绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途
【专利摘要】本发明提供了绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途。本发明绿原酸具有抑制少突胶质细胞瘤的功效，并能抑制脑肿瘤干细胞的生长，能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗少突胶质瘤新的药物治疗手段和选择。
【专利说明】绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 近年来，癌症的死亡率已跃居国内各种死因之首。可能与抽烟、人口老龄化、工业 化的进程等有关。传统的生活贫困地区常见肿瘤如食管癌、胃癌、肝癌等发病率仍居高不 下，而富裕国家的肺癌、乳腺癌、结肠癌等多发肿瘤却已快速增长。最新调查显示，发达国家 脑肿瘤的发病率不断上升，该病还表现出明显的低龄化趋势，逐渐逼近40岁以下青年人， 且成为威胁儿童健康的重要肿瘤之一。据美国统计，在20-40岁人群肿瘤死亡病因中，脑肿 瘤在男性是第一位的死亡病因，在女性排第五位，可见脑肿瘤对社会的危害之大。目前，脑 肿瘤仍是病死率最高的成人肿瘤之一，同时也是儿童发病率最高的实体瘤。
[0003] 神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，为中枢神经系统常见的一种恶性肿瘤，来源于神经 上皮占全部颅内肿瘤的40 %?50 %，具有高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率的特 点。根据胶质瘤细胞的分化情况分为星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤等，其生长特点为 浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏 脑组织。目前脑胶质瘤的主要治疗措施是手术切除，但术后5年存活率很低，对放疗和化疗 都不敏感，因此，急需开发治疗胶质瘤的生物药物。
[0004] 脑肿瘤分类的方法很多，目前尚无统一的分类方法，并且各种肿瘤的组织发生与 病理特征不同，其良性与恶性以及物学特性也不一样。而星形细胞瘤和少突胶质瘤、室管膜 瘤在多方面都存在差异，具体差异如下：
[0005] 1.星形细胞瘤是指由星形胶质细胞所组成的胶质瘤的一种，是神经系统最常见的 难治性肿瘤，约占颅内肿瘤的13%?26%，占神经上皮肿瘤的21. 2%?51. 6%。其中胶质 瘤胶质母细胞瘤为成人最常见的原发性脑肿瘤，其患者的中位生存期仅有15个月左右。胶 质膜细胞瘤呈现浸润性生长，可向正常脑组织广泛浸润，导致手术切除困难；其次，胶质母 细胞瘤对常规的放、化疗具有抵抗性，成为其致死率高和复发率高的重要原因。由于尚未完 全阐明其发病机制，目前缺乏针对脑胶质母细胞瘤的有效治疗方法。星形胶质细胞瘤与少 突胶质细胞瘤在RTN4的表达量存在差异，在少突胶质细胞瘤中，RTN4A表达明显高于星形 胶质细胞瘤，用以鉴别少突胶质细胞瘤的特异性和灵敏度。
[0006] 2.少突胶质肿瘤是一种较少见的神经上皮性肿瘤，少突胶质瘤多发于成年人，平 均发病年龄为40岁左右。过去因检查技术及病理诊断水平的限制，常被漏诊或误诊为其 他类型胶质瘤，以往文献认为少突胶质肿瘤占颅内原发性肿瘤的2%?5%，占脑胶质瘤的 2 %?12%，但近年来随着临床研究不断深入以及病理诊断水平不断提高，少突胶质肿瘤检 出率明显增加，有文献报道少突胶质肿瘤约占颅内胶质瘤的33%。少突胶质细胞瘤是颅内 起源于少突胶质细胞的肿瘤，是胶质瘤的一种独立类型，约占颅内肿瘤的4. 39%。近些年 来，少突胶质细胞瘤的分子遗传学研究有了较大的进展，少突胶质细胞瘤最常见的遗传学 改变是19号染色体长臂的杂合性缺失，第二个常见的遗传改变是1号染色体短臂的杂合性 缺失。根据2007年世界卫生组织（WHO)最新分级病理分类，将少突胶质肿瘤分为单纯型少 突胶质细胞瘤和混合型少突星形细胞瘤，前者又可分为低级别少突胶质细胞瘤（II级）、高 级别少突胶质细胞瘤（III级）和多形性恶性胶质瘤（IV级）；后者分为少突星形细胞瘤（II 级）、间变型少突星形细胞瘤（III级）。近年研究表明，低级别的少突胶质肿瘤对化疗较敏 感，且不同级别的少突胶质肿瘤其临床转归及预后有明显差异。
