专利名称：一种星形胶质细胞分离和培养方法
技术领域：
本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种星形胶质细胞体外分离和培养方法。
背景技术：
在中枢神经系统内，胶质细胞的数量几乎占90 %，而星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大的一种，与少突胶质细胞合称为大胶质细胞。传统研究大多把焦点集中在神经元上，认为星形胶质细胞只对神经元起营养支持作用，而对神经信号的传递和处理不起作用，现已证实星形胶质细胞在中枢神经系统的发育及病理生理过程中起重要作用，它还具有摄取、灭活和供给神经递质，抗氧化、营养修复以及抑制神经元过度兴奋并参与了学习和记忆等脑的高级功能活动，加深了对星形胶质细胞的功能认识。随着对其功能的了解，它已逐渐·成为神经生物学领域研究的热点。但由于在体内星形胶质细胞与其它神经细胞混杂存在，妨碍了其生物学功能的研究及应用。因此需要对星形胶质细胞进行体外培养并纯化，才能深入了解其形态结构和生物学功能。目前尚未见有关星形胶质细胞体外分离或培养方法的专利文献公开，虽然星形胶质细胞采用常规细胞培养技术，能够在一定程度上达到培养的目的，但存在着细胞污染严重，传代次数少，成纤维细胞等其他杂细胞很难分离等问题，不能满足细胞实验的要求。本室参照国内外培养分离胶质细胞的方法。根据多年的实验研究，改进了大脑皮质星形胶质细胞的体外培养方法，为后续实验对星形胶质细胞的生物学作用研究提供了实验模型。经长期观察表明星形胶质细胞与成纤维细胞在培养过程中贴壁黏附的速率存在较大差异，成纤维细胞贴壁较快，因此我们采用差速黏附处理方法，来分离去除大部分成纤维细胞成分；此外鉴于星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元等细胞的生长特性不同，神经元在体外不再分裂更难以传代，而星形胶质细胞在体外的增殖速度远大于少突胶质细胞，因而随着原代培养时间的延长以及传代培养的多次传代，少突胶质细胞的比例越来越少，从而达到将星形胶质细胞与其他神经细胞分离的目的。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养星形胶质细胞的方法，使之简单易行，培养获得的星形胶质细胞较纯，生长良好，细胞增殖快，可多次传代，可满足各种细胞生物学实验的需求。采用以下方案来实验本发明的目的。一种体外分离和培养星形胶质细胞的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后筛网过滤、细胞原代培养、传代培养、星形胶质细胞鉴定5个实验步骤。一)大脑皮质组织分离
无菌条件下，用镊子镊取动物双侧大脑皮质置于盛有D-Hank’ s液的培养皿内，小心剥离脑膜和血管组织，将大脑皮质移至另一个盛有适量DMEM培养液的培养皿内。二)组织细胞捣碎后筛网过滤无菌条件下，剪碎大脑皮质成糜状，在盛有DMEM培养液的培养皿内以不锈钢筛网过滤，同时用注射器芯在不锈钢筛网上进一步碾碎脑组织，滤液转移至一无菌的玻璃培养瓶内。三)原代培养
培养瓶中加入适量DMEM培养液用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，加入终浓度为20%的小牛血清或胎牛血清，调整细胞密度为I. 0 X IO5个/ml，置37°C、5% CO2培养箱中差速粘附处理30 60分钟，以去除成纤维细胞成分，然后翻转培养瓶，吸取细胞悬液接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养瓶。最后置入37°C、5% CO2培养箱中培养，以后每隔2 3天换液并逐渐调整血清浓度为10%。在本步骤中采用的差速粘附技术，主要目的是部分去除贴壁较快的细胞如成纤维细胞。此外由于原代细胞生长比较缓慢，所以初始培养加入20%的小牛血清(高血清浓度也有助于细胞贴壁),在原代培养第3次换液时血清浓度可降为15%,在第I次传代培养时(一 般是培养11天左右)，血清浓度可以降为10%，以后按此血清浓度培养直到第4次传代。四)传代培养
