用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法

用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法
【专利说明】用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法 发明领域
[0001] -般地，本发明关注用抗VEGF抗体治疗疾病和病理疾患。更具体地，本发明关注与 一种或多种别的抗肿瘤治疗剂组合，使用抗VEGF抗体治疗易患上或诊断有成胶质细胞瘤的 人患者。
[0002] 发明背景
[0003] 胶质瘤占所有恶性脑和CNS肿瘤的81%。特别地，成胶质细胞瘤（多形性成胶质细 胞瘤(GBM);世界卫生组织(WHO) IV级星形细胞瘤）占恶性胶质瘤的60 %至70 %，而且仍然是 胶质瘤中最具攻击性的亚型。它大多在成人中发生(诊断时的中值年龄:64岁），而且它在美 国的发病率估算是3.05/100,000。鉴于1年和5年总体存活分别为29%和3%，成胶质细胞瘤 的预后仍然是特别差的（美国中枢脑肿瘤登记(2005)(CBTRUS; http: //Vww. cbtrus. org))。
[0004] 虽然成胶质细胞瘤的治疗取得了一些进展，但是运种疾病呈现高度未满足的医疗 需求，只有有限的治疗选项。特别地，贝伐珠单抗（Avastin坂）（一种祀向促血管发生性血 管内皮生长因子(VEG巧的单克隆抗体)具有显著的治疗潜力。
[000引发明概述
[0006] 本发明提供用于治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者(包括新诊断有成胶质细胞瘤的 患者）的方法和试剂盒。
[0007] 在一个方面，本发明提供治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对该患 者施用包括有效量的抗VEGF抗体，有效量的化疗剂，和有效量的放疗的疗法，其中与在没有 抗VEG巧亢体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，该治疗延长患者的中值总体存 活(OS)时间。
[0008] 在另一个方面，本发明特征在于有效量的抗VEGF抗体，化疗剂，和放疗在制备药物 中的用途，该药物用于与在没有抗VEG巧亢体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者 相比延长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间。
[0009] 在另一个方面，本发明特征在于一种组合物，其包含有效量的抗VEGF抗体，化疗 剂，和放疗，供与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比延 长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间的方法中使用。
[0010] 在任一上述方面的一些实施方案中，患者可W具有含2的W册性能状态。在一些实 施方案中，化疗剂可W是替莫挫胺(temozolomideKTMZ)。在一些实施方案中，TMZ的有效量 可W是150mg/m 2，任选口服施用。在一些实施方案中，TMZ的有效量可W是200mg/m2，任选口 服施用。在一些实施方案中，放疗可W W2Gy施用。在一些实施方案中，抗VEG巧亢体可W结合 A4.6.1表位。在一些实施方案中，抗VEGF抗体可W是贝伐珠单抗(be vac izumab)。在一些实 施方案中，抗VEGF抗体可W包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中VH可W具有氨基酸序 列
[001引（SEQ ID N0:2)且化可W具有氨基酸序列
[0016] (SEQ ID N0:1)。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的有效量可W是约lOmg/kg(例如 lOmg/kg)，任选每两周静脉内施用，而且可W是例如最初在90分钟里静脉内施用，后续输注 在60分钟里，然后在30分钟里。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的有效量可W是约15mg/kg (例如15mg/kg)，任选每两周静脉内施用，而且可W是例如最初在90分钟里静脉内施用，后 续输注在60分钟里，然后在30分钟里。在一些实施方案中，可W在第一个周期第一个对患者 施用抗VEGF抗体，而且任选地，抗VEGF抗体的任何后续施用可W在化疗剂之前或之后。在另 一个实施方案中，可W与化疗剂和任选的放疗并行施用抗VEG巧亢体。在一些实施方案中，可 W中止对患者施用类固醇。在一些实施方案中，成胶质细胞瘤是前神经(proneural)亚型 的。在一些实施方案中，成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
[0017] 在上文所述方法，用途，和组合物中，与在没有抗VEG巧亢体的情况下接受化疗剂的 成胶质细胞瘤患者相比，中值OS时间可W延长约4.9个月，危害比化R)等于约0.42。在另一 个实施方案中，与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，中值 OS时间可W延长约4.9个月，HR为约0.24至约0.72。在另一个实施方案中，与在没有抗VEGF 抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，中值OS时间可W延长至少5个月或更 多，HR为约0.24至约0.72。在上文所述方法的一些实施方案中，患者可W小于65岁。在上文 所述方法的其它实施方案中，患者可W等于或大于65岁。
[0018] 在另一个方面，本发明提供试剂盒，其包括本质上结合表位A4.6.1的抗VEGF抗体， 化疗剂，和印有治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的说明书的包装插页或标签，包括对患者 施用有效量的抗VEGF抗体和化疗剂，其中与在没有抗VEG巧亢体的情况下接受化疗剂的成胶 质细胞瘤患者相比，治疗延长患者的中值OS时间。在运个方面的一些实施方案中，患者可W 已经接受过两种或少数在先抗癌方案。在运个方面的一些实施方案中，抗VEGF抗体可W是 贝伐珠单抗。在运个方面的一些实施方案中，成胶质细胞瘤是前神经亚型的。在运个方面的 一些实施方案中，成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
[0019] 附图简述
