kker,Inc.,化W York,1987);及Boerner等，J.Immunol.,147:86(1991))。经 由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，PNAS USA, 103:3557-3562(2006)。其它 方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人 IgM抗体）和Ni ,Xiandai Mianyixue ,26(4): 265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤）的。人 杂交瘤技术（Trioma 技术）也记载于 Vollmers 和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及VolImers和化andlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
[0131] 在一些情况中，也可W通过分离自人衍生的隧菌体展示文库选择的Fv克隆可变域 序列生成人抗体。然后，可W将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。
[0132] 3.文库衍生的抗体
[0133] 在某些实施方案中，抗VEG巧亢体可W是或已经是通过对组合文库筛选具有期望的 一种或多种活性的抗体而分离的。例如，用于生成隧菌体展示文库并对此类文库筛选拥有 期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如化Ogenboom等， 于Methods in Molecular Biology 178: l-37(0'B;rien等编，Human Press,Totowa,NJ, 2001)，并且进一步记载于例如McC^ifferty等，化ture :348: 552-554; Clackson等，化ture 352 :624-628( 1991) ;Marks 等，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992) ;Marks 和化adbu巧，于 Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003); Sidhu 等，J.Mol. Biol. 338(2) :299-310 (2004); Lee 等，J.Mol. Biol. :340(5) :1073-1093 (2004) ;Fellouse，PNAS USA 101(:34) :12467-12472(2004);及 Lee 等J. Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
[0134] 在一些隧菌体展示方法中，将VH和化基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR) 克隆，并在隧菌体文库中随机重组，然后可W对所述隧菌体文库筛选抗原结合隧菌体，如记 载于Winter等,Ann.Rev. Immunol12:433-455(1994)的。隧菌体通常W单链Fv(ScFv)片段 或W化b片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而 不需要构建杂交瘤。或者，可W (例如自人)克隆未免疫全集W在没有任何免疫的情况中提 供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griff iths等，EMBO J，12: 725-734(1993)描述的。最后，也可W通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随 机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由 Hoogenboom和Winter，J.Mol. Biol .，227:381-388( 1992)所描述的。描述人抗体隧菌体文库 的专利公开文本包括例如：美国专利No . 5，750，373，和美国专利公开文本No . 2005/ 0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764， 2007/0292936和2009/0002360。
[01巧]4.抗体生成和特性
[0136] 在本发明的方法中有用的抗VEGF抗体可W包括任何W足够亲和力和特异性结合 VEGF且/或能降低或抑制VEGF的生物学活性的抗体或其抗原结合片段。抗VEGF抗体通常不 会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF，PDGF， 或bFGF。
[0137] 在一些情况中，要用于生成VEGF抗体的VEGF抗原可W是例如VEGF165分子W及VEGF 的其它同等型或其含有期望表位的片段。在一个实施方案中，期望表位是受到贝伐珠单抗 识别的表位，贝伐珠单抗与由杂交瘤ATCC皿10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合 相同表位(称作本文中定义的"A.4.6.1表位"）。可用于生成本发明的抗VEGF抗体的其它形 式的VEGF对于本领域技术人员会是显而易见的。
[0138] 人VEGF首先是使用牛VEGF CDNA作为杂交探针筛选自人细胞制备的CDNA文库而获 得的。Leung等（1989)5別611。6,246:1306。一种由此鉴定出的。0魁编码一种165个氨基酸的 蛋白质，其与牛VEGF具有超过95%的同源性；此165个氨基酸的蛋白质通常称作人VEGF 化VEGF)或VEGF165。人VEGF的促有丝分裂活性通过在哺乳动物宿主细胞中表达人VEGF CDNA 得到了验证。由经人VEGF CDNA转染的细胞条件化的培养基促进毛细血管内皮细胞增殖，而 对照细胞不然。Leung等（1989) Science,见上文。进行进一步努力来经重组DNA技术克隆和 表达VEGF。（参见例如F'errara,LaboratoiT Investigation 72:615-618(1995)及其中引用 的参考文献）。