原代细胞培养到星形胶质细胞融合成单层并铺满瓶底后，即可传代，弃瓶内旧培养液，用D-Hank’s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3 5分钟左右，并在倒置显微镜下观察胶质细胞的消化情况，待细胞变圆，并约有三分之二的细胞漂浮在液体中时，立即用等体质的小牛血清中止消化，防止胰酶消化过度而影响星形胶质细胞的活力，用吸管反复吹打培养瓶底部，尽可能将全部贴壁的星形胶质细胞吹打下来，再加入DMHM培养基，最后按照细胞密度约I. OX IO5个/ml，终浓度为10%的小牛血清，每瓶5ml接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养瓶，以后按这种方法继续传至第4代，用于后续实验。五)星形胶质细胞鉴定
星形胶质细胞具有特殊的胶质原纤维，由胶质纤维酸性蛋白(GFAP)组成，纯化培养的星形胶质细胞通过兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色(ABC法)鉴定。将第4次传代后的星形胶质细胞按I. OX 105个/cm2的密度种植在多孔培养板内，孔内预先放有涂鼠尾胶原的盖玻片，37°C、5% CO2培养箱孵育24小时后，进行GFAP染色鉴定，显微镜下观察染色情况，以出现阳性染色而背景不着色为准，中性树胶封片后在显微镜下计数并拍照。本发明较现有技术具有以下特点和优势1)细胞分离与原代培养时不用胰酶消化，减少了胰酶消化过度对细胞的损伤；2)筛网过滤，将细胞团分散成单个细胞；3)采用差速粘附处理，可以去除大部分成纤维细胞成分，因为成纤维细胞贴壁较快；4)传代培养时不用摇床震荡，大大了缩短实验时间；5)原代和传代培养时采用涂有自制鼠尾胶原的培养瓶，试剂成本低，但可以达到同样的实验效果(鼠尾胶原与文献中报道的多聚赖氨酸作用类似，主要是起到促进细胞贴壁的作用，但是前者的成本远远低于后者);6)经过4次传代培养，基本上可以去除其它神经细胞，达到纯化星形胶质细胞的目的；7)传代培养过程中每次换液及传代前，用D-Hank’ s液洗培养瓶，以反复去除贴壁较慢的其它神经细胞；8)每次实验操作时间短，I 2小时完成；9)实验费用低，所需试剂、仪器设备少。这种改进的星形胶质细胞培养方法及实验参数是根据多年的实验研究摸索获得，采用该方法获得星形胶质细胞经GFAP免疫组化染色鉴定其纯度达95%以上，完全符合实验要求。此外，当前国内外星形胶质细胞的培养方法所需仪器设备较多，而且实验耗用时间较长，而本室改进的星形胶质细胞培养方法，实验所需器材及仪器设备较少，实验操作时间较短，所需药品少，培养的星形胶质细胞完全符合实验要求，其科学性和实验结果的可靠性属国内领先水平，为神经学科研究提供了基本的实验模型，为神经细胞再生功能研究以及缺氧、药物等因素对星形胶质细胞影响的研究提供了基本的实验模型。我室以前采用该法培养的星形胶质细胞，对其功能研究发现了许多已知和未知基因在应激过程中表达出现明显变化。实验证明本方法可用于胎鼠、新生大鼠、小鼠、豚鼠等相对脆弱的组织，如大脑皮质星形胶质细胞等的培养，实验方案一致。但对于成年人类来说，由于大脑皮层组织比较坚韧，用此法难以达到目的。但实验表明取材引产胎儿的大脑皮层组织，采用本方法也能达到相同的效果，以胎龄5个月最为合适。实验中应注意以下操作1)每次传代用胰酶消化细胞时，要把握消化的程度，既不能消化过度，又不能消化不完全，待约有三分之二的细胞变圆并悬浮在消化液时，应立即用小牛血清终止消化，避免消化过度而影响星形胶质细胞活力，消化不完全时由于部分细胞仍然贴壁而致细胞数量不足；2)用吸管在培养瓶内的吹打要彻底，将培养瓶底每一个角落的细胞都要吹下，避免瓶底角落部位的细胞未吹下也致细胞数量不足。
图I显微镜放大100倍观察星形胶质细胞GFAP免疫组化染色鉴定结果。图2显微镜放大400倍观察星形胶质细胞GFAP免疫组化染色鉴定结果。
具体实施例方式以下内容是本发明一种星形胶质细胞培养方法的具体实施例，以使得本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。但需要说明的是，本发明方法绝不局限于所举的实施例。实施例I :大鼠星形胶质细胞分离和培养