[0020] 图1是一幅图，显示实施例1中更为详细公开的两分支HI期研究设计治疗顺序。研 究治疗始于成胶质细胞瘤削体手术或活检之后4至7周且包括3个不同阶段:并行阶段，期间 与替莫挫胺(TMZ)和放疗组合每两周施用lOmg/kg贝伐珠单抗或安慰剂，继W28天治疗休 息；维持阶段，期间与TMZ组合每两周施用lOmg/kg贝伐珠单抗或安慰剂；和单一疗法阶段， 期间每=周施用15mg/kg贝伐珠单抗或安慰剂直至疾病进展。
[0021] 图2A是一幅图，显示具有前神经(PN)型成胶质细胞瘤的评估患者的无进展存活 (PFS)的KapIan Meier曲线，所述患者来自图1中概述的III期AvaGliO试验中的安慰剂和贝 伐珠单抗治疗分支。n = 99。
[0022] 图2B是一幅图，显示具有前神经(PN)型成胶质细胞瘤的评估患者的总体存活(OS) 的Kap 1 an Meier曲线，所述患者来自图1中概述的III期AVaG 1 iO试验中的安慰剂和贝伐珠 单抗治疗分支。n = 99。
[0023] 图3是一幅图，显示来自HI期AvaGlio试验的治疗分支的具有PN(n = 95)和非PN(n = 235)型成胶质细胞瘤的患者的OS,通过多变量分析为已知的临床预后因子进行了调整。 对于具有IDHl野生型PN成胶质细胞瘤的患者，将贝伐珠单抗添加至RT和化疗治疗在延长OS 方面赋予统计学显著的受益化R:0.42,95%CI:0.24-0.72，p = 0.002;PN亚型和贝伐珠单抗 治疗之间的相互作用:P = 0.012) Dn = 10位IDHl突变阳性患者和n = 9位协变量信息缺失患 者排除在多变量Cox比例风险分析之外。图3是基于图4A和4B中所示相同多变量分析的汇 总。
[0024]图4A是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有 化mips分类的PN亚型成胶质细胞瘤的患者的显著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[002引图4B是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有 化i Ilips分类的非PN亚型成胶质细胞瘤的患者没有显示显著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[0026] 图5A是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有TCGA分 类的PN亚型成胶质细胞瘤的患者的显著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[0027] 图5B是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有TCGA分 类的非PN亚型成胶质细胞瘤的患者没有显示显著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[002引发明详述
[0029] I.定义
[0030] 术语"抗血管发生剂"或"血管发生抑制剂"指或是直接或是间接抑制血管发生 (angiogenesis)，血管生成（vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物质，多 核巧酸，多肤，分离的蛋白质，重组蛋白，抗体，或其缀合物或融合蛋白。应当理解，抗血管发 生剂包括那些结合并阻断血管发生性因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管 发生剂是说明书全文定义的或本领域已知的血管发生剂的抗体或其它括抗剂，例如但不限 于VEGF-A的抗体，VEGF-A受体(例如KDR受体或Fl t-1受体）的抗体，VEGF陷阱，抗PDGFR抑制 剂诸如Gleevec?(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血 管他下（angi OStat in)，内皮他下（endo S tat in)等。参见例如Klagsbrun and D ' Amore , Annu.Rev.曲ysiol53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179 (2003)(例如列举恶性黑素瘤中的抗血管发生疗法的表3) ;Ferrara&Alitalo ,Nature Medicine 5:1359-1364(1999);Tonini et al. ,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列举 已知的抗血管发生性因子的表2);及Sato. Int. J. Cl in. Oncol.，8: 200-206 (2003)(例如列 举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
[0031] 本文中的术语"抗体"W最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克 隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体），和抗体片段，只要它们展现出期 望的抗原结合活性。
[0032] 术语"VEGf或"VEGF-A"用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的 121个，145个，189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如例如Leung et al.， Science,246:1306(1989);及Houck et al.，Mol.化docrin. ,5:1806(1991)所述，及其天然 存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和 PlGF在内的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶，即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另 夕h神经拉蛋白-1已经被鉴定为肝素结合VEGF-A同种型（i SOf orm)的受体，而且可在血管发 育中发挥作用。术语"VEGF"或"VEGF-A"还指来自非人物种诸如小鼠，大鼠或灵长类动物的 VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠 VEGF。通常， VEGF指人VEGF。术语"VEGF"还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基 酸8-109或1-109的多肤的截短形式或片段。本申请中可能通过例如"VEGF(8-109r ,"VEGF (1-109)"或"VEGF165"来鉴别任何此类形式VEGF的提述。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置 如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸)也是天 然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Fl t-1受体 的结合亲和力。