[0139] 源自可变RNA剪接，VEGF在多种组织中作为多种同二聚体形式(每个单体121，145， 165，189，和206个氨基酸)表达。VEGFm是一种可溶性丝裂原，不结合肝素;更长形式的VEGF W越来越高的亲和力结合肝素。肝素结合形式的VEGF可W在簇基末端被纤溶酶切割W释放 可扩散形式的VEGF。纤溶酶切割后鉴定出的簇基末端肤的氨基酸测序是Argiio-Alam。作为 同二聚体分离到的氨基末端"核屯、"蛋白，VEGFQ-llO似与完整VEGF165同二聚体相比相似 的亲和力结合中和性单克隆抗体（诸如称作4.6.1和3.2E3.1.1的抗体）和可溶性形式的 VEGF受体。
[0140] 最近还鉴定出数种在结构上与VEGF有关的分子，包括胎盘生长因子。16。），￥66尸-B，VEGF-C，VEGF-D 和 VEGF-E Jerrara 和 Davi S-Smy th (1987 化 ndocr. Rev .，见上文；Ogawa 等 J.Biological 化em. 273:31273-31281 (1998) ;M巧er等EMBO J.，18:363-374( 1999)。受体 酪氨酸激酶Fl t-4(VEGFR-3)鉴定为VEGF-C和VEGF-D的受体。JoukoV等EMBO. J. 15 :1751 (1996);Lee等PNAS USA 93:1988-1992(1996);Achen等（1998)PNAS USA 95:548-553。 VEGF-C显示出设及对淋己管发生的调节。Jeltsch等Science 276:1423-1425(1997)。
[0141] 已经鉴定出两种VEGF受体，即Flt-U也称作VEGFR-1)和KDR(也称作VEGFR-2)。 Shibuya等（1990)0ncogene 8:519-527;de Vries等（1992)Science 255:989-991!Terman 等（1992)Biochem.Biophys .Res .Commun. 187:1579-1586。神经拉蛋白-I显示为选择性VEGF 受体，能够结合肝素结合性VEGF同等型(Soker等（1998)Ce 11 92:735-45)。
[0142] 在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括但不限于与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1;依照Pres化等（1997)Cancer Res. 57:4593-4599生 成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体。在一个实施方案中，抗 VEGF抗体是贝伐珠单抗(BV或Bev)，也称作"rhuMAb VEGF"或。AVASTIN⑥，'。它包含经过 突变的人IgGl框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A. 4.6.1的抗 原结合互补决定区。贝伐珠单抗大约93%的氨基酸序列(包括大部分框架区）是自人IgGl衍 生，而且约7%的序列是自鼠抗体A4.6.1衍生的。
[0143] 贝伐珠单抗（AVASTIN? )是第一种得到FDA批准的抗血管发生疗法，而且批准 用于治疗转移性结肠直肠癌（一线和二线治疗，与基于静脉内5-FU的化疗组合），晚期非鱗 状，非小细胞肺癌(NSCLC)(不可切除的，局部晚期，复发性或转移性NS化C的一线治疗，与卡 销和帕利他赛组合)和转移性皿R2阴性乳腺癌(先前未治疗的，转移性皿R2阴性乳腺癌，与 帕利他赛组合）。
[0144] 贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体记载于2005年2月26日公告的美国专利 齡.6,884,879。别的抗体包括66或620系列抗体(例如66-31，820-4.1)，如记载于?押公开号 W02005/012359，PCT公开号W02005/044853，和美国专利申请60/991，302，通过述及明确将 运些专利申请的内容收入本文。
[014引依照本发明的G6系列抗体指自G6抗体的序列衍生的抗VEGF抗体或依照PCT公开文 本NO.W02005/012359的图7,24-26，和34-35之任一的66衍生抗体，通过述及将其整个公开 内容收入本文。还可参见PCT公开文本No. W02005/044853，通过述及将其完整内容明确收入 本文。在一个实施方案中，G6系列抗体结合人VEGF上的功能性表位，其包含残基F17，Y21， 922，￥25,063，183和989。
[0146] 依照本发明的B20系列抗体指自B20抗体的序列衍生的抗VEG巧亢体或依照PCT公开 文本No. W02005/012359的图27-29之任一的B20衍生抗体，通过述及将其整个公开内容收入 本文。还可参见PCT公开文本No. W02005/044853和美国专利申请60/991，302，通过述及将运 些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中，B20系列抗体结合人VEGF上如上定义 的功能性表位，其包含残基。17，118,019，￥21，￥25,989，191，1(101，6103，和(：104。
