病毒基因表达的抑制的制作方法
【专利摘要】本发明涉及修饰的小干扰RNA(siRNA)核酸分子，尤其是通过添加一个2-O胍基丙基修饰的核苷进行修饰的siRNA。特别地，本发明涉及能沉默靶标序列的修饰的siRNA，利用所述siRNA治疗和预防感染的方法，含有所述siRNA的药剂以及所述siRNA的用途。
【专利说明】病毒基因表达的抑制
[0001]引言
[0002]本发明涉及通过RNA干扰途径调苄基因表达的修饰的小干扰RNA分子(siRNA)。编码本发明所述siRNA的核酸分子包括能使它们的物理性质与野生型未修饰的siRNA相比产生差别的一个或多个修饰。在本发明一个优选的实施例中，所述siRNA的核酸序列包括至少一个具有2-0-胍基丙基(GP)结构的核苷。在本发明的进一步的实施例中，所述siRNA的修饰提高了该修饰的siRNA的稳定性，促进该修饰的siRNA导致的基因沉默并减少免疫刺激。
【背景技术】
[0003]合成的RNA干扰(RNAi)激活剂显示出在病理基因沉默的治疗应用方面有着相当大的潜力。一些典型的外源RNA干扰激活剂包括约2 Ibp的在3'末端具拥有2个碱基悬垂的双链RNA。为了提高siRNAs的效果，在核糖的2' -OH基团进行化学修饰。使用这种方法已经证明可提高稳定性，促进基因沉默和减少免疫刺激。尽管这种方法有一定的作用，高效并可控的高负电荷核酸基因沉默子仍然是一个有待解决的问题。
[0004]为了评估在2'位置引入正电荷基团的潜在实用性，我们主要对包含2-0-胍基丙基(GP)结构的新型siRNA的效果评估进行了研究。我们描述了所有四种用丙烯腈进行利用迈克尔加成反应然后进行雷尼镍还原并胍基丙基化的GP修饰的核苷。所使用的这些前体成功地生成抗肝炎B病毒(HBV)siRNA。在病毒复制的细胞培养模式中的实验表明所述GP修饰促进强化了基因沉默。此外，所述GP结构并不影响热力学稳定性，并且在siRNA的种子区域的每个位点导入GP结构并不改变预定HBV靶标的沉默效率。这些结果表明采用GP基团修饰的siRNA在推进合成的RNA干扰激活剂的治疗应用可能起到了一定的作用。
[0005]使用合成的小干扰RNA (siRNA)来启动RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默在治疗应用上具有相当大的潜力[1]，[2], [3]。典型地，siRNA为天然Dicer酶产物的合成模拟物，并且为在3'末端具有2个碱基悬垂的21-25个核苷酸(nt)双链。使用合成siRNA的进展得益于研究反义RNA分子的丰富经验。因此，加速了使用合成siRNA的发展并且siRNA效率的提高得以于有价值的生物的和合成化学的见解。合成的siRNA相比表达的RNA干扰激活剂的优势在于他们可修改的化学修饰以提高稳定性、安全性和特异性[4]，[5]。并且，利用化学合成程序可以实现临床应用所需的可控的大规模制备。然而，尽管具有如此显著的进步，这些聚阴离子的核酸穿过富含脂质的细胞膜的转运仍然是有问题的。用于运载合成RNA干扰激活剂至靶标细胞的载体包括包含脂质复合物的阳离子脂质[6]，共轭肽[7]或寡聚阳离子复合物，例如亚精胺[8]。然而，使用这些方法不一定都能成功。为了克服核酸的过多负电荷的困难，并同时提高热稳定性和血清稳定性，我们前期研究了一种利用阳离子基团进行核糖2'限定修饰的方法[9]，[10]。最初，我们经常得到2' -O-氨乙基-腺苷和2，-O-氨乙基-尿苷。合成限定初始步骤为用溴乙酸甲酯进行的烷化，然后紧接一系列的转化反应。利用荧光素酶报告基因分析来测定基因抑制，结果表明，2' -O-氨乙基修饰至少对W -O Me siRNA修饰是有效的。2' _0_氨乙基衍生物的一个重要特性是当化学修饰发生在siRNA随从链的3'端时它能够援救活性较低的siRNA[ll]。这种途径随后通过开发能够成功对所有四种核糖核苷进行烷化的方法得以改进[12]。这通过利用酞酰亚氨甲基三氟甲烷磺酸作为烷化剂并利用可以形成所有四种承载2' -O-氨乙基支链的亚磷酰胺的方法已经实现。虽然令人鼓舞，但利用这些siRNA试剂的一个问题在于多步化学合成的产率相当低。此外，扩大合成反应也很困难。
[0006]为了解决这些问题，我们已经研究了一种替代的2-0-胍基丙基(GP)核苷修饰的实用方法。采用此处报道的该新方法，我们描述了利用丙烯腈进行迈克尔加成反应[13，14，15]然后进行雷尼镍还原[16]并胍基丙基化获得的所有四种GP修饰的核苷的结构。在B型肝炎病毒复制的细胞培养模型中利用之前显示适合基于RNA干扰的病毒复制抑制的靶标序列对GP siRNA的效率进行评估[17，18，19，20]。结果表明，相比未修饰的对应部分病毒复制标记显示出更高效的沉默。此外，所 述GP修饰的siRNA在血清条件下比未修饰的对照更稳定。
【发明内容】
[0007]本发明提供了修饰的核酸分子和包含所述修饰的核酸分子的制品。
