专利名称：能抑制口蹄疫病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种应用RNAi技术设计的抗口蹄疫病毒质粒载体，并用于哺乳动物转基因抗病育种。
背景技术：
家畜口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)有 A、0、C、SAT I、SAT II、 SAT III及Asia I等共7个血清型。口蹄疫病毒各型之间无交叉免疫反应，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另一种类型病毒的感染，已经发现在许多地区会有一个以上病毒流行。如果用一个型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。为了克服这种免疫的局限性，研究具有广谱抗口蹄疫病毒作用的制剂有重要的实践意义。另外，由于FMDV的具有快速传染性和强致病性的特点，给使用传统的疫苗快速控制口蹄疫的流行带来了障碍。RNAi技术是科学研究领域近年来取得的重大成就之一，它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现，RNA干扰对于抑制这些病毒的复制具有较好的效果，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是在自然界中，各种病毒都会存在不同突变株，口蹄疫病毒就有七种血清型和很多的变异株，这给口蹄疫病毒病的防治工作带来了巨大的困难。另一方面，RNAi有效作用时间较短的特点也给其使用带来一定的问题。在目前已有的科研报道中，RNAi必须在实际病毒感染前1-2天内接种动物才能获得较为理想的抗病毒效果。此外，siRNA/shRNA能否到达口蹄疫病毒在动物体内感染与复制的部位就成为RNAi是否能够高效的干扰靶基因进而抑制病毒的重要问题。所以本发明选取了 FMDV基因组中高度保守的区段作为靶序列，构建能同时表达两种shRNA的转基因质粒载体。再用转基因技术将上述质粒转入细胞或小鼠，使可传代细胞和转基因传代动物产生抗FMDV感染能力。本发明为RNAi技术用于猪、牛、羊等家畜的抗病育种，培养转基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技术路线。
发明内容
本发明目的是提供一种能高效的抗口蹄疫病毒重组质粒，该重组质粒能通过不同的方法抑制同一型中不同毒株或者不同型的口蹄疫病毒在动物细胞和个体中的复制与感染。本发明的另一目的是提供该抗口蹄疫病毒重组质粒在转基因育种中的应用。本发明提出的抗口蹄疫病毒重组质粒，记为PB-EN3D2B，该质粒含有两个shRNA表达基因，能同时编码两种分别靶向口蹄疫病毒基因组3D RNA聚合酶和2B非结构蛋白保守区域的特异shRNA ;其中，所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中3D基因；所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中2B基因；两个shRNA表达基因呈串联状态。本发明提供的的抗口蹄疫病毒重组质粒，其中，在两个shRNA表达基因之间还可插入如报告基因之类的其他基因，得到具有同样抗口蹄疫病毒功能的衍生重组质粒。本发明中，所选择的保守区基因3D和2B来自任何一型的口蹄疫病毒，如0型、A型、亚洲I型等。本发明提供的PB-EN3D2B，其表达的shRNA序列是以各个血清型、各个亚型、不同毒株的基因组序列为基准，选取FMDV中特异的3D和2B基因为干扰靶点设计得到的。将该重组质粒通过PB转座子或者直接转染的办法整合入组织培养细胞或动物的基因组，获得单克隆转基因细胞系或者转基因动物家系。特定的转基因细胞系或转基因动物家系可以有 效地抵抗不同型FMDV的复制与感染，如抵抗0型、A型、亚洲I型等复制与感染。本发明提出的重组质粒中，其表达的ShRNA干扰靶点分别为FMDV的3D和2B基因的保守区域(如图1)，设计时的参考序列是口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株(GenBank登录号 AY317098)，口蹄疫病毒 Asia I 型 Jiangsu 毒株(GenBank 登录号 EF149009)。靶向 3D的shRNA长56 nt，对应口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因的1225-1280位碱基，其正义链序列为SEQ. ID. NOl。