[0007] 3.室管膜瘤来源于脑室与脊髓中央管的室管膜细胞或脑内白质室管膜细胞巢的 中枢神经系统肿瘤。在胶质瘤中占18. 2%，男多于女，多见于儿童及青年，约75%位于幕 下，幕上仅占25%。肿瘤大多位于脑室内，少数瘤主体在脑组织内。室管膜瘤是一种起源于 室管膜上皮细胞的神经上皮性肿瘤，可发生于颅内及椎管内，并可沿蛛网膜下腔播散，目前 还难以完全治愈。不同病理类型的胶质瘤各有其高发年龄，室管膜瘤的高发年龄在10岁以 前。国外统计96%的脊髓室管膜瘤发生在成人，发病年龄多为35?45岁，是成人最常见 的脊髓肿瘤，大约占所有中枢神经系统室管膜瘤的34. 5%，占髓内肿瘤的60%，占成人室 管膜瘤的75%。研究发现，在室管膜瘤中，50%以上有22号染色体片段的丢失，并且发现 SV40基因与室管膜瘤的关系较为密切。WH02000年最新分类将室管膜肿瘤分为：（1)室管膜 瘤：又分类4个亚型①细胞型；②乳头型；③透明细胞型；④脑室膜细胞型。（2)间变或恶 性室管膜瘤：肿瘤细胞致密成片，细胞及核形态各异，并可见核分裂相及灶性坏死。（3)粘 液乳头型室管膜瘤：肿瘤细胞乳头状排列，围绕乳头状结构中心的结缔组织常有粘液样变。 (4)室管膜下瘤：构成肿瘤的主要细胞是室管膜下胶质细胞，可见假菊形团样排列。有时可 见少量室管膜细胞以及室管膜母细胞分布于胶质纤维间。室管膜肿瘤是对化疗不敏感的肿 瘤，临床试验中，各种化疗药的单独使用或联合使用收效甚微。
[0008] 神经胶质瘤的治疗以手术为主，但由于其分化差、增殖快、侵袭性强，目前的手术 方式还无法完全切除肿瘤，一般都主张综合治疗。手术后放疗和化疗是普遍接受的治疗方 法，然而肿瘤细胞对放疗的辐射耐受性可能造成残余病灶再次复发。此外，脑肿瘤对化疗均 不太敏感，原因之一是只有少数药物可以通过血脑屏障。由于血脑屏障、肿瘤组织内及周边 水肿脑组织间隙静水压较高等因素导致肿瘤内化疗药物的有效浓度较低。另外，肿瘤耐药 性的产生、全身用药的不良反应等因素均对化疗的治疗效果造成影响。为了提高胶质瘤的 治疗效果，人们从胶质瘤的分子发病机制到新的临床治疗手段做了大量的工作。
[0009] 绿原酸广泛存在于各种药用植物，如金银花中，目前对它的化学结构研究已经 清楚，已有人对其进行药用研究，报道了绿原酸可以应用于治疗肿瘤等疾病。目前报 道的关于绿原酸用于治疗胶质母细胞瘤的文献主要是从作用机制来阐述，如文献：The chemopreventive properties of chlorogenic acid reveal a potential new role for the microsomal glucose-6-phosphate translocase in brain tumor progression (绿 原酸的化学预防特性揭示了其在脑肿瘤进展中对葡萄糖-6_磷酸转移酶的新作用），报道 了脑胶质瘤细胞株（U87)中的葡萄糖-6-磷酸转移酶（G6PT)可调节细胞内信号通路，呈高 表达状态，与肿瘤细胞的浸润性密切相关；绿原酸能对抗G6PT诱导的U87细胞迁移，绿原 酸能明显抑制神经鞘氨醇（SIP)诱导的U87细胞迁移。证实绿原酸通过抑制基质金属蛋 白转移酶和葡萄糖-6-磷酸转移酶活性，达到抑制肿瘤转移的效果。文献inhibition of MMP-2 secretion from brain tumor cells suggests chemopreventive properties of a furanocoumarin glycoside and of chalcones isolated from the twigs of Dorstenia turbinata (呋喃香豆素苷和查耳酮类在脑肿瘤细胞中具有抑制MMP-2的分泌活性）》，报道 了绿原酸作为基质金属蛋白转移酶的抑制剂可以抑制MMP-2的分泌，达到抑制脑肿瘤中胶 质母细胞瘤细胞的转移。