专利名称：在人正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中具有表达差异的基因nspl1的制作方法
技术领域：
本发明为一个在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因/蛋白，人的类神经内分泌特异蛋白1的基因及其编码蛋白，(human neuroencocrine specific proteinlike gene/protein，hNSPL1/hNSPL1)，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。
第一个RTN家族的成员C1-13是在成年鼠的脑cDNA文库中被发现。经过Northern杂交证实，C1-13只在神经系统非胶质细胞中表达。随后，在人的脑cDNA文库中又克隆出与鼠的C1-13高度同源的基因NSP(neuroendocrine-specific protein)，总共具有三个转录本NSP-A、NSP-B、NSP-C，大小分别为3.4kb、2.3kb、1.8kb，编码具有776、356、208个氨基酸残基的蛋白质。其核酸序列的3’端十分保守，因此，它们所编码的蛋白在羧基端同源性也很高，并且在这个区域内含有两个很大的疏水区。通过定点突变目前认为，此区域是蛋白与内质网膜相互作用的关键。而蛋白N端的氨基酸多为特异的，无保守性可言，且富含丝氨酸，可作为潜在的磷酸化位点。而大量的实验也证实，在不同的生理状态下，这些磷酸化位点的确处于不同程度的磷酸化，但这些不同的磷酸化水平与各项生理功能的具体关系还没有具体的文献报道。Northern杂交显示，NSP只在神经内分泌特异的组织中表达，例如中枢神经系统、周围神经系统、胰岛、肾上腺髓质或小细胞肺癌组织等(而NSP-B只在小细胞肺癌细胞株NCI-H82中表达)。在免疫细胞化学的研究中发现，NSP蛋白定位于内质网膜上。然而，随后对此家族中新发现的另一种基因(RTN-2)的表达谱分析却显示，该基因不仅仅在神经内分泌特异的组织细胞中表达，在骨骼肌、小肠、周围血细胞中也有较强的信号。因为组织表达谱分析已经超越了神经内分泌特异组织的范围，而这些基因又都定位于内质网膜上，因此被易名为RTN-1、RTN-2。而目前我实验室克隆到的这个cDNA全长属于RTN-3，因为实验结果显示在神经系统中的表达量远远大于其他组织，故命名为NSPL1(neuroendocrine specific protein like)。
就现有的研究状况而言，对于此基因家族的具体功能机制，特别是这其中在神经内分泌组织中具有特异表达的基因，如何对某些或某类神经因子或其他分泌性蛋白的分泌、加工起作用还不能正确认识。但有关NSP基因文献报道NSP基因表达量与神经元的分化，慢性酒精中毒后的行为改变有关，NSP-C基因还能调节Bcl-2、Bcl-XL的功能，并且它还可以作为肿瘤向神经内分泌方向分化的重要标志。而最新研究表明RTN家族中的RTN4可能是中枢神经系统损伤后再生的抑制因子。
发明目的克隆在在人神经胶质细胞瘤与正常神经系统中具有明显表达差异的基因NSPL1，表达其编码蛋白，阐明NSPL1蛋白在神经系统中与神经因子等神经系统分泌蛋白的相互关系，以及从分子水平上阐明其表达差异在神经胶质细胞瘤中机理，从而为干预肿瘤细胞的增殖提供可能的抑癌基因和新药筛选的靶分子。内容与要求本发明的内容是应用基因组信息学原理、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、分子克隆、DNA序列测定技术克隆神经系统特异表达基因NSPL1，并用Northern杂交及原位杂交技术进行了组织细胞与病理表达分析。
该基因/蛋白达到的技术指标为1.人NSPL1全长cDNA为2559bp，其阅读框架为708bp，编码236个氨基酸。人NSPL1全长cDNA为2559bp，其阅读框架为708bp，编码236个氨基酸2.该基因所编码的蛋白C端与RTN家族中的其他成员有较高的同源性，并且在此区域中有两个疏水区，研究表明，这是与细胞膜相互作用的区域。
3.人NSPL1基因在成人与胎儿神经系统中高度表达。在小鼠中存在NSPL1的同源基因，其表达谱要广泛的多。原位杂交显示其在大、小鼠的大脑皮层，海马，齿状回，脑干的多种神经核团及脊髓前后角神经元细胞中高度表达；在正常胶质细胞中无明显信号。神经胶质细胞瘤的原位杂交及免疫组化显示胶质细胞瘤中有明显信号。