靶向2B的shRNA长25 nt，对应口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株2AB基因的57-81位碱基，其正义链序列为SEQ. ID. N02。3D基因编码FMDV的RNA依赖性RNA聚合酶POL，FMDV基因组本身的复制必须由该聚合酶启动。2B基因其生物学功能尚未被完全阐明，但有证据证明，该蛋白与FMDV转录产生的大融合蛋白的剪切，以及病毒粒子的装配密切相关。选用3D和2B基因作为shRNA干扰靶点的另一出发点是，根据基因数据库分析和实际测试毒株序列发现，FMDV的3D和2B基因在不同型和不同毒株中具有很高的序列保守性，而RNAi的干扰效应主要取决于其与靶基因序列上的匹配程度。因此，以这两个基因为依据设计的shRNA具有对不同毒株交叉抑制的潜力。本发明中，靶向3D和2B基因的shRNA序列因不同型口蹄疫病毒或同型中不同毒株的结构特征，可以根据病毒基因中靶点序列，前后浮动适当个数(一般为6个以内)的核苷酸残基，而不影响shRNA对病毒的抑制效应。同时,设计shRNA的序列也可根据不同型口蹄疫病毒或某型中不同毒株的基因变异做相应的改变，这样可以保证shRNA对病毒株有最高效的抑制效果。上述所选定的靶序列中任何连续的19 - 2Ibp长度的RNA序列都可制备为siRNA或shRNA，均有干扰FMDV复制和感染的效果。本发明采取了把两个干扰shRNA基因串联构建到一个质粒载体上的策略(如图2)，当一个shRNA失效时，另一个shRNA可以起到补偿作用。从理论上说，靶向3D和2B这两个在FMDV复制周期中起重要作用的双shRNA将诱导产生更强、更广谱的抑制FMDV复制的作用。本发明提出的两种shRNA分别由RNA聚合酶III类启动子(pol III)小鼠U6启动子和人类Hl启动子在真核细胞中稳定持续表达。前者为核糖体RNA启动子，后者为组蛋白RNA启动子，两者均具有精确的碱基启动位点和终止信号，可以保证shRNA最高效地被启动转录。同时，在真核细胞中调控这两类启动子的DNA依赖性RNA聚合酶含量巨大，可以保证shRNA最大量地被转录。这两种启动子也可以根据需要更换为其他高效的启动子，如7SK和CMV等,而不影响其表达。本发明提出的重组质粒中PB-EN3D2B中，还可含有EGFP与新霉素抗性(Neo-R)两个报告基因，这两个报告基因外端还分别克隆了一个IoxP位点(如图2)。该质粒既可以直接转染细胞使其获得抑制口蹄疫病毒感染的能力，也可以借助PB转座子导入细胞基因组构建抗口蹄疫转基因细胞系和动物。通过对报告基因的组合进行调整，可衍生出类似的抗口蹄疫重组质粒，记为PB-N3D2B，(如图3)。通过Ascl/Hindlll酶切还可以将含有两种shRNA表达元件和报告基因的片段整个切离，方便地装载入其他载体，以适应不同的短效(如腺病毒载体)和长效(如转基因)的传递方式。本发明选取了 FMDV基因组中高度保守的区段作为靶序列，构建能同时表达两种shRNA的转基因质粒载体。再用转基因技术将上述质粒转入细胞，或小鼠或猪、牛、羊偶蹄类 哺乳动物，使可传代细胞和转基因传代动物产生抗FMDV感染能力。具体说来，
本发明的重组质粒可转入哺乳动物细胞系，使该转基因细胞系抵抗FMDV感染。本发明的重组质粒可转入小鼠或猪、牛、羊偶蹄类哺乳动物，使转基因动物后代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。本发明为RNAi技术用于猪、牛、羊等家畜的抗病育种，培养转基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技术路线。具体实验表明，本发明的重组质粒适用于多种转基因技术。当使用PB转座子系统将该质粒转入体外培养的猪细胞IBRS-2后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗20-50 TCID50剂量0型或亚洲I型FMDV毒株感染的能力。当将该质粒通过显微注射导入小鼠受精卵后，筛选得到的转基因小鼠家系使用3-6 LD50 0型FMDV毒株感染时，相对同窝小鼠对照明显提高了存活率。
图I为口蹄疫病毒基因组结构。箭头所指为2B与3D基因shRNA靶点。图2为PB-EN3D2B质粒双串联shRNA基因和报告基因排列图示。3D shRNA基因和2B shRNA基因在质粒上呈串联排列，两个shRNA基因中间是两个报告基因EGFP和Neo_R。图3 为 PB-EN3D2B (A)与其衍生质粒 PB-N3D2B (B)。图4为转基因细胞系20 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度检测。图5为转基因细胞系50 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度检测。图6为转基因细胞系20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度检测。