[003引"抗VEGF抗体"指W足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常会具 有对VEGF的结合亲和力，例如，该抗体可W W介于IOOnM-IpM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲 和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法（诸如PCT申请公开文本No. W02005/ 012359中所记载的BIAcore测定法）；酶联免疫吸附测定法化LISA);和竞争测定法（例如 RIA)来测定。在某些实施方案中，本发明的抗VEG巧亢体可用作治疗剂，用于祀向和干扰其中 设及VEGF活性的疾病或疾患。还有，可对该抗体进行其它生物学活性测定法，例如为了评估 其作为治疗剂的效力所进行的生物学活性测定法。此类测定法是本领域已知的，而且取决 于抗体的祀抗原和预定用途。例子包括册制测定法;肿瘤细胞生长抑制测定法(如例 如WO 89/06692中所记载的）；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性 (CDC)测定法(美国专利No. 5,500,362);及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗 VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子， 诸如 P1GF，PDGF 或 bFGF。
[0034]抗VEGF抗体。贝伐珠单抗"（Bevacizumab;BV或Bev)是依照Pres1:a et al. ,Cancer Res. 57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，也称作"rhuMAb VEGF"或 "AVAST的⑧''。它包含突变的人IgGl框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A. 4.6.1 (其阻 断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗大约93%的氨基酸序列(包 括大部分框架区）衍生自人IgGl，而约7%的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐珠单抗具有约 149，000道尔顿的分子量且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No. 6，884，879和WO 2005/044853中记载的抗体。
[003引"表位A4.6. r指受抗VEGF抗体贝伐珠单抗（AVASTIN? )(参见Muller et曰1.， Struc化re 6:1153-1167，1998)识别的表位。在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括 但不限于与由杂交瘤ATCC皿10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克 隆抗体；依照Pres1:a et al.,(Mincer Res.57:4593-4599,1997生成的重组人源化抗VEGF单 克隆抗体。
[0036]依照本发明的"功能性表位"指抗原中有力地促进抗体结合的氨基酸残基。抗原中 贡献巨大的残基中任一个的突变(例如，丙氨酸对野生型VEGF的突变或同系物突变)会破坏 抗体的结合，使得抗体的相对亲和力比（I巧0突变型VEGF/I巧0野生型VEGF)会大于5(参见 W02005/012359的实施例2)。在一个实施方案中，相对亲和力比是通过溶液结合隧菌体展示 ELISA测定的。简言之，将96孔Maxiso巧免疫板(NUNC)用Fab形式的待测试抗体WPBS中化g/ ml的浓度于4°C包被过夜，并用PBS，0.5%BSA，和0.05%Tween20(PBT)于室溫封闭2小时。首 先将展示hVEGF丙氨酸点突变体(残基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的隧菌体在PBT中 的连续稀释液在化b包被的板上于室溫溫育15分钟，并用PBS，0.05%Tween20(PBST)清洗 板。用在PBT中1:5000稀释的抗M13单克隆抗体辣根过氧化物酶(Amersham陆armacia)缀合 物检测所结合的隧菌体，用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB，Kirkegaard&Perry Labs， Gaithersburg, MD)底物显色大约5分钟，用1.0 M曲P〇4泽灭，并W分光光度法于450皿读数。 IC50值的比（I巧0，ala/IC50，wt)代表了结合亲和力的降低倍数(相对结合亲和力）。
[0037] 抗VEGF抗体雷尼珠单抗(Ranibizumab)或LUCENT1S坂抗体或rhuFab V2是一种 人源化的亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。雷尼珠单抗是通过大肠杆菌表达载体中的标准 重组技术方法和细菌发酵生成的。雷尼珠单抗不是糖基化的且具有约48,000道尔顿的分子 量。参见WO 98/45331 及US 2003/0190317。
[0038] "分离的"抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然 环境的污染性成分指会干扰该抗体的研究，诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其 它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至（1)根据例如 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，（2)足W通过使 用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性 或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染剂，达到同质。既然抗体天然环 境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗 体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
