细胞 (h-tert-HpSC)；以及(4)原代人胎肝来源的基质细胞。与HDM相比，无血清的STO条件培 养基增加H印G2细胞的集落形成，而以MRC5细胞、h-tert-HpSC或原代人胎肝来源的基质 细胞为条件的无血清培养基抑制HepG2细胞的集落形成。在来自STO细胞,、人胎肝细胞,和二者的共培养物的条件培养某h^ ELISA在以STO饲养细胞、人胎肝来源的祖细胞以及二者的共培养物为条件的培养基上 测试23个人细胞因子、17个小鼠细胞因子和2个非物种特异性细胞因子的浓度。对于人细 胞因子而言，与人胎肝来源的祖细胞单独培养相比，在共培养中观察到可溶性白介素-1受 体 α (IL-IRa)、白介素-Ια (IL-1 a )、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、巨噬细胞趋 化蛋白_2(MCP-2)、嗜酸性粒细胞趋化因子、可溶性肿瘤坏死因子受体-2(sTNF-R2)和正常 T细胞表达和分泌的活性调节蛋白(RANTES)的浓度的增加(图12，表6)。在共培养中具有 降低浓度的细胞因子是白介素-11 (IL-Il)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨 噬细胞炎症蛋白质-I a (MIP-1 a ) ,MIP-I β、可溶性TNF受体1 (sTNF-Rl)以及肝细胞生长 因子(HGF)(图12，表6)。
对于小鼠细胞因子而言，与ST0细胞单独培养相比，在共培养中观察到白介 素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL_6、IL-10、IL-11、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白 质-la (10 -10)、干扰素-￥ (IFN-y)和脂多糖诱导CXC趋化因子(LIX)的浓度增加(图 13，表6)。在共培养中测试的任何所测试的小鼠细胞因子没有显著的浓度降低。对于非物种特异性细胞因子而言，与ST0细胞单独培养(10. 2pg/ml)相比以及与 人胎肝来源的祖细胞单独培养(22.3pg/ml)相比，在共培养(532.3pg/ml)中转化生长因 子l(TGF-3 1)增加。当与ST0饲养细胞共培养时，发现人肝干细胞分化为成肝细胞。在共培养物中的 人细胞因子和小鼠细胞因子的结合浓度(combined concentration)显示，与人胎肝细胞单 独培养相比，IL-4、IL-5、IL-10、CXC趋化因子、小鼠角化细胞源趋化因子(KC)和人IL-8、嗜 酸性粒细胞趋化因子、MCP-1和RANTES的蛋白质浓度显著增加(彡5倍且> 50pg/ml)(表 6)。可溶t牛细胞』因子对reter6细胞』集落形成和HepG2细胞』集落形成的影口向九种已发现的细胞因子被分别地添加至无血清、激素限定培养基(HDM)中并被测 试。除了培养基之外，细胞在ST0饲养层上生长并培养10天。与对照组相比，白血病抑制因 子(LIF，0. 5ng/ml)、白介素-11 (IL-11，10ng/ml)和转化生长因子-3 1 (TGF-3 1,0. 05ng/ ml)增加rter6细胞的集落数量和集落面积(图14)。没有观察到白介素_6 (IL-6)、白介 素-13(IL_13)、肝细胞生长因子(HGF)、生长相关致癌基因-a (GR0-a )、巨噬细胞炎症蛋 白质-1 a (MIP-1 a )和肿瘤坏死因子- a (TNF- a )对rter6细胞的集落形成的影响。几种细胞因子以及候选刺激分子也被分别添加入HDM和ST0条件培养基以测试它 们对H印G2细胞集落形成的影响。与对照组相比，在HDM和ST0条件培养基中，氢化可的松 增加集落形成25%。没有观察到胰岛素样生长因子-II (IGF-II)、白介素-6 (IL-6)、白介 素-ll(IL-ll)、白介素-13(IL_13)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、生长相关致癌因子(GR0 ； CXC趋化因子)、人生长激素以及高密度脂蛋白对IfepG2细胞集落形成的影响。转化生长因 子l(TGF-0 1)抑制H印G2细胞的生长和存活。表皮细胞生长因子(EGF)显著降低H印G2 集落形成并且导致细胞从集落迁离。总之，本发明能够在不存在饲养细胞的情况下使HpSC存活、繁殖和/或控制分化。 下表7列出了用于体外以及先体外后体内繁殖HpSC的“无饲养细胞”条件的非限制性实例。 所有的实例包括透明质酸，透明质酸普遍存在于体内肝脏的干细胞龛内。目前认为，透明质 酸提高HpSC繁殖的效率。然而，这些实例不应被解释为需要在体外培养HpSC时存在透明 质酸。参见，例如，2007年3月7日提交的美国临时专利申请第60/893，277号，其所公开的 内容在此通过引用全部并入本文。
这样，移植细胞避免了整个器官一起替换。而且，例如生物反应器的体外装置可与 被包裹在适当细胞外基质和可溶性信号环境中的肝祖细胞一起被接种，因此肝祖细胞使装 置分空间(subcompartment)群聚活组织结构。这样，生物人工装置可被用于药理学研究、 疫苗研发以及作为器官衰竭和器官移植之间的桥梁。实际上，从这些研究中所得到的结果 表明，使用这些细胞可以是改善细胞资源局限性的途径，细胞资源局限性目前抑制细胞疗 法和生物反应器装置治疗选择。虽然本发明已经描述了与其相关的特定具体实施方式
，将被理解的是，本发明能 够被进一步修改并且本发明有意覆盖任何变化、用途或者本发明的后续修改。总体上，本发 明的原则和对本发明公开的内容作的变更(如在本发明所属的技术领域的公知或惯例范 围内作的变更以及在可能被应用的必要特征上作的变更)在上文中已阐述，所附的权利要 求的保护范围如下所述。
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权利要求
