专利名称：：一种抑制血管舒张的药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制血管舒张的药物，特别是涉及一种用白櫃木制备其主要有效成分的药物。
背景技术：
：櫃木有顽强的生命力，极强的自然再生、粘合能力，最为神奇的现象是櫃木与櫃木之间能够互相融合生长。白櫃木又称白花櫃木，是櫃木的一种。中医药理论认为，白櫃木具有收敛止血的功效，可用于愈合体内外伤口，并作为收敛或止血药类药物，临床用于外伤出血及体内脏器官出血和水火烫伤。但未见有人用白櫃木或其提取物用于抑制血管舒张或促进血管收縮的目的。
发明内容本发明的目的是开发一种用白櫃木为原料制备的药物。本发明发现了白櫃木或白櫃木的提取物具有抑制血管舒张的作用，可用于制备抑制血管舒张的药物。所述白櫃木包括白櫃木植物的花、茎、叶、枝。所述白櫃木的提取物，是用药物可接受的溶剂对白櫃木进行浸提所得的粗提物。所述药物可接受的溶剂选自水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合物，所述有机溶剂选自醇、醚或酯。提取白櫃木所用的浸提方法，可采用本领域常用的浸提方法，如渗漉法、水蒸汽蒸馏法、回流法、浸渍法、超临界流体提取法、超声波提取法，也可采用柱分离、离子交换等植物有效成分分离的常规方法。在确保不破坏活性物质成分的前提下，力求采用节能减排、生态环保式的清洁生产工艺。生物酶解法提取技术制备白花櫃木提取物，如中国专利200710149826.4的方法是白花櫃木优选的提取方法。生物酶解法提取技术制备白花櫃木提取物的具体流程为生产线前的原料抽样分析检测一原料验收一深度清洗一组合菌酶解一灭活一动态温浸提取一低温浓縮一瞬间冷冻一高速离心沉降分离一喷雾干燥一包装检测一白花櫃木粗提物。将上述生物破壁法获得的白花櫃木生物破壁产物，采用动态温浸法提取，提取浸膏先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花櫃木的粗提物初步分离纯化，得到含生物活性物质的白花櫃木化学部位。进行了生物酶解法提取技术制备白花櫃木提取物与常规的水提法制备白花櫃木提取物的比较观察，结果显示生物酶解法有效的破壁效果使白花櫃木提取物中有效成分的含量提高，其生化作用较强。本发明用白櫃木粗提物进行了如下动物实验和体外实验，证实(1)白櫃木粗提物对缓激肽在1，10，100yg/mL浓度下所致血管舒张均具有显著收縮血管作用，证明其具有明显的血管舒张抑制作用。(2)白櫃木粗提物单次小鼠灌胃给药量10g/kg，未见明显毒性反应，属于无毒性物质。(3)体外实验结果表明，白櫃木粗提物在500i!g/mL浓度下未见有促进血小板聚集的作用。(4)白櫃木粗提物以200mg/kg连续7天灌胃给药对正常小鼠凝血时间未见明显影响。实验结果表明，白櫃木提取物不仅具有抑制血管舒张的作用，而且安全性好。而且，白櫃木收敛止血的功效不通过促进血小板聚集发挥作用，因此不影响动物血小板聚集功能，也不影响凝血功能。将上述治疗有效量的白櫃木提取物和药物可接受的任何载体、赋形剂、辅剂结合，可制成抑制血管舒张或促进血管收縮的药物。也可以根据不同情况，将白櫃木提取物与其它药物活性成分制成复方药物。为了保证药物更好的疗效和更优的理化性状，还可在药物中加入制剂常用的辅剂，如防腐剂、助渗剂、增溶剂、表面活性剂、ra调节物质，本领域技术人员可根据不同剂型和使用的需要添加。图1是白花櫃木提取物紫外检测色谱图；图2是白花櫃木提取离子色谱图物；图3、图4、图5分别是白櫃木终浓度为1yg/ml、10iig/ml、100iig/ml时对缓激肽舒张血管的抑制作用。图中左边为通道名称，右边刻度为张力数值，图中曲线代表加入白櫃木粗提物后，对预加入缓激肽后舒张血管的收縮作用。具体实施例方式下面通过实施例对白櫃木提取物的提取过程、药效、安全性等实验做进一步详述。但本发明并不限于此粗种方法所获得的粗提物。实际上，白櫃木用其他方法所得的提取物抑制血管舒张作用，也在本发明的范围之内。实施例l白櫃木粗提物的提取用生物酶解法提取白花櫃木粗物。具体流程为生产线前的原料抽样分析检测一原料验收一深度清洗一组合菌酶解一灭活一动态温浸提取一低温浓縮一瞬间冷冻一高速离心沉降分离一喷雾干燥一包装检测一白花櫃木粗提物。