绿原酸是G6PT抑制剂。间接说明绿原酸的抗脑肿瘤作用。但是 文献所阐述的G6PT为广义的致癌物质，涉及的脑肿瘤也是一个广义概念，不能说明绿原酸 对脑肿瘤的直接作用。王乐，从元宝枫叶中提取、分离纯化绿原酸的工艺研究，西北大学，硕 士学位论文20100401，报道了绿原酸抗癌抗衰老作用，其中公开了绿原酸可抑制神经胶质 瘤的迁移以及人Η印3B肝癌细胞中的金属硫蛋白（MMP)分泌，对大肠癌、肝癌和喉癌均有显 著疗效，被认为是癌症的有效防护剂。
[0010] 综上所述，现有文献均披露的绿原酸对脑肿瘤的作用一方面局限于星形细胞瘤中 的胶质母细胞瘤（作用机制方面阐述），没有绿原酸治疗脑胶质母细胞瘤的体内药效试验 证明，没有绿原酸治疗少突胶质瘤的相关报道，也没有绿原酸关于有抑制脑胶质瘤干细胞 作用的相关报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的技术方案是提供了绿原酸的新用途。
[0012] 本发明绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途。
[0013] 其中，所述的药物是对移植性脑胶质瘤抑制作用的药物。
[0014] 其中，所述的药物是对C6胶质瘤细胞有生长抑制作用的药物。
[0015] 其中，所述的药物是对C6胶质瘤干细胞有生长抑制作用的药物。
[0016] 其中，所述的药物是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或 者辅助性成分制备而成的制剂。
[0017] 其中，所述的药物制剂中每制剂单位含有绿原酸1?3000mg。
[0018] 进一步地，所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为10_40mg/kg。
[0019] 更进一步优选地，所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为20mg/kg。
[0020] 其中，所述的药剂是口服制剂或者注射剂。
[0021] 虽然文献报道了绿原酸在体外实验中可对抗重组体G6PT蛋白的过分表达所诱发 的U-87胶质母细胞瘤的转移，仅仅说明了绿原酸在脑肿瘤进展中对葡萄糖-6-磷酸转移酶 的作用，没有直接证明绿原酸具有抗U-87胶质母细胞瘤的作用；且绿原酸抑制U-87人胶质 母细胞瘤的转移，是属于胶质母细胞瘤，但胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤、室管膜瘤是胶 质瘤的不同类型，是不同的适应症。因此，不能推之绿原酸具有抑制少突胶质细胞瘤和室管 膜瘤的功效。
[0022] 胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤、室管膜瘤在病因学、组织病理学和临床方面有 着明显的不同。室管膜瘤是一种起源于室管膜上皮细胞的神经上皮性肿瘤，可发生于颅内 及椎管内，并可沿蛛网膜下腔播散，目前还难以完全治愈。国外统计96%的脊髓室管膜瘤发 生在成人，发病年龄多为35?45岁，是成人最常见的脊髓肿瘤，大约占所有中枢神经系统 室管膜瘤的34. 5%，占髓内肿瘤的60%，占成人室管膜瘤的75%。WH02000年最新分类将 室管膜肿瘤分为：（1)室管膜瘤：又分类4个亚型①细胞型；②乳头型；③透明细胞型；④ 脑室膜细胞型。（2)间变或恶性室管膜瘤：肿瘤细胞致密成片，细胞及核形态各异，并可见 核分裂相及灶性坏死。（3)粘液乳头型室管膜瘤：肿瘤细胞乳头状排列，围绕乳头状结构中 心的结缔组织常有粘液样变。（4)室管膜下瘤：构成肿瘤的主要细胞是室管膜下胶质细胞， 可见假菊形团样排列。有时可见少量室管膜细胞以及室管膜母细胞分布于胶质纤维间。目 前对于没有脑脊液播散的室管膜瘤的治疗方式为手术尽可能全切并在术后辅以局部放射 治疗可以提供最佳的治疗效，但是无论是传统联合化疗还是大剂量化疗似乎都不能改善预 后，尽管部分试验显示肿瘤对化疗敏感。