[0147] 在其它实施方案中，在上文所述组合疗法中使用其它抗VEGF抗体，或是作为唯一 的抗VEG巧亢体或是作为上文所述抗VEGF抗体的使用的补充。此类抗体记载于例如美国专利 No.7,060,269,6,582,959,6,703,020；6,054,297；W098/45332；W0 96/30046；WO 94/ 10202 ;EP 0666868B1;美国专利申请公开文本No. 2006009360，20050186208，20030206899， 20030190317,20030203409,和20050112126;和Popkov等，Journal Of Immunological Methods 288 :149-164(2004)。运些其它抗体可W包括那些结合人VEGF上包含残基F17， 118,019，￥21，￥25,989，191，1(101，6103，和(：104或者包含残基。17，￥21，922，￥25,063，183和 Q89的如上定义的功能性表位的。
[0148] 在一些实施方案中，在本文所述任一方法中有用的抗VEGF抗体可W具有轻链可变 区，其包含下述氨基酸序列：
[0149] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
[0150] RFSGSGSGTDFTLTIS^QPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR
[0151] (SEQ ID NO: 1)和重链可变区，其包含下述氨基酸序列：
[01W] EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
[0153] AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAFD TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
[0154] (沈Q ID NO:2)。
[0155] 在还有其它实施方案中，抗VEGF抗体可W是未缀合的，诸如裸的抗VEG巧亢体，或者 可W为进一步的有效性与另一分子缀合，诸如例如为了改善半衰期。在任何方法和用途中， 缀合的抗体和/或它结合的抗原被细胞内在化，导致缀合物在杀伤它结合的癌细胞(例如成 胶质细胞瘤癌细胞)方面升高的治疗功效。例如，细胞毒剂可W祀向或干扰癌细胞中的核 酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱，加利车霉素，核酸核酸酶和DNA内切核酸酶。
[0156] IV.药物配制剂
[0157] 要依照本发明使用的本文所述抗体的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体 与任选的药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂混合，W冻干配制剂或水溶液的形式制备供胆 存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al(eds.)(1990) ,The Pharmacological Bases of Therapeutics ,8th Ed.,Pergamon Press;A.Gennaro(ed.),Remington's Pharmaceutical Sciences ,18th Edition ,(1990),Mack Publishing Co .,Eastori, Pennsylvania；AviS et al.,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms :Parenteral Medications Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms : Tablets Dekker, New York；Lieberman et al. , (eds. ) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems Dekker, New York;及Kenneth A.Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。
[0158] 可接受的载剂，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括 缓冲剂，诸如憐酸盐，巧樣酸盐和其它有机酸;抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂 (诸如氯化十八烷基二甲基苄基锭;氯化己烧双胺;苯扎氯锭，节索氯锭;苯酪，下醇或苯甲 醇;对径基苯甲酸烷基醋，诸如对径基苯甲酸甲醋或丙醋;邻苯二酪；间苯二酪;环己醇;3-戊醇;和间甲酪）；低分子量(少于约10个残基）多肤;蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫 球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙締化咯烧酬;氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酷胺，天冬酷胺，组 氨酸，精氨酸或赖氨酸;单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精;馨合剂， 诸如抓TA;糖类，诸如薦糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钢；金属复合物 (例如化-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN?，PLUR0NICS?或聚乙二醇 (PEG) O
[0159] 例示性的抗VEGF抗体配制剂记载于美国专利No. 6，884，879。在某些实施方案中， 抗VEGF抗体在单次使用管形瓶中W25mg/mL配制。在某些实施方案中，在240mga，a-海藻糖 二水合物，23.2mg钢的憐酸盐（一碱基的，一水合物），4.8mg钢的憐酸盐（二碱基的，无水 的），1.6mg聚山梨醋20，和注射用水(USP)中配审Ij 1 OOmg抗VEGF抗体。在某些实施方案中，在 960mga , a-海藻糖二水合物，92.8mg钢的憐酸盐(单碱基的，一水合物），19.2mg钢的憐酸盐 (二碱基的，无水的），6.4mg聚山梨醋20，和注射用水(USP)中配制400mg抗VEGF抗体。