具体提取方法是，将白花櫃木鲜材料破碎。采用组合菌酶解方法获得白花櫃木生物破壁产物，采用动态温浸法提取(温度85°C，时间120m，ra值6.5±0.2)，温浸提取时间为16小时，得到提取浸膏。先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花櫃木的粗提物初步分离纯化，得到粗提物，重量为原料重量的5.5-6%。所述组合菌酶解所用菌种是荷兰株芽孢，来源于景德板鸡发酵粉，由江西景德板鸡实业公司生产。原菌种荷兰株芽孢是唯一不产生肠毒素的菌种，经培养，在二次代谢中分离出D429，过程是肉汤斜面培养。石腊封存2个月后再次分离菌体，并组扩大培养，然后再分离，最后经扩群，提取其浮生藻，冻干成活性菌体粉。(菌种培养基为肉汤琼脂等)。本发明进行了生物酶解法提取技术制备白花櫃木提取物与常规的水提法制备白花櫃木提取物的比较观察，结果显示生物酶解法有效的破壁效果使白花櫃木提取物中上述三类成分的含量提高，其生化作用较强。实施例2白花櫃木化学成分初步分析报告—、样品制备精称粗提粉末1.06mg，lmL50%甲醇溶解，过0.45ym微孔滤膜，即得。二、色谱条件高效液相色谱仪Agilent1200系列高效液相色谱仪(美国AgilentTechnologies公司)，包括二极管阵列检测器，四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器。色谱柱YMC-PackProC18(150mmX3.0mmID，5iim);流动相:A(甲醇)，B(O.1%甲酸H20)梯度洗脱(0—35min，A:10%—98%;35min-40min，A:98%—98%;);流速0.3mL/min;紫外扫描范围200-400nm;检测波长200-400nm;柱温40。C。三、质谱条件1、质谱仪QTRApTM型四极杆-线性离子阱串联质谱仪(A卯liedBiosystems/MDSSCIEX，USA)，离子源采用负离子检测模式的ESI源。2、LC-MS测定条件ScanTypeEnhancedMS(EMS)PolarityNegativeScanModeProfileIonSourceTurbosprayScanRate:4000Da/sLITfilltime80.00msecQ3EntryBarrier8.00VCurtainGas(CUR)25.00CADHighlonsprayVoltage(IS)_4.5kVTEM350.00NebulizerGas(GSl)70SourceGas2(GS2)60ihe:ONDeclusteringPotential(DP)-80VEntrancePotential(EP)-10VCollisionEnergy(Experiment1)_10VCollisionEnergy(Experiment2)_40eV表l白花櫃木主要化学成分<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3白櫃木粗提物对大鼠缓激肽所致血管舒张作用的影响—、材料动物Wistar大鼠，雄性，体重250g，中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号，SCXK(京)2008-0004。受试品白櫃木粗提物，褐色粉末状固体，由江西德宇集团提供。临用前用生理盐水配置为所需浓度。实验用液l)KH液(2000ml蒸馏水中依次加入NaCl:13.7918g;KCl:0.7008g;CaC12:0.56605g;无水MgS04:0.2841g;KH2P04:0.3212g;NaHC03:4.1803g;Glucose:4.3994g。加样同时磁力搅拌，备用)2)终浓度为3mol/L的缓激肽，以生理盐水配制，保存于_20°C;3)终浓度为60mmol/L的氯化钾溶液。二、方法1)用戊巴比妥钠麻醉大鼠，迅速取出胸主动脉段，固定于含预冷KH液的蜡盘中，去除血管周围结缔组织和脂肪，截成约3-4mm长的血管条，分别套两个三角形钢丝钩上，其中之一固定于浴槽的底部，另一个连接拉力换能器。2)调节拉力换能器给予血管条0.5g的负荷，稳定15分钟后再给予lg的负荷，稳定15分钟后再给予1.5g的负荷，稳定15分钟后再给予2g的负荷，平稳后开始试验。