一种针对胶质瘤细胞及其依赖血管的药物递送系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物制剂领域，涉及靶向递送药物系统，具体涉及一种将化学药物包载于递药系统内部，通过表面修饰功能性的靶向分子达到特异性递药的靶向递药系统。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了脑部肿瘤是中枢神经系统常见的恶性疾病，而其中脑胶质瘤是发病最广，恶性程度最高，治疗难度最大以及术后易复发的脑部肿瘤。据统计，脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的46%。世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35?54岁患者的第3位死亡原因。胶质细胞瘤偏良性者生长缓慢，病程较长，自出现症状至就诊时间平均两年；恶性者瘤体生长快，病程短，自出现症状到就诊时多数在3个月之内，70%?80%多在半年之内。目前临床上针对脑胶质瘤的主要治疗方法仍以手术切除、化学疗法以及放射疗法为主。虽然这些方法能一定程度的缓解患者症状，但手术切除常有肿瘤残余，并在短时间内引起肿瘤的强势复发，而化学疗法以及放射疗法在对肿瘤部位杀伤的同时，也对正常部位有着很大的损害。因此，探寻一种安全有效的治疗方式，在获得良好治疗效果的同时减少因治疗而引起的副作用，成为胶质瘤治疗的热点。
[0003]建立在生物可降解材料基础上的纳米载体，具有诸多优点:生物相容性好，粒径小使其可充分利用肿瘤血管的高渗透性和滞留效应从而选择性的在肿瘤部位聚集，载药量高以及能够在体内长时间循环等。此外，通过在纳米粒表面连接具有靶向性的分子，能够达到靶向递药的目的，在增大疗效的同时，也大大降低了毒副反应。人音猬因子是一种广泛表达于多种肿瘤细胞(脑胶质瘤等)和少量表达在新生血管细胞的受体，而在正常组织细胞中几乎不表达。多肽CVNHPAFAC(C肽)是采用噬菌体技术获得的特异性多肽，其能高效靶向肿瘤细胞上高表达的人音猬因子。血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)，是一种熟知且广泛表达于新生血管内皮细胞的受体，随之发现的HTMYYHHYQHHL(K237肽)已被多种研究证明具有很好的肿瘤新生血管靶向性。近年来有研究表明，在较低级数脑胶质瘤中，除新生血管夕卜，同时有较多拟态血管(Vasculogenic Mimicry, VM)的存在，与新生血管不同，VM不由内皮细胞构成，而是由肿瘤细胞直接分化形成。因此，一般抗新生血管的药物虽然能够破坏和抑制肿瘤中新生血管及形成，但VM的存在能够继续供给肿瘤所需营养，从而降低抗肿瘤的效果，甚至引起肿瘤的复发。已有研究表明，VEGFR-2在拟态血管的形成和生长过程中起到关键作用，因而，K237肽能够起到VM靶向作用。有研究利用氨基酸序列GYG将CVNHPAFAC与K237肽连接成为一种新的功能靶向分子CK肽，该多肽不仅能够同时靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞，同时能够特异性的针对肿瘤中的拟态血管递送化疗药物，这为现有多种靶向递药系统所不具备。
[0004]本申请的发明人拟提供一种新型多肽修饰载紫杉醇的纳米递药系统，以达到靶向脑胶质瘤细胞及其新生血管和拟态血管的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是构建一种新型多肽修饰载紫杉醇的纳米递药系统，通过靶向杀灭脑胶质瘤细胞及诱导脑胶质瘤生长所依赖血管凋亡而最终达到抗脑胶质瘤的目的。
[0006]本发明以可降解以及生物相容性好的聚乳酸为材料，广谱性抗肿瘤药紫杉醇为模型药制备成大小均一的纳米载药系统，同时在其表面通过共价连接的方式修饰CK肽，以达到靶向脑胶质瘤细胞及其新生血管和拟态血管的目的。
[0007]本发明所采用的模型药物为广谱性抗癌药物紫杉醇(PTX)，可通过市场渠道获得；所述的紫杉醇通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。
[0008]本发明所采用的多肽为两种不同多肽的结合体，其中一种以人音猬因子为受体，其序列为CVNHPAFAC(C肽)；另一种多肽的受体为血管内皮生长因子受体_2 (VEGFR-2)，其序列为 HTMYYHHYQHHL-NH2 (K237 肽)。