一种体外繁殖肝干细胞而不诱导所述肝干细胞的分化的方法，所述方法包括在无血清培养基中和基质组分层上培养分离的肝干细胞的细胞群，所述基质组分选自透明质酸、其他未硫酸化的糖胺聚糖(GAG)或其他少量硫酸化的糖胺聚糖(GAG)、未硫酸化的蛋白聚糖或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚胶原蛋白和胚基底粘附分子以及它们的组合物，其中，所述层基本不含成熟胶原蛋白，并且其中所述培养使肝干细胞繁殖而不诱导它们的分化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基质组分中的任何一种或全部由成血管饲养 细胞、休眠肝星形饲养细胞、HUVEC饲养细胞或它们的组合提供。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胶原蛋白是III型胶原蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述成熟胶原蛋白是I型胶原蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述基底粘附分子包含主要在胎儿组织中发现的 层粘连蛋白的亚型。
6.如权利要求1所述的方法，其中，除透明质酸外的所述GAG是硫酸软骨素的形式。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白聚糖是硫酸软骨素蛋白聚糖(CS-PG)的形式。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝干细胞从胎儿肝脏、新生儿肝脏、儿童肝脏 或成人肝脏中获得。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述肝脏是人的肝脏。
10.如权利要求5所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度为约0.1 u g/cm2至约 2 u g/cm2。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述层粘连蛋白的浓度为约lyg/cm2。
12.如权利要求3所述的方法，其中，所述III型胶原蛋白或IV型胶原蛋白各自的浓度 为约 0. 1 P g/cm2 至约 15 u g/cm2。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述层包含透明质酸。
14.一种在体外分化肝干细胞为成肝细胞的方法，所述方法包括在无血清培养基中 和基质组分层上培养分离的肝干细胞的细胞群，所述基质组分选自胚胶原蛋白、基底粘附 分子、CS-PG和它们的组合物，其中，所述层基本不含成熟的胶原蛋白，并且其中所述培养使所述肝干细胞繁殖而不 诱导它们的分化。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述基质组分中的任何一种或全部由活化的内 皮细胞、活化的肝星形饲养细胞或它们两者提供。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述胚胶原蛋白是IV型胶原蛋白。
17.如权利要求14所述的方法，其中，所述基底粘附分子包含层粘连蛋白的胎亚型。
18.如权利要求14所述的方法，其中，所述层还包含透明质酸。
19.如权利要求14所述的方法，其中，所述肝干细胞从胎儿肝脏、新生儿肝脏、儿童肝 脏或成人肝脏中获得。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述肝脏是人的肝脏。
21.一种在体外分化肝干细胞或成肝细胞为定向肝祖细胞或胆祖细胞以及它们的后代 细胞的方法，所述方法包括在无血清培养基中和基质组分层上培养分离的肝干细胞的细胞群，所述基质组分选自硫酸化蛋白聚糖、成熟胶原蛋白、纤连蛋白以及它们的组合物，并 且其中，所述培养诱导肝干细胞或成肝细胞分化为定向肝祖细胞或胆祖细胞以及它们的 后代细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述基质组分中的任何一种或全部由基质饲养 细胞、活化的肝星形饲养细胞、成肌纤维饲养细胞或它们的组合提供。
23.如权利要求21所述的方法，其中，所述成熟胶原蛋白是I型胶原蛋白。
24.如权利要求21所述的方法，其中，所述层基本不含透明质酸。
25.如权利要求21所述的方法，其中，所述肝干细胞从胎儿肝脏、新生儿肝脏、儿童肝 脏或成人肝脏中获得。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述肝脏是人的肝脏。
27.如权利要求21所述的方法，其中，所述硫酸化蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素-PG或肝 素-PG，或者它们两者。
28.一种用于肝祖细胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基质组分层，所述基质组分选自透明质酸、其他未硫酸化的糖胺聚糖(GAG)或其 他少量硫酸化的糖胺聚糖(GAG)、未硫酸化的蛋白聚糖或少量硫酸化的蛋白聚糖、胚胶原蛋 白和胚基底粘附分子以及它们的组合物；其中，所述层基本不含成熟胶原蛋白；并且其中，基质组分的所述层基本覆盖所述容器的至少一个表面。
29.如权利要求1所述的容器，其中，所述容器是组织培养平板、生物反应器、实验用细 胞或实验用芯片。
30.一种用于肝祖细胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基质组分层，所述基质组分选自胚胶原蛋白、基底粘附分子、CS-PG以及它们的组 合物，其中，所述层基本不含成熟胶原蛋白；并且其中，基质组分的所述层基本覆盖所述容器的至少一个表面。
31.一种用于肝祖细胞繁殖的容器，所述容器包括(a)容器，和(b)基质组分层，所述基质组分选自硫酸化蛋白聚糖、成熟胶原蛋白、纤连蛋白以及 它们的组合物，其中，基质组分的所述层基本覆盖所述容器的至少一个表面。
全文摘要
本发明提供一种通过使用特定类型的间充质饲养细胞或由那些细胞产生的一种或一种以上旁分泌信号在体外控制肝祖细胞的生存、繁殖和/或分化的方法。
文档编号C12N5/02GK101868533SQ200880102251
公开日2010年10月20日 申请日期2008年6月13日 优先权日2007年6月15日
发明者乔舒亚·乌罗尼斯, 兰德尔·E·麦克莱兰, 埃利亚内·沃蒂耶, 姚兴磊, 洛拉·M·里德 申请人:北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校