实验动物新生I 3天的SDf 2只(中南大学湘雅医学院实验动物中心提供)，雌雄不限。主要试剂及仪器DMEM (Hyclone公司)，胰蛋白酶(AMERESC0公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，兔抗GFAP多克隆抗体(Sigma公司)，羊抗兔IgG试剂盒(Vector公司),D-Hank’s液(按配方自制),鼠尾胶原(自制)，C02培养箱(FormaScientific公司),倒置显微镜(Olympus公司)。原代培养取新生I 3天的SD乳鼠，用75%乙醇浸泡5 10分钟消毒皮肤，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨后，再用眼科镊取出双侧大脑皮质置于盛有D-Hank’ s液的培养皿内，小心剥离脑膜和血管组织，将大脑皮质移至另一个盛有适量DMEM培养液的培养皿内，剪碎大脑皮质成糜状，以不锈钢网(孔径200i!m)过滤，同时用玻璃注射器芯进一步碾碎脑组织，转移至一个未包被鼠尾胶原的玻璃培养瓶内，加入适量DMEM培养液用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，加入终浓度为20%的新生小牛血清，调整细胞密度为I. OX IO5个/ml，置37°C、5% CO2培养箱中差速粘附处理30 60分钟，以去除成纤维细胞成分，然后翻转培养瓶，吸取细胞悬液5ml接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养、瓶。最后置入37°C、5% CO2培养箱中培养，以后每隔2 3天换液并逐渐调整血清浓度为10%，培养9 14天并在倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞融合成单层并铺满瓶底后，进行消化传代。传代培养原代细胞培养到星形胶质细胞融合成单层并铺满瓶底后，即可传代，弃瓶内旧培养液，用D-Hank’ s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3 5分钟左右，并在倒置显微镜下观察胶质细胞的消化情况，待细胞变圆，并约有三分之二的细胞漂浮在液体中时，立即用等体质的小牛血清中止消化，防止胰酶消化过度而影响星形胶质细胞的活力，用吸管反复吹打培养瓶底部，尽可能将全部贴壁的星形胶质细胞吹打下来，再加入DMEM培养基，最后按照细胞密度约I. OX IO5个/ml，终浓度为10%的小牛血清，每瓶5ml接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养瓶，以后按这种方法继续传至第4代，用于后续实验。星形胶质细胞的鉴定星形胶质细胞具有特殊的胶质原纤维，由胶质纤维酸性蛋白(GFAP)组成，纯化培养的星形胶质细胞通过兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色 (ABC法)鉴定。将第4次传代后的星形胶质细胞按I. OX IO5个/cm的密度种植在6孔培养板内，孔内预先放有涂鼠尾胶原的盖玻片，37 °C、5 % CO2培养箱孵育24小时后，进行GFAP染色鉴定，显微镜下观察染色情况，以出现阳性染色而背景不着色为准，中性树胶封片后在显微镜下计数并拍照。结果
原代培养结果胶质细胞原代培养，一般在2 3天贴壁，有较好的折光性。换培养液后继续培养，可见部分细胞长出细小的胞突，随着培养时间的延长，培养物中星形胶质细胞的比例越来越大而少突胶质细胞等其它细胞比例越来越少，至9 14天时，倒置显微镜下可见少量的少突胶质细胞、成纤维细胞和大量的星形胶质细胞铺满培养瓶底部并融合成单层，这时可以对星形胶质细胞进行传代。传代培养结果星形胶质细胞融合成单层并铺满培养瓶底时进行第I次传代培养，传代后细胞生长更活跃，一般培养5 7天细胞就铺满瓶底，细胞传至第4代后倒置显微镜下主要为形状不规则，胞浆丰富且核浆比较少，胞体分支多，细胞核为椭圆形，常偏于胞体一侧的星形胶质细胞。星形胶质细胞的鉴定结果星形胶质细胞传代到第4代时应用兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定培养细胞，阳性细胞染成棕黄色，阳性率95%以上，证实绝大多数细胞为星形胶质细胞，见图I、图2。实验证明，取材I 3天的大鼠，原代培养9 14天后进行传代，有利于星形胶质细胞进一步纯化。实验结果显示，新生大鼠大脑皮质进行体外培养时，大多数神经元在2 3天死亡，随着培养时间延长，星形胶质细胞贴壁并相互融合，而少突胶质细胞等其它细胞由于生长缓慢、无法融合而悬浮在星形胶质细胞之上，经过换液及多次传代被去除。GFAP免疫组化染色鉴定星形胶质细胞纯度达95%以上，基本上达到了纯化的目的，可满足神经生物学实验的要求。实施例2 :其他动物星形胶质细胞分离和培养
实验证明本方法可用于胎鼠、新生(出生1-3天)大鼠、小鼠、豚鼠等相对脆弱的组织，尤其是大脑皮质星形胶质细胞等的培养，实验方案同上。但对于成年人类来说，由于大脑皮层组织比较坚韧，用此法难以达到目的。但实验表明取材引产胎儿的大脑皮层组织，采用本方法也能达到相同的效果，以胎龄5个月最为合适，胎龄过小 或过大均影响实验结果。采用本方法分离培养的星形胶质细胞纯度达95%以上。