[0009]本发明所涉及的音猬因子在多种肿瘤的发生过程中起到重要的作用，其在肿瘤细胞中大量的存在并少量分布于肿瘤新生血管内皮细胞；VEGFR-2在肿瘤新生血管内皮细胞具有大量的表达，同时也存在于拟态血管中；通过GYG的连接，将K237肽与C肽结合后修饰在纳米递药系统的表面，不仅能够发挥C肽对胶质瘤细胞的靶向功能以及增强对脑胶质瘤中新生血管靶向性，而且能够特异性的靶向肿瘤中的拟态血管。
[0010]本发明经体内体外实验结果表明，制备的递药系统具有很强的靶向特性以及显著的抗肿瘤效果。
[0011]本发明中，以人源母胶质瘤细胞U87为肿瘤细胞模型，人脐静脉内皮细胞HUVEC为新生血管内皮细胞模型，此两种细胞均为本领域所公认且熟知。
[0012]更具体的，本发明提供的针对肿瘤细胞和肿瘤依赖血管的药物递送系统，其特征在于，以羧基聚乙二醇聚乳酸(C00H-PEG-PLA)为材料制备成大小一致的载药系统，其表面的聚乙二醇增加递药系统在体内的循环时间，将靶向功能分子通过共价连接的方式与载药系统表面的羧基相连，达到靶向递药的目的。
[0013]本发明中，靶向功能分子是一种对胶质瘤具有强亲和性的多肽(文中以CK肽命名)，其氨基酸序列如下所示:
[0014]CVNHPAFACGYGHTMYYHHYQHHL-NH2
[0015]所述的靶向功能分子的受体广泛分布于脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管细胞及拟态血管。
[0016]本发明中，所述羧基聚乙二醇(COOH-PEG)的分子量为2000_8000Da ;所述羧基聚乙二醇聚乳酸(C00H-PEG-PLA)的分子量为20000_50000Da ;本发明的一个实施例中，采用单甲氧基聚乙二醇聚乳酸(MPEG-PLA)，其分子量为20000-50000Da。
[0017]本发明提供了该递药系统的制备方案，其包括，采用乳化溶媒蒸发法的制备本递药系统大小一致的纳米制剂，其中，所用水相介质包括，以质量体积比为1:100的胆酸钠溶液作为乳化剂中的水相，以及质量体积比为0.5:100的胆酸钠水溶液作为分散介质的水相；超声条件为:超声时间2.4min,间隔2s，功率240W，在冰水浴条件下进行，制得的本递药系统的粒径在100-200nm之间，其具有良好的粒径分布。
[0018]本发明提供了该系统体内外定性定量表达的结果以药效学的评价。
[0019]本发明通过细胞特异性摄取，体内药效学试验表明，该递药系统能够特异性的在胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞中聚集，并对靶向细胞有特异性的杀伤作用；活体成像技术以及药效学评价也显示，该递药系统具有良好的体内肿瘤靶向性以及明显的抗肿瘤效果。
[0020]本发明所制得的靶向递药系统其给药方式为静脉注射。
[0021]本发明根据肿瘤血管的渗透和滞留效应以及在已有研究基础上，构建了一种可靶向脑胶质瘤递药的载药系统。本递药系统以生物可降解，体内相容性好的聚乳酸为原料制成的纳米制剂(NP)，通过在其表面修饰聚乙二醇延长在体内的循环时间，同时采用共价连接的方式，在其表面修饰靶向功能分子达到靶向递药的目的；经体内外实验表明，本递药系统能特异性的在肿瘤部位聚集，具有显著的抗肿瘤效果，显示了其在临床应用上的广大前旦
ο
【附图说明】
[0022]图1是递药系统的粒径分布图，
[0023]图A、B分别为NP及CK-NP的粒径分布图。
[0024]图2是HUVEC细胞对载香豆素纳米粒摄取的定性和定量结果，
[0025]图A是HUVEC细胞对NP及CK-NP 二种载香豆素纳米粒的定性摄取图片，图B为定量结果。
[0026]图3是U87细胞对载香豆素纳米粒摄取的定性和定量结果，
[0027]图A是U87细胞对NP及CK-NP 二种载香豆素纳米粒的定性摄取图片，图B为定量结果。
[0028]图4是载紫杉醇纳米粒体外抗肿瘤拟态血管的定性和定量结果，
[0029]图A为明场拍摄的定性照片，图B是通过计算所得的定量抑制结果。
[0030]图5是采用活体成像技术所拍摄的载DIR纳米粒的组织分布图，
[0031 ]图A、B分别为NP及CK-NP在荷瘤小鼠体内的分布图。
[0032]图6是载紫杉醇靶向递药系统对荷瘤动物的药效学评价结果。
【具体实施方式】
[0033]实施例1载紫杉醇靶向递药系统