[0023] 少突胶质肿瘤是一种较少见的神经上皮性肿瘤，以往文献认为少突胶质肿瘤占颅 内原发性肿瘤的2%?5%，占脑胶质瘤的2%?12%，但近年来随着临床研究不断深入以 及病理诊断水平不断提高，少突胶质肿瘤检出率明显增加，有文献报道少突胶质肿瘤约占 颅内胶质瘤的33%。根据2007年世界卫生组织（WHO)最新分级病理分类，将少突胶质肿瘤 分为单纯型少突胶质细胞瘤和混合型少突星形细胞瘤，前者又可分为低级别少突胶质细胞 瘤（II级）、高级别少突胶质细胞瘤（III级）和多形性恶性胶质瘤（IV级）；后者分为少突 星形细胞瘤（II级）、间变型少突星形细胞瘤（III级）。近年研究表明，少突胶质肿瘤对化 疗较敏感，且不同级别的少突胶质肿瘤其临床转归及预后有明显差异。
[0024] 本发明绿原酸具有抑制少突胶质细胞瘤的功效，并能抑制脑肿瘤干细胞的生长， 能替代部分放化疗，减轻患者可以因放化疗引起的不适反应，是治疗少突胶质瘤新的药物 治疗手段和选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1绿原酸对人脑少突胶质瘤的剂量效应曲线
【具体实施方式】
[0026] 以下通过具体的药效学试验证明本发明的有益效果
[0027] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明进一 步详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明 上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0028] 试验例1绿原酸诱导人少突胶质瘤细胞细凋亡的实验研究
[0029] 1.材料
[0030] 细胞：人少突胶质瘤细胞由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实 验室提供。
[0031] 药物与试剂：绿原酸，由四川九章生物科技有限公司提供；谷氨酸购于浙江天瑞 化学有限公司；四甲基偶氮唑盐（ΜΤΤ)、0. 25%胰蛋白酶、RPMI1640培养液及胎牛血清均购 自美国Sigma公司。
[0032] 2.方法
[0033] 2. 1人脑少突胶质瘤细胞的原代培养
[0034] (1)原代培养
[0035] 手术中切除的无菌新鲜肿瘤标本（人脑少突胶质瘤），立即放入培养液中，送实验 室。用含有青霉素、链霉素和庆大霉素的无血清RPMI1640冲洗2?3次，洗去标本上的血 液。在显微镜下选择较为单纯的肿瘤组织移入无菌青霉素小瓶中，剔除坏死组织和血管等 结构，取肿瘤组织块，用眼科剪刀剪成〇. 5?1mm3的小块后，加入1?2mL细胞培养液，用 吸管轻轻吹打，使组织块悬浮。用吸管分次吸取组织块悬液，使其均匀排在培养瓶底壁上， 翻转培养瓶，加入2?3mL培养液，放入37°C恒温C02培养箱内2?3h后，观察组织块牢固 贴于平壁上后，再缓慢将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续培养。
[0036] (2)原代细胞的传代
[0037] 待细胞长满瓶底后，倒去旧培养液，用无血清的RPMI1640培养液洗1遍。加入 0. 25%的胰酶消化约5min，用含血清培养液终止消化。反复吹打，收集细胞，计数，按5 X 104 个/cm2的密度接种于25cm2培养瓶中传代培养。
[0038] (3)人脑少突胶质瘤细胞的形态学观察
[0039] 原代培养的细胞在倒置相差显微镜进行形态学观察。向培养细胞中加入含有 5ymol/L Fluo-3/AM 突光探针和 5ymol/L Pluronic F-127 的 lmL Hank' s 液，37°C 负载 40min。用不含荧光探针的Hank's液洗涤3次。负载好的细胞液在激光共聚焦扫描显微镜 观察细胞的状态，与原手术病理检查结果进行对照，确认生长细胞为人脑少突胶质瘤细胞。 培养细胞再经胶质纤维酸性蛋白免疫组化检测确认。
