专利名称：星形胶质细胞磷酸化蛋白pea－15的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15用作检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术：
肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。
到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。
因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。
星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15(Astrocytic phosphoprotein PEA-15；Phosphoproteinenriched in diabetes；PED；HMAT1)的Genebank登录号为gi|21359835，NCBI的登录号为NP_003759，Swissprot登录号为Q15121，IPI号为IPI00014850.2。星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15(Astrocytic phosphoprotein PEA-15；Phosphoprotein enriched in diabetes；PED；HMAT1)是一个15KDa大小的蛋白，含有一个DED结构域(death effector domain)，最初是被作为PKC的底物而发现的。它通过抑制Ras的活性，从而释放整合素的活性以及调节ERK MAP激酶信号通路。它能够使RPS6KA3滞留在细胞质中，从而抑制其活性，同时它能够抑制TNFRSF6和TNFRSF1A介导的CASP8激活和细胞凋忘；另一方面，星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15通过调节葡萄糖转运蛋白从而在二型糖尿病中其重要作用(http://ca.expasy.org/uniprot/Q15121)。
在一篇EMBO的文献中(PED/PEA-15 gene controls glucose transport and isoverexpressed in type 2 diabetes mellitus，The EMBO Journal Vol.17 No.14 pp.3858-3866，1998)报导了PED/PEA-15在二型糖尿病中高表达。在这篇文献中，他们用PED/PEA-15基因转染肌细胞L6细胞系，发现细胞膜上的Glutl transporters增加，而抑制了胰岛素刺激依赖的葡萄糖装运蛋白在膜上的表达。这表明用PED/PEA-15基因的过表达导致了在二型糖尿病中对胰岛素的抗性。
在另一篇Oncogene的文献中(PED/PEA-15an anti-apoptotic molecule that regulatesFAS/TNFRl-induced apoptosis，5 August 1999，Volume 18，Number 31，Pages 4409-4415)报导了过表达PED/PEA-15能够抑制FasL和TNFa介导的细胞凋忘，而PED/PEA-15这一过表达又能够被PKC的活性所抑制。这篇文献表明，PED/PEA-15是一个内源的能够抑制FAS和TNFRl介导的细胞凋忘的蛋白。
但是到目前为止，现有技术中未见有关于有星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15与肝细胞癌的相关性的报道。
发明内容
通过筛选在肝细胞癌癌组织以及肝细胞癌癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15。进一步的免疫印迹实验证实，星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中上调表达)。
基于星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌。
因此，本发明的首要目的即在于提供一种星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15用作检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测肝癌的制剂的应用。
本发明的再一个目的还在于提供一种抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测肝癌的试剂盒的应用。
本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝细胞组织中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的表达是否异常的方法，该方法包括以下步骤A、用特异性抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体检测待测肝细胞中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量；
B、将步骤A测得的星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量与正常肝组织中的星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测肝组织中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的表达异常。
虽然现有技术中有关于星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15与细胞凋亡的相关报道，但是到目前为止，还没有星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15与肝细胞癌的相关性的报道，因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
图1显示了对星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的免疫印迹分析结果，Beta-actin为对照。
图2显示了对随机抽取的36例肝癌患者血清样品、24例乙肝而非肝癌患者的血清样品以及36例正常人血清样品中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的免疫印迹分析结果，transferrin为对照；其中N代表正常人血清，I代表乙肝而非肝癌患者血清，C代表肝癌患者血清。
图3为采用R数据分析软件对图2的免疫印迹图谱进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以同位素亲和标签与凝胶增强的液质联用技术(gel-enhanced liquid chromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinitytag，GeLC-MS-ICAT)对其中的蛋白进行鉴定并比较其表达量，结果发现星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝细胞癌癌组织中高表达。免疫印迹实验进一步证实星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。
因此，以星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌，即星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15可以用作检测肝癌的蛋白质分子标记。
实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备本实施例中所使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司。
本实施例以非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品，具体如下手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲异噁唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，细胞沉淀分别溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪(Soniprep 150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，15000r/min、4℃离心1h。取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-80℃保存备用。
以上述方法制备11对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品。11例肝细胞癌标本均来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。均为男性，平均年龄48.5岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，11例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的10例(90.9％)；9例肿瘤大于5cm。11例肝细胞癌标本的病理资料详见表1。
表1、11例肝细胞癌标本的病理资料
本实施例所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品，所有11例肝细胞癌病例有极相似的病例诊断指标均为男性，平均年龄48.5岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，11例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的10例(93.75％)；9例肿瘤大于5cm。这种取样方法有利于降低个体间差别对实验分析工作的影响。
实施例2、差异表达蛋白的筛选本实施例中使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司；cleavable ICAT试剂购自Applied BiosystemsFramingham，MA公司。
过硫酸胺(AP)、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest软件等为Bio-Rad产品。
Avidin亲和柱购自Applied Biosystems，Framingham，MA公司。
LCQTMDeca XP system和ProteomeXTMWorkstation购自Thermo Finnigan公司。
所使用的上样缓冲液的组成为1mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.6ml，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，巯基乙醇0.5ml，蒸馏水1.9ml，少量六溴酚蓝。