期间每IO分钟换一次KH液。3)血管条稳定后加入200ulKCl溶液使血管收縮，当收縮达到平衡后冲洗净KCl，重新调节张力为2克，再次平稳后加入30ul终浓度为3mol/L缓激肽溶液，当舒张达到最大值，平稳约半小时后加入受试品，检测约30分钟后血管的舒縮情况。计算药物的血管收縮抑制率。各浓度受试品均须检测3组(不同大鼠同一位置的血管条)的抑制率，求平均值。计算公式为加入^權木后上升的张力克数一加入A檻木后下降的张力克数抑制率(％)=--xl00%加入缓激肽后下降的张力克数一加缓激肽前血管的正常张力克数三、结果表2白櫃木粗提物对缓激肽所致血管收縮的影响(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>图3、图4、图5是白櫃木粗提物在终浓度分别为1yg/ml、10iig/ml和100iig/ml时对缓激肽舒张血管的抑制作用。用BioPac多导生理记录仪测量，Acq373软件分析、记录所得图像。图中左边为通道名称，右边刻度为张力数值，图中曲线代表加入白櫃木粗提物后，对预加入缓激肽后舒张血管的收縮作用。四、结论受试样品白櫃木粗提物在100i！g/ml浓度下对缓激肽所致血管舒张具有明显的抑制作用，抑制率90.67±1.63%;其在10g/ml和1yg/ml浓度下亦具有抑制作用，抑制率约为38%，但此抑制作用未见浓度依赖性。实施例4白櫃木粗提物对小鼠凝血时间的影响(玻片法_体内实验)—、材料受试品白櫃木粗提物，褐色粉末状固体，由江西德宇集团提供。临用前用双蒸水配制成所需浓度的溶液备用。动物昆明种小鼠，体重1820g，雄性，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号SCXK(京)-2007-0001。二、方法动物随机分成2组，每组10只，分别为正常对照组、白櫃木粗提物200mg/kg组。给药组每天上午灌胃给药一次，给药体积均为0.lml/10g，连续给药7天，正常对照组给予等体积双蒸水。于第7天给药后半小时，由小鼠右眼静脉丛取血。于载玻片两端各滴一滴血，血滴直径约5mm，立即用秒表计时。每隔30秒用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始到挑起血丝止，所历时间即为凝血时间。另一滴血供最后复验。记录凝血时间，作均数显著性测验。数据分析数据以平均值±标准差表示，数据分析采取组间t检验。三、结果与正常对照组小鼠凝血时间(153.6±83.l秒)相比，白櫃木粗提物(117.3±28.3秒)组未见显著性差异(P>0.05)(见表3)。表3白櫃木粗提物对小鼠凝血时间的影响(mean±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>**p<0.01与模型对照组相比；四、结论白櫃木粗提物以200mg/kg连续7天灌胃给药对正常小鼠凝血时间未见明显影响。实施例5白櫃木粗提物对大鼠血小板聚集功能的影响体外研究—、材料1、受试品白櫃木粗提物，褐色粉末状固体，由江西德宇集团提供。2、试剂戊巴比妥钠，购自鼎国生物技术有限公司，规格25g，批号76110203;枸橼酸钠，北京化工厂产品，批号20000809，蒸馏水配制成3.8%的溶液；牛凝血酶，规格1000U，Sigma公司产品进口分装产品，固体粉末状，用生理盐水配制100U/ml，分装后_20°C保存；医用生理盐水，购自石家庄四药有限公司产品，批号080904110。3、仪器飞鸽牌TDL-40B型低速台式大容量离心机，北京科学器材有限公司出品；LBY-NJ4型血小板聚集仪，北京利普生公司出品；秒表等。二、方法1、麻醉取雄性SD大鼠，280-300g，1.5%戊巴比妥钠麻醉(剂量为0.4ml/100g)。2、取血腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠按体积比9:l抗凝。2、血小板的制备全血1200r/min离心10min后取上层米黄色混悬液，为富血小板血浆(PRP)，剩余血浆3000r/min离心10min后取上层清夜，为贫血小板血浆(PPP)。用PPP将PRP中血小板数量调整至仪器显示吸光度值300-400之间。