4.该基因及其编码蛋白与神经系统正常生理功能的维持及肿瘤发生等生命现象密切相关，可用于脑发育相关疾病，肿瘤发生的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
步骤归纳如下铺板 转膜 杂交 放射自显影 单克隆的环化 测序循环2-3次2.组织Northern杂交及分区膜Northern杂交载有心、脑、肾、肺、肝、胎盘、骨骼肌、胰腺Multiple Tissue Northern(MTNTM)Blot购自Clontech公司。将阳性克隆用HindIII切下的436个bp作为探针。探针标记使用Promega标记试剂盒，室温标记α-32P-dCTP1小时。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTMHybridization Solution。按照Clontech公司杂交使用手册杂交过夜。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。
载有脑组织分区及其他非脑组织的RNA Master BlotTM购自Clontech公司。阳性克隆用Noc I切下的近500bp作为杂交探针，用上述方法标记探针。杂交液采用Clontech公司的ExtressHybTM Hybridization Solution。65℃预杂交30min，后加入标记的变性探针及用于封闭的30ugC0t-1 DNA、150ug ssDNA及50ul 20×SSC，65℃杂交6小时。杂交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用双面增感屏，-70℃曝光。3.小鼠中枢神经系统切片原位杂交利用网上数据库获得与该基因高度同源的小鼠的EST(unigene237377)，并以此设计引物，上游ACAAGGCCCTCAAACTCATTATTC，下游CTTCTTGCTTCACGTGCTTATTCT。在小鼠脑的cDNA文库中PCR得到相应的鼠EST，连接到T-easy载体中，分别用Sal1/T7、Nco1/Sp6酶切，作为原位杂交正反义探针模板。使用Promega的DIG标记RNA探针试剂盒，作体外转录，并引入DIG-C，从而合成地高辛标记的RNA杂交探针。同时用多聚甲醛灌流固定小鼠，取小鼠脑及脊髓组织进行切片，以制备好的正反义探针按照原位杂交手册行漂染杂交。4.利用融合绿色荧光蛋白进行细胞定位分析此cDNA克隆所编码的蛋白序列序列，结合文献报道的将蛋白定位于内质网的锚定基序(retention motif)KXKXX，故将此基因从核酸112-840位(包括翻译起始位点及前面的Kozat序列)融合到绿色荧光蛋白的N端，转染CHO细胞，进行细胞定位。设计上下游引物并分别引入Kpn1、BamH1的酶切位点，上游GGGTACCTTTTCACCCTTCTCCCACCCTCG，下游CGGGATCCGCCTTTTTTTTGGCGATTCCAGG，将PCR获得的片段连于N-EGFP载体中，构建能够表达融合蛋白的重组质粒。利用脂质体将重组质粒转染CHO细胞，48小时后获得高效的瞬时表达。在共聚焦显微镜下观察定位结果。5.蛋白的原核表达、纯化及动物免疫与多克隆抗体的获得设计引物，上游GAAGATCTCTCATTTTCAGTGTCCCGATTGTC，下游GCGTCGACTGGGGCAGGAAGATAGGATTTGAG，以扩增NSPL1蛋白C端。按正确读码框架插入本室构建的可表达26kDa二氢叶酸脱氢酶融合蛋白的pET-30a-DHFR的原核表达载体中。将上述重组克隆转化感受态宿主细胞BL21，1mMIPTG诱导表达，SDS-PAGE检测目的蛋白。
大量表达的融合蛋白NSPL1-DHFR为包涵体形式。采用Qiagen公司的Qiaexpress系统初步纯化，得到洗脱后初步纯化的蛋白。为进一步纯化目的蛋白，将初步纯化后的产物再进行SDS-PAGE电泳，割胶回收，并将回收的胶块捣碎，在100mMTris-HCl中4℃浸泡48小时。
