猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及到一种猪瘟、伪狂犬病二联活 疫苗的制备方法及其制品。
【背景技术】
[0003] 猪瘟（CSF)和伪狂犬病（PR)是危害集约化养猪业的两大重要传染病，在我国猪群 中广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。免疫接种是猪瘟和伪狂犬病防制的重要措施。 目前应用猪瘟兔化弱毒疫苗和伪狂犬病活疫苗对这两种疫病的防制起了很大的作用。但猪 用疫苗品种很多，在实际操作中，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理安排，既繁琐、费 时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响预防效果。采用多联（或多价）疫苗免疫接 种，以达到预防多种传染病的目的。同时，这两种疫病采取的免疫程序比较接近，这为猪瘟 与伪狂犬病二联活疫苗的研制提供了可能。为了达到一次免疫可有效预防和控制CSF与PR 两种疫病的发生与流行，减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的 免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗 及其制备方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，包括如 下步骤： (1) 用细胞转瓶或生物反应器培养猪癌病毒弱毒株、伪狂犬病病毒弱毒株； (2) 分别收获所述步骤（1)得到的细胞培养毒液； (3) 所述步骤（2)得到的两种细胞培养毒液按1:2-1:1. 5的体积百分比混合，并在混合 液中加入稳定剂和抗菌素，经冷冻真空干燥得到猪瘟、伪狂犬病细胞活疫苗。
[0006] 进一步地，其中所述生物反应器为TideCell微载体生物反应器，且所述生物反应 器中含有微载体，所述微载体为cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2_25g/L。
[0007] 进一步地，其中所述步骤（1)包括如下步骤： (la) 制苗用细胞的传代与培养：所述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用 细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层； (lb) 细胞毒种的繁殖：将所述猪瘟病毒弱毒株接种至所述步骤（la)中得到的传代细 胞单层，用细胞维持液继续培养；每隔4~5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作 为生产用毒种；将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤（la)中得到的传代细胞单层， 用细胞维持液继续培养；2~3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种； (lc) 制苗毒液的繁殖： 取所述步骤（la)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤（lb) 中得到的含猪瘟病毒的细胞维持液，继续培养； 取所述步骤（la)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤（lb) 中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培养。
[0008] 进一步地，其中所述步骤（2)包括如下步骤： 将含猪瘟病毒的细胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后5日第一次收获换 液，以后每隔4日收获换液一次，收获的毒液置于-15°C以下保存；将含伪狂犬病病毒的细 胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后2~3日后收获细胞培养毒液,收获的毒液置 于-20°C以下保存。
[0009] 进一步地，其中所述步骤（la)、（lb)、（lc)中的细胞培养所用的温度为 36。。~37。。。
[0010] 进一步地，其中所述步骤（lb)、（lc)中接种时的接种量按体积百分比计为含1%~ 2%生产用细胞毒种的维持液。
[0011] 进一步地，其中所述步骤（la)中的细胞生长液含90%~92% MEM液、8%~10%犊 牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞生长液的pH值为7. 0~7. 2,其中MEM液 和犊牛血清的单位为体积百分比。
[0012] 进一步地，其中所述步骤（lb)和（lc)中的细胞维持液含95%~98%MEM液、2%~ 5%犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞维持液的pH值为7. 2~7. 4,其中MEM 液和犊牛血清的单位为体积百分比。
[0013] 进一步地，其中所述传代细胞为牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、猪睾丸传代细胞 ST、猪肾传代细胞PK15或猪肾传代细胞IBRS-2。
[0014] 进一步地，其中所述生物反应器的设定参数为：pH6. 5-7. 8、温度36°C ~37°C、溶氧 30-80%、搅拌速度 30-100rpm。
[0015] 进一步地，其中所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的 速率根据细胞的密度为每天〇. 5-5个工作体积。
[0016] 另外，本发明还提供一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗，所述猪瘟、伪狂犬病二联活 疫苗通过上述方法制得。
[0017] 本发明实现的技术效果如下： 本发明的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，制备过程简单且稳定、易操作、病毒 含量高、批间差异小、质量易控、可显著提高疫苗产量和质量、减少过敏反应等优点。利用 本发明的制备方法得到的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟、伪狂 犬病的强毒攻击具有较好的免疫作用。现有技术中免疫接种猪瘟和伪狂犬病活疫苗，采用 分开免疫，多针次、多剂量，既繁琐、费时、费力、增加成本，又难以合理安排免疫程序，而且 猪瘟和伪狂犬病均为免疫抑制病，免疫剂量不合理会引起相互干扰，且容易造成漏种，直接 影响预防效果。用猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少 免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，达到"一针防两 病"。而且，利用生物反应器大规模高密度培养，可最大限度地提高生物反应器中单位体积 细胞生长密度，在病毒疫苗生产中具有很大潜力和优势，具体表现为：（1)细胞密度大大增 加，病毒浓度极大提高；（2)疫苗效价提高，副反应减小；（3)降低劳动强度，减少生产成本； (4)疫苗生产可监控性提高；（5)保证产品质量均一稳定。
【附图说明】
[0018] 图1 :猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的生产工艺流程图； 图2 :免疫猪血清中猪瘟抗体变化图； 图3 :免疫猪的猪瘟抗体阳性率图； 图4 :免疫猪血清中伪狂犬病抗体变化图； 图5 :免疫猪的伪狂犬病抗体阳性率图。
【具体实施方式】
[0019] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些 实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。
[0020] 应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另 有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同 含义。本发明所采用的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗生产和检验用毒种，均购自中国兽医微生 物菌种保藏管理中心（CVCC)。
[0021] 实施例1猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备 如图1所示，猪癌、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，技术方案为： (1)培养方式：应用生物反应器或细胞转瓶培养细胞与繁殖猪瘟病毒和伪狂犬病病 毒。
[0022] (2)选择易感细胞作为制苗用细胞：牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、猪睾丸（ST)传 代细胞、猪肾（PK15)传代细胞、猪肾（IBRS-2)传代细胞之一。
[0023] (3)制苗用细胞的传代与培养：上述易感细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代， 以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒； (4)生产用毒种的繁殖： A.猪瘟活疫苗生产用毒种的繁殖：用含3~5%牛血清的MEM细胞维持液，将新鲜脾毒 种制成病毒悬液，接种生长良好的上述易感细胞单层，37°C继续培养；每隔4~5日收获换 液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。
[0024] 细胞毒种鉴定：猪瘟活疫苗生产用细胞毒种鉴定应完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种 标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒> 500, 000个家兔感染量。
[0025] B.伪狂犬病活疫苗生产用毒种的繁殖：用含3~5%牛血清的MEM细胞维持液，将 伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述易感细胞单层，37°C继续培养；2~3日后收获细 胞培养毒液作为生产用毒种。
[0026] 细胞毒种鉴定：伪狂犬病活疫苗生产用细胞毒种鉴定应完全符合伪狂犬病病毒弱 毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒> 10sTCID5。。
[0027] (5)制苗毒液的繁殖： A.猪瘟活疫苗制苗毒液的繁殖：取已形成良好细胞单层的上述易感细胞培养瓶，弃去 细胞生长液，接种含毒的含3~5%牛血清的MEM细胞维持液，37°C继续培养；接毒后第5日 作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的细胞毒液置-15°C以下保存。
[0028] 制苗毒液的检验：按现行《中