具体实施例方式实施例I 将质粒PB-EN3D2B与表达PB转座酶的辅助质粒CMV-PBase按I: I的质量比共同转染猪细胞IBRS-2，筛选单克隆转基因细胞系，命名为IB32。筛选得到的细胞系进行攻毒实验，攻毒剂量分别为20 TCID50 0型口蹄疫病毒，50 TCID50 0型口蹄疫病毒和20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒。攻毒结果表明，IB32-6细胞系在三次攻毒实验中均未发生任何病变，细胞上清液中也检测不到任何病毒滴度。IB32-2和IB32-3两株转基因细胞系也体现了显著的抗病毒效果，24小时几乎检测不到病变，48小时的病变状况也比同时期的对照细胞要轻微。这证明由TO-EN3D2B得到的转基因细胞系具有抵抗20-50 TCID5tl、两型口蹄疫病毒的能力。攻毒实验上清病毒滴度检测见图4、5、6。实施例2 PB-EN3D2B的衍生质粒，PB-N3D2B，其Ascl/Hindlll酶切片段回收后通过显微注射的方式导入小鼠基因组，培育转基因小鼠家系。单倍体转基因雄鼠与普通母鼠交配，所生具有约50%转基因比例的后代用于攻毒实验。分别统计转基因乳鼠与非转基因同窝对照的存活率。见表I :
权利要求
1.一种能抑制口蹄疫病毒的转基因重组质粒，其特征在于，该质粒含有两个shRNA表达基因，能同时编码两种分别靶向口蹄疫病毒基因组3D RNA聚合酶和2B非结构蛋白保守区域的特异shRNA ;其中，所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中3D基因；所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中2B基因；两个shRNA表达基因呈串联状态。
2.根据权利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的转基因重组质粒，其特征在于，在所述两个shRNA表达基因之间插入有报告基因。
3.根据权利要求2所述的能抑制口蹄疫病毒的转基因重组质粒，其特征在于，所述报告基因为EGFP与新霉素抗性(Neo-R)，这两个报告基因外端分别克隆了一个IoxP位点。
4.根据权利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的转基因重组质粒，其特征在于，所选择的保守区基因3D和2B来自任何一型的口蹄疫病毒，包括0型、A型、亚洲I型。
5.如权利要求I或2所述的重组质粒在转基因育种中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于将权利要求I或2所述的重组质粒转入哺乳动物细胞系，使该转基因细胞系抵抗FMDV感染。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于将如权利要求I或2所述的重组质粒转入小鼠或猪、牛、羊偶蹄类哺乳动物，使转基因动物后代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。
全文摘要
本发明属于遗传工程技术领域，具体为一种能抑制口蹄疫病毒的转基因重组质粒及其应用。该质粒含有两个shRNA表达基因，能同时编码两种分别靶向口蹄疫病毒基因组3DRNA聚合酶和2B非结构蛋白保守区域的特异shRNA；两个shRNA表达基因呈串联状态。该质粒适用于多种转基因技术。当使用PB转座子系统将该质粒转入体外培养的猪细胞IBRS-2后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗20-50TCID50剂量O型或亚洲Ⅰ型FMDV毒株感染的能力。当将该质粒通过显微注射导入小鼠受精卵后，筛选得到的转基因小鼠家系使用3-6LD50O型FMDV毒株感染时，相对同窝小鼠对照明显提高了存活率。
文档编号C12N15/85GK102703504SQ20121022335
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者严维耀, 刘明秋, 曾溢滔, 焦晔, 郑兆鑫 申请人:复旦大学