首先采用同位素亲和标签与凝胶增强的液质联用技术(gel-enhanced liquidchromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinity tag，GeLC-MS-ICAT)对实施例1得到的11对蛋白质样品中的其中一对(病例编号为429)肝细胞癌的癌组织及癌旁组织中的差异表达蛋白进行筛选鉴定，方法参照2003年Steven P.Gygi发表在MCP上的文献(Jiaxu Li et al.Mol Cell Proteomics.2003 Nov；2(11)1198-204.Epub.2003 Sep.23)，具体过程如下NESP法制备的一对肝细胞癌癌组织与相应癌旁组织蛋白质样品(病例编号为429)，分别取100μg，先用TBP还原蛋白质，而后分别用cleavable ICAT试剂(C12和C13)标记(其中C12与C13分别对应癌组织与相应癌旁组织，标记方法参照产品说明书)。混合后加入适量上样缓冲液，跑5％浓缩胶(上层胶)和7.5％～17.5％分离胶(下层胶)，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶，保持至溴酚蓝前沿入浓缩胶8cm左右。
考染染出条带后，将整个上样条带平均切为8份，每份再分别切成1mm3的小块，在100mM NH4HCO3、30％ACN中脱色，真空冷冻干燥，100μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白质胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入50μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解过夜。
抽提蛋白(60％ACN、0.1％TFA)，真空冷冻干燥。酶解后的每份肽段混合物经Avidin亲和柱纯化出已标记肽段后，再用LCQTMProteomeXTMWorkstation进行液相串联(LC-MS/MS)质谱鉴定，Bioworks软件(Thermo finnigan公司)进行数据库搜索并用relex软件(Scripps Research Institute，USA)进行数值计算。
运用NESP法和GeLC-MS-ICAT技术，我们共鉴定到426种有定量关系的蛋白质。其中两倍以上量变的蛋白质共201种，肝细胞癌癌组织高表达的有155种蛋白质；肝细胞癌癌旁组织高表达的有46种蛋白质。
用LC-MS/MS质谱鉴定、数据库搜索及比值计算得3个含Cys的肽段被总共鉴定到2次，与星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15(Astrocytic phosphoprotein PEA-15)相符，氨基酸覆盖率为8.46％。relex软件计算结果显示星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝细胞癌癌组织中高表达，癌组织/癌旁组织的比值为3.367(SD＝0)，详细的鉴定情况及肽段打分结果见表格2(表格中C*代表C13标记的Cys)。
表2、GeLC-MS-ICAT中3个含Cys的肽段的详细鉴定结果。
实施例3、星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15差异表达的免疫印迹验证为确认星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的差异表达，取10位肝细胞癌患者的癌组织及相应癌旁组织蛋白质样品(NESP法制备，表1中除429例以外的其它10例)，用购买的抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下每个样品取20μg蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用兔抗人星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15单抗(购自Biosource公司，1∶1000稀释)，室温孵育2小时，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化钠8g，Tween 20ml，用HCl调节pH到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000稀释)室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECL plus试剂(Amersham Biosciences)反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图1所示。同时我们采用beta-actin作为等量上样的对照(beta-actin单抗购自abcam公司，1∶1000稀释，二抗为小鼠)，结果如图1所示。
图1的免疫印迹结果显示，10对癌组织与癌旁组织基本上是等量上样，并且10对癌组织与癌旁组织中除一对(48)不甚明显外，其余各对均呈现癌组织中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的杂交条带的浓度明显高于相应的癌旁组织的现象；可见星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝细胞癌的癌组织中存在高表达，该结果与质谱检测结果一致。
为了能够体现更好的应用价值，我们随机挑取了36例肝癌患者的血清(样品资料见表3)，24例乙肝而非肝癌患者的血清(样品资料见表4)，36例正常人血清(样品资料见表5)，随机进行分组(每一组包含一例正常人血清、一例乙肝而非肝癌患者血清，一例肝癌患者血清)，每例样品取10ug蛋白质样品，同样运用上述的免疫印迹方法进行检测，同时采用transferrin作为等量上样的对照(transferrin单抗购自abcam公司，1∶1000稀释，二抗为小鼠)，结果如图2所示。
同时，我们采用R数据分析软件(免费从http://www.r-project.org/下载)对图2的免疫印迹图谱进行数据分析，得出蛋白质表达量的相对分布图，结果如图3所示。
从图2和图3我们可以看出，所有样品的上样量基本相同(从图3的transferrin中可以得出此结论)，但是星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝癌患者血清中的表达量明显的高于正常人血清中的量，可见星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝细胞癌患者的血清中高表达，该结果与质谱检测结果一致。
综上所述，星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15在肝细胞癌的癌组织及癌旁组织中存在差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此，以星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体，包括各种抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的表达量，因而可以用于检测肝癌，或者用于制备检测肝癌的制剂或试剂盒等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
虽然有关星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将其作为检测肝癌的标记物却是肯定的。星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15可作为肝细胞癌的潜在标志，而其在胞内的生物学功能提示星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。
表3、肝癌血清样品资料
表4、乙肝血清样品资料
表5、正常血清样品资料
权利要求
1.一种星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的应用，其特征在于，用作检测肝癌的蛋白质分子标记。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝癌的蛋白质分子标记是检测该蛋白在肝细胞组织中的表达量。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测该蛋白在肝细胞组织中的表达量是检测该蛋白在肝细胞组织中是否存在上调表达。
4.一种抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体的应用，其特征在于，用于制备检测肝癌的制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
6.一种抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体的应用，其特征在于，用于制备检测肝癌的试剂盒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
8.一种体外检测肝细胞组织中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的表达是否异常的方法，其特征在于包括以下步骤A、用特异性抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体检测待测肝细胞中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量；B、将步骤A测得的星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量与正常肝组织中的星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测肝组织中星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的表达异常。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
全文摘要
本发明通过筛选在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白，找到了一种在肝细胞癌的癌组织中高表达的蛋白，免疫印迹实验进一步证实了星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA－15的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。鉴于星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA－15与肝细胞癌的这种相关性，该蛋白可以用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
文档编号G01N33/577GK1952662SQ20061011588
公开日2007年4月25日 申请日期2006年8月16日 优先权日2005年8月26日
发明者曾嵘, 周晓, 李辰, 袁新雨 申请人:中国科学院上海生命科学研究院