[0160] 适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如美国专利齡.6,267,958(411(173等人）。此 类冻干配制剂可W用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文 中要治疗的哺乳动物。
[0161] 还涵盖括抗剂的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1。
[0162] 本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物(上文提到的第二药物），优选那些 活性互补且彼此没有不利影响的。此类药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的 VEG巧吉抗剂(例如抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗)的量和类型，W及受试者的临床参数。优选 的此类第二药物如上所述。
[0163] 活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分 别是径甲基纤维素或明胶微胶囊和聚（甲基丙締酸甲醋)微胶囊），在胶状药物投递系统中 (例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术 公开于例如Remington'S Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol ,A.Ed. (1980)。
[0164] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述括抗剂的固体疏水 性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子 包括聚醋，水凝胶（例如聚（2-径乙基-甲基丙締酸醋）或聚（乙締醇）），聚交醋（美国专利 齡.3,773,919)，心谷氨酸与心谷氨酸丫乙醋的共聚物，不可降解的乙締-乙酸乙締共聚物， 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林 构成的可注射微球体)及聚-0-(-)-3-?基下酸。
[0165] 用于体内施用的配制剂必须是无菌的。运可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实 现。
[0166] V.试剂盒
[0167] 在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗诊断有成胶质细胞瘤(例如新诊 断的成胶质细胞瘤和/或前神经型成胶质细胞瘤）的患者的材料的制品。制品包括容器，标 签和包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，等。容器可W自各种材料制成，诸 如玻璃或塑料。容器装有有效治疗疾患的组合物，而且可W具有无菌存取口（例如容器可W 是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋）。组合物中的至少一种活性剂 是抗VEG巧亢体(例如贝伐珠单抗）。容器上的或与容器相关的标签指明该组合物用于治疗选 择的疾患。制品可W进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如憐酸盐缓冲盐 水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可W进一步包括从商业和用户立场看需要的其 它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。另外，制品包括包装插页，印有使 用说明书，包括例如指导该组合物的使用者对患者/受试者施用抗VEG巧亢体(例如贝伐珠单 抗)组合物和化疗剂(例如TMZ)。包装插页可W任选包括实施例4中找到的一些或所有结果。
[0168] 抗VEGF抗体可W单独或与其它抗癌治疗性化合物组合包装成试剂盒。试剂盒可W 包括帮助对受试者施用单位剂量的任选成分，诸如用于粉剂形式重建的管形瓶，用于注射 的注射器，定制IV投递系统，吸入器，等。另外，单位剂量试剂盒可W包括关于制备和施用组 合物的说明书。试剂盒可W作为用于一位受试者的单次使用单位剂量或用于特定受试者的 多次使用（W恒定的剂量或其中各种化合物的效力可随治疗进展而变化)制造。试剂盒可W 包括适合于对多位受试者施用的多剂（"大量包装"）。试剂盒成分可W在纸盒，泡罩包，瓶， 管，等等中装配。
[0169] 在一些实施方案中，试剂盒用于对已经接受过两种或少数(例如两种，一种，或零 种)在先抗癌方案的患者的意图使用。 实施例
[0170] 提供下述实施例W例示但非限制当前要求保护的发明。
[0171] 实施例1: AvaGlio研究
[0172] AvaGlio试验评估贝伐珠单抗与替莫挫胺和放疗组合用于新诊断的成胶质细胞瘤 的功效和安全性。运项研究设计为一项贝伐珠单抗加化疗较之单独的化疗的前瞻性，随机 化，双盲，安慰剂对照的III期评估。要成为合格，患者必须具有新诊断的成胶质细胞瘤，有 手术切除或活检后建立的组织诊断。通过将贝伐珠单抗添加至化疗和放疗，AvaGlio试验的 目标是改善具有有限的治疗选项且面对特别差的预后的运群患者的总体存活(OS)和无进 展存活(PFS)。主要目的是比较随机化至仅替莫挫胺(TMZ)和放疗或替莫挫胺和放疗加贝伐 珠单抗的患者的OS和PFS。
[0173] AvaGlio研究的概览
[0174] 运项试验由S个阶段(并行，维持，和单一疗法)和两个治疗分支(TMZ和放疗(RT)