[0039] "天然抗体"指通常由两条相同的轻化)链和两条相同的重化)链构成的约150,000 道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫化物连接的 数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二 硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(Vh),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个 可变域(化），而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻 链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间 形成界面。
[0040] 抗体的"可变区"或"可变域"指抗体重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可 W称为"VH"。轻链的可变域可W称为"VL"。运些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗 原结合位点。
[0041] 术语"可变的"指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗 体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作高变区化VR)的S个区段。可变域中更加高度保守的部 分称作框架区（FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取0-片层构 象，通过S个HVR连接，HVR形成连接0-片层结构的环且在有些情况中形成0-片层结构一部 分的。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR-起促成抗体 的抗原结合位点的形成（参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,化tional Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接参 与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的毒性中的 参与。
[0042] 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白）的"轻 链"可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(A)。
[0043] 根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋 白有五大类：IgA, I神，I姐，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgGi， 1邑62，1邑63，1邑64，1邑41和1邑42。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作〇,5,6， 丫和y。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和=维构造是众所周知的，一般性描述于例如 At)bas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体 可W是抗体与一种或多种其它蛋白质或肤共价或非共价联合而形成的更大融合分子的一 部分。
[0044]术语"全长抗体"，"完整抗体"和"完全抗体"在本文中可互换使用，指基本上完整 形式的抗体而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
[004引"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包 括化b，'，F(ab '）2和Fv片段;双抗体(diabody);线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段 形成的多特异性抗体。
[0046] 用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，各自具有 一个抗原结合位点，及一个剩余的"Fe"片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处 理产生一个F(ab '）2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
[0047] "Fv"是包含完整抗原结合位点的最小限度抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv 种类由紧密，非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv (SCFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可W通过柔性肤接头共价连接，使得轻 链和重链可W W与双链Fv种类类似的"二聚体"结构联合。正是在运种构造中，每个可变域 的S个HVR相互作用而在VH-化二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR-起赋予 抗体W抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的S个HVR的 半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
[0048] Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域 (CHl) "Fab'片段与化b片段的不同之处在于重链CHl结构域的簇基末端增加了少数残基，包 括来自抗体较链区的一个或多个半