以纯化后的目的蛋白免疫饲养的新西兰纯种大白兔(方法见分子克隆)。经过一次基础免疫和两次加强免疫后，每次免疫后一周收集的抗血清并经ELISA检测抗体滴度。待达到所要求滴度，则颈动脉放血，收集抗血清，分装-70℃保存。6.组织蛋白的提取与Western杂交按照分子克隆的方法提取小鼠不同组织的蛋白。将所提取的蛋白质定量后进行12％SDS-PAGE电泳。电泳完毕，以Bio-Rad公司的Mini-Cell电转系统在含2.9‰甘氨酸，5.8‰Tris，0.37‰SDS和20％甲醇的电转液中进行转膜。将电转后的硝酸纤维膜放入含5％脱脂奶粉，1％封闭用羊血清，0.1％Tween20的TBS封闭缓冲液中，室温缓慢振荡2hr以封闭非特异性结合位点。一抗以1∶8000稀释于封闭液中，4℃振荡孵育过夜。20ml TBS洗3次，每次10分钟；将膜置于封闭缓冲液中振荡30分钟。1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG室温振荡孵育2小时。TBS缓冲液洗3次，每次10分钟。置于染色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl PH9.5)5分钟。将膜置于含BCIP/NBT的染色液中(同组织原位杂交)，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显色。7.免疫组织化学采用与原位杂交相同的方法灌流固定小鼠，并取材小鼠的中枢神经系统(包括脑、脊髓)，-20℃40-50um冰冻切片。在0.3％Triton-X-100的1×PBS中4℃预处理3-4天后，用封闭液(含1％BSA、1％羊血清、0.3％Triton-X-100的1×PBS)室温震荡封闭2小时。然后以适当比例的封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。用含有0.3％Triton-X-100的1×PBS漂洗3次后，1∶1000生物素标记的二抗在含1％BSA，1％羊血清，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室温震荡2.5小时。再漂洗3次，然后1∶1000生物素-亲和素-辣根过氧化物酶(预先混合半小时)在含1％BSA，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室温震荡2小时。漂洗后就可以利用辣根过氧化物酶的酶促反应DAB-镍显色(显色液配制46ml50mmol/L Tris-HCl，1ml 1％DAB，3ml 6.88％硫酸镍铵，7.5μl 30％H2O2)。8.人NSPL1全长cDNA和氨基酸序列1T TTT ATT CAG GTC CCG CCT CGG AGC AGG CGG AGT AAA GGG ACT TGA GCG AGC CAG TTG CCG GAT TAT TCT ATT TCC7677 CCT CCC TCT CTC CCG CCC CGT ATC TCT TTT CAC CCT TCT CCC ACC CTC GCT CGC GTA GCC ATG GCG GAG CCG TCG GCG 1541 M A E P S A 6155 GCC ACT CAG TCC CAT TCC ATC TCC TCG TCG TCC TTC GGA GCC GAG CCG TCC GCG CCC GGC GGC GGC GGG AGC CCA GGA 2327 A T Q S H S I S S S S F G A E P S A P G G G G S P G 32233 GCC TGC CCC GCC CTG GGG ACG AAG AGC TGC AGC TCC TCC TGT GCG GTG CAC GAT CTG ATT TTC TGG AGA GAT GTG AAG 31033 A C P A L G T K S C S S S C A V H D L I F W R D V K 58311 AAG ACT GGG TTT GTC TTT GGC ACC ACG CTG ATC ATG CTG CTT TCC CTG GCA GCT TTC AGT GTC ATC AGT GTG GTT TCT 38859 KT G F V F G T T L I M L L S L A A F S V I S V V S84389 TAC CTC ATC CTG GCT CTT CTC TCT GTC ACC ATC AGC TTC AGG ATC TAC AAG TCC GTC ATC CAA GCT GTA CAG AAG TCA 46685Y L I L A L L S V T IS F R I Y K S V I Q A V Q K S 110467 GAA GAA GGC CAT CCA TTC AAA GCC TAC CTG GAC GTA GAC ATT ACT CTG TCC TCA GAA GCT TTC CAT AAT TAC ATG AAT 544111 E