权利要求
1.一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于 a)含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后筛网过滤、细胞原代培养、细胞传代培养4个实验步骤； b)大脑皮质组织分离为在无菌条件下，用镊子镊取动物双侧大脑皮质置于盛有D-HankJ s液的培养皿内，小心剥离脑膜和血管组织，将大脑皮质移至另一个盛有适量DMEM培养液的培养皿内； c)组织细胞捣碎后筛网过滤为在无菌条件下，剪碎大脑皮质成糜状，在盛有DMEM培养液的培养皿内以不锈钢网过滤，同时用注射器芯在不锈钢网上进一步碾碎脑组织，滤液转移至一无菌的玻璃培养瓶内； d)细胞原代培养是在培养瓶中加入DMEM培养液和终浓度为20%的小牛血清，调整细胞密度为I. 0X105个/ml，置温度37°C和C02浓度5%的培养箱中差速粘附处理30 60分钟，然后翻转培养瓶，吸取细胞悬液接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养瓶，最后置入温度37°C和CO2浓度5%培养箱中培养，以后每隔2-3天换液并逐渐调整血清浓度为10%; e)细胞传代培养是在培养到星形胶质细胞融合成单层并铺满瓶底后，弃瓶内旧培养液，用D-Hank’ s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3_5分钟，待细胞变圆并有2/3的细胞漂浮在液体中时，立即用等体质的小牛血清中止消化，用吸管反复吹打培养瓶底部，将全部贴壁的星形胶质细胞吹打下来，再加入DMEM培养基和终浓度为10%的小牛血清，最后接种至预先以鼠尾胶原包被的玻璃培养瓶。
2.根据权利要求I所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于步骤d)所述的细胞原代培养初始加入终浓度为20%小牛血清或胎牛血清，然后在细胞原代培养第3次换液时小牛血清或胎牛血清浓度降为15%，随后在步骤e)第I次传代培养时小牛血清或胎牛血清浓度降为10%。
3.根据权利要求I所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于步骤c)所述的不锈钢网孔径为200 u m。
4.根据权利要求I所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于还含有星形胶质细胞鉴定的步骤。
5.根据权利要求4所述的星形胶质细胞鉴定的步骤，其特征在于星形胶质细胞鉴定采用兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色方法。
6.根据权利要求5所述的星形胶质细胞鉴定的步骤，其特征在于多孔板孔内预先放置涂有鼠尾胶原的盖玻片。
7.根据权利要求I所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于用于胎鼠、新生大鼠、小鼠、豚鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养。
8.根据权利要求I所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于用于引产胎儿大脑皮质星形胶质细胞的培养。
9.根据权利要求8所述的一种星形胶质细胞分离和培养方法，其特征在于所述引产胎儿胎龄为5个月。
全文摘要
一种星形胶质细胞分离和培养方法，能适用于多种实验动物以及人类。本方法主要是针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养星形胶质细胞的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后筛网过滤、细胞原代培养、传代培养、星形胶质细胞鉴定5个实验步骤，整个实验简单易行，通过本方法培养获得的星形胶质细胞纯度能达到95%以上，且生长良好，细胞增值快，可多次传代，能满足各种细胞生物学实验的需求。
文档编号C12N5/079GK102703387SQ20121022354
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者刘发益, 邬力祥, 黄柏胜 申请人:黄柏胜