3、血小板最大聚集率的测定(1)白櫃木粗提物对血小板的直接促聚作用在比色杯中加入300iUPPP调整仪器零点，另取比色杯依次加入搅拌子和300ii1PRP，预温5min，分别加入受试品(体系终浓度为500iig/mL)、凝血酶(体系终浓度为6.4U/mL)或生理盐水20y1后，立即记录5min内血小板最大聚集率。(2)白櫃木粗提物与凝血酶联合应用对血小板促聚作用在比色杯中加入300iUPPP调整仪器零点，另取比色杯依次加入搅拌子、300iUPRP、以及生理盐水或受试品15iil(体系终浓度为500iig/mL)，温育5min后加入10y1凝血酶(体系终浓度为3.2U/ml)，记录5min内血小板最大聚集率。4、数据分析数据以平均值±标准差表示，数据分析采取组间t检验。三、结果1、受试品对血小板的直接促聚作用研究与生理盐水组比较，白櫃木粗提物组对血小板最大聚集率无统计学差异。此外，白櫃木与生理盐水组的血小板最大聚集率均显著低于凝血酶组。说明500iig/mL白櫃木和生理盐水都不能直接引起显著的血小板聚集，不具有促血小板聚集的作用。见表4。表4白櫃木粗提物单用对大鼠体外血小板聚集的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>f与凝血酶组比较，P<0.001。2、受试品与凝血酶对血小板联合促聚作用研究表5白櫃木粗提物与凝血酶联合应用对大鼠体外血小板聚集的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与生理盐水组比较，白櫃木粗提物组与凝血酶联合应用用对血小板的最大聚集率无统计学差异。说明500i！g/mL白櫃木粗提物与凝血酶联合作用不能显著促进血小板聚集。四、结论本实验证明白櫃木粗提物在1，10，100g/mL浓度下均具有显著收縮血管作用。本实验研究了白櫃木粗提物对血小板聚集的影响，实验结果表明，白櫃木粗提物在500g/mL浓度下未见有促进血小板聚集的作用。据此推测，白櫃木收敛止血的功效可能不通过促进血小板聚集发挥作用。实施例6白櫃木粗提物小鼠单次给药急性毒性初步试验—、目的采用最大给药剂量法，通过小鼠单次灌胃白櫃木，观察小鼠出现的中毒症状、中毒程度、性质、恢复情况及死亡等。二、材料受试品白櫃木粗提物，棕色粉末，易溶于水；由江西德宇集团提供。临用前用双蒸水配制成所需浓度的溶液备用。动物昆明种小鼠，体重1820g，雌雄各半，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号SCXK(京)-2007-0001。二、方法根据最大给药量法，使用40只小鼠，雌雄各半，空白对照组与给药组各20只。给药组以最大给药体积(0.4ml/10g体重)给予合适的给药浓度(浓度为0.25g/ml)，给药剂量为10g/kg，对照组给予同体积的蒸馏水。详细记录给药当日动物表现，对死亡动物剖检，存活药后观察14天，第15天进行剖检。四、结果白櫃木给药后无小鼠死亡；给药后未见小鼠有异常表现，小鼠均活动正常、毛色光滑、摄食量正常、粪便正常、体重增加、肉眼尸检未见异常(见图2-5)。给药后每日记录小鼠体重，结果见表5。表5白櫃木单次给药毒性试验动物体重记录(g)(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>五、结论在本次试验条件下，单次灌胃给药白櫃木的LD50大于10g/kg，未见死亡及异常变化，受试品白櫃木提取物属于无毒性物质。权利要求一种抑制血管舒张的药物，其活性成分是白檵木或白檵木的提取物。2.用白櫃木为原料制备抑制血管舒张或促进血管收縮的药物的用途。3.权利要求2所述的用途，所述白櫃木包括白櫃木的花、茎、叶、枝。4.权利要求2所述的用途，所述原料是采用生物酶解方法制备的白櫃木提取物。全文摘要本发明涉及一种抑制血管舒张的药物，其主要有效成分用白檵木制备。本发明用白檵木粗提物进行了动物实验和体外实验，证实白檵木粗提物具有明显的血管舒张抑制作用，而且安全性好，不影响动物血小板聚集功能，也不影响凝血功能。文档编号A61P9/00GK101708202SQ20091024203公开日2010年5月19日申请日期2009年12月3日优先权日2009年12月3日发明者刘浩元,曲淑娟,李晓滨申请人:江西德宇集团