[0040] (4)MTT法检测绿原酸对原代培养人脑少突胶质瘤细胞增殖的抑制作用
[0041] 细胞接种：取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用基础培养基洗涤离心 (lOOOrpm 5min两次），用完全培养基悬浮细胞并调整细胞浓度为6X104/ml，接种细胞于 96孔板内，每孔50 μ 1 (细胞数量6 X 103/孔），每个药物浓度接种3个复孔，并设正常对照 组（肿瘤细胞+完全培养基）和空白对照组（完全培养基），每组3个复孔。
[0042] 加药：接种后次日细胞贴壁后按以下分组加药，绿原酸组，用完全培养基将 6. 4mg/ml绿原酸储存溶液配制成256 μ g/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐步 稀释，得含绿原酸256、128、64 μ g/ml的完全培养基，备用；取50 μ 1上述含不同浓度绿原酸 的完全培养基到已接种细胞的96孔板中，使绿原酸终浓度分别为128、64、32 μ g/ml，每个 浓度3复孔。静置培养48小时；空白对照组，每孔不接种细胞，只加等量（ΙΟΟμΙ)完全培 养基，设3个复孔作为空白对照。
[0043] 测定：加药后细胞培养48小时，在上述3个实验组和空白对照组孔内加入 10 μ 1WST-1溶液，置37°C细胞培养箱继续孵育4小时后，在μ -Quant微孔板测定仪上测定 不同药物组、正常对照组和空白对照组440nm波长处的吸收值。
[0044] 数据处理：肿瘤细胞生长抑制率的计算：抑制率=(对照组A值-实验组A值）/ 对照组A值X 100%。实验重复3次。
[0045] 3.实验结果
[0046] 3. 1绿原酸对人脑少突胶质瘤的体外抑瘤作用
[0047] (1)细胞形态观察结果
[0048] 各组加药处理48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态，与正常对照组比较，绿 原酸（32?128 μ g/ml)低浓度时即有细胞数量较正常细胞明显减少；有细胞碎片，产生凋 亡。
[0049] (2)绿原酸对人脑少突胶质瘤的抑制率和剂量效应曲线
[0050] 绿原酸对人脑少突胶质瘤的抑制率见表1，剂量效应曲线见图1。
[0051] 表1绿原酸对人脑少突胶质瘤的抑制率
[0052]
【权利要求】
1. 绿原酸在制备治疗少突胶质瘤的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对移植性脑胶质瘤抑制作 用的药物。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对C6胶质瘤细胞有生长抑 制作用的药物。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是对C6胶质瘤干细胞有生长 抑制作用的药物。
5. 根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药物是以有效量的绿 原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中每制剂单位含有绿原 酸 1 ?3000mg。
7. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为 10_40mg/kg。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂中绿原酸的使用剂量为 20mg/kg。
9. 根据权利要求6-9任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药剂是口服制剂或者 注射剂。
【文档编号】A61K31/216GK104188949SQ201410468312
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】张洁, 黄英, 朱丽娜 申请人:四川九章生物科技有限公司