[0008]根据本发明的第一个方面，所述修饰的核酸分子包括修饰的小干扰RNA(SiRNA)核酸分子。所述修饰的siRNA分子包含一条正义链和一条反义链,并且所述正义链中至少一个核苷酸或反义链中至少一个核苷酸是衍生自2-0-胍基丙基(GP)修饰核苷。此外,所述核酸分子能够沉默靶标序列的表达，其中靶标序列是DNA或RNA序列。
[0009]本发明指明了，所述至少一个修饰的核苷酸是选自由2-0-胍基丙基腺苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基鸟苷亚磷酰胺和2-0-胍基丙基尿苷亚磷酰胺组成的组。此外，本发明还提供了包含前述各种亚磷酰胺的组合的siRNA。
[0010]优选地，所述修饰的核酸分子的正、反义链的长度分别为18-26个核苷酸，优选地，长度为19-25个核苷酸，以及最优选地，长度为21个核苷酸。
[0011]优选地，所述至少一个修饰的核苷酸可以位于所述正义链或/和反义链。此外，所述修饰的核酸分子的正义链和反义链优选地都包含人工合成序列。
[0012]应理解的是，所述修饰的SiRNA可以包括一个以任何来自包括微生物、植物或动物的组织的DNA或RNA为靶标的siRNA。优选地，所述siRNA以微生物包括细菌和病毒的互补核酸分子作为靶标。更优选地，所述siRNA以病毒的互补核酸序列作为靶标。可以进一步理解的是，本发明中所述修饰的siRNA是核酸分子。
[0013]在本发明优选的实施例中，所述修饰的siRNA抑制病毒复制。优选地，所述病毒是肝炎病毒，并且最优选地，所述病毒是B型肝炎病毒。
[0014]本发明所述修饰的siRNA相比未修饰的siRNA，在转染进培养细胞和/或体内时，不会诱发可检测的干扰素反应。此外，所述修饰的siRNA相比包含相同序列的未修饰的siRNA,在标准血清分析中具有更大的稳定性。在进一步的实施例中,所述修饰的siRNA相比包含相同序列的未修饰的siRNA表现出更强的对靶标基因表达的抑制。
[0015]在本发明优选的实施例中，所述反义链可以包含如SEQ ID NO:1所示的序列。此外，可以在反义链的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 或 21 等位点或这些位点的任意组合位点插入所述至少一个2-0-胍基丙基(GP)修饰的核苷。[0016]所述反义链包含如SEQ ID NO:1所示的未修饰的序列或如SEQ ID Nos: 5, 6,7, 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 所示的任一序列。
[0017]在本发明的另一个优选的实施例中，所述正义链可以包含如SEQ ID N0:2所示的序列。此外，在所述正义链的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 或21等位点或这些位点的任意组合位点已经插入至少一个2-0-胍基丙基(GP)修饰的核苷。
[0018]所述正义链包含如SEQ ID N0:2所示的未修饰的序列或如SEQ ID Nos:31或32所示序列中的任一序列。
[0019]根据本发明的第二个方面，提供了一种治疗或预防病毒感染的方法，其中所述方法包含向需要其的受试者施用治疗量的本发明的所述核酸分子并佐以药学上可接受的佐剂和/或载体。所述受试者可以是动物，优选地是哺乳动物，并且最优选地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最优先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0020]根据本发明的第三个方面，提供了本发明所述siRNA在治疗或预防病毒感染中的应用，其中所述应用包含向需要其的受试者施用治疗量的本发明的所述核酸分子以及药学上可接受的佐剂和/或载体。所述受试者是动物，优选地是哺乳动物，并且最优选地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最优先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0021]根据本发明的第四个方面，提供了用于治疗或预防病毒感染的药剂的制备方法，其中所述制备方法包含向需要其的受试者施用治疗量的本发明的所述核酸分子以及药学上可接受的佐剂和/或载体。 所述受试者是动物，优选地是哺乳动物，并且最优选地是人。此外，所述病毒感染是肝炎感染，并且最优先地，所述肝炎感染是B型肝炎。
[0022]在本发明的另一方面，提供了包含本发明的所述siRNA和药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂等的制品。此外，还提供了一种包含前述制品和使用该制品的说明的试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]本发明的非限制性的实施例将通过仅仅是例举以及参照下列附图的方式来描述:
[0024]图1显示的是制备寡聚核糖核苷酸所需的2-0