E G H P F K A Y L D V D I T L S S E A F H N Y M N136545 GCT GCC ATG GTG CAC ATC AAC AGG GCC CTG AAA CTC ATT ATT CGT CTC TTT CTG GTA GAA GAT CTG GTT GAC TCC TTG 622137 A A M V H I N R A L K L I I R L F L V E D L V D SL162623 AAG CTG GCT GTC TTC ATG TGG CTG ATG ACC TAT GTT GGT GCT GTT TTT AAC GGA ATC ACC CTT CTA ATT CTT GCT GAA 700163K L A V F M W L M T Y V G A V F N G I T L L I L A E188701 CTG CTC ATT TTC AGT GTC CCG ATT GTC TAT GAG AAG TAC AAG ACC CAG ATT GAT CAC TAT GTT GGC ATC GCC CGA GAT 778189L L I F S V P I V YE K Y K T Q I D H Y V G I A R D 214779 CAG ACC AAG TCA ATT GTT GAA AAG ATC CAA GCA AAA CTC CCT GGA ATC GCC AAA AAA AAG GCA GAA TAA GTA CAT GGA 856215 Q T K S I V E K I Q A K L P G I A K K K A E236857 AAC CAG AAA TGC AAC AGT TAC TAA AAC ACC ATT TAA TAG TTA TAA CGT CGT TAC TTG TAC TAT GAA GGA AAA TAC TCA 934935 GTG TCA GCT TGA GCC TGC ATT CCA AGC TTT TTT TTT AAT TTG GTG TTT TCT CCC ATC CTT TCC CTT TAA CCC TCA GTA 10121013 TCA AGC ACA AAA ATT GAT GGA CTG ATA AAA GAA CTA TCT 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TGC GTG CAA CAT AAA AAT ACA GTA GCA CCT AAG GAG CTT GAA TTT TGG TTC CTG TAA AAT TTC 24942495 AAA TTG ATG TGG TAT TAA TAA AAA AAA AAA AAA AAC ACA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 2559
权利要求
1.本发明涉及一神经系统高度表达的基因NSPL1，其特征在于互补脱氧核苷酸(cDNA)全长2559bp，含一个708bp的完整开放阅读框，编码236个氨基酸，分子量为30kDa的蛋白质。
2.根据权利1要求所述之神经系统高度表达的基因NSPL1，其特征在于在神经系统高度表达，在海马，大脑皮层，脑干及其他部位的神经核团的神经元细胞中高表达，在正常神经胶质细胞中无明显信号。
3.根据权利1、2要求所述之神经系统高度表达的基因NSPL1，其特征在于所编码蛋白属于RTN家族，该蛋白的N端为特异性的，C端与家族其他成员相比为保守的，并且，在此区域中具有两个大的疏水区。
4.根据权利1、2、3所述之人神经系统高度表达基因NSPL1，其特征在于该基因及其所编码的蛋白在神经胶质细胞瘤与正常神经胶质细胞中的表达具有明显差异。
全文摘要
本发明涉及一个在人神经系统中高度表达的基因(NSPL1)，包括互补脱氧核苷酸(cDNA)序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码的蛋白质定位于细胞的内质网膜上，在正常神经细胞元中高度表达，在正常神经胶质细胞与神经胶质细胞瘤中的表达具有明显差异。在维持神经系统的生理功能及某些神经系统疾病的发生过程中可能具有重要的作用。
文档编号C12N15/12GK1408868SQ0114144
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者袁建刚, 强伯勤, 彭小忠, 黄晓玮 申请人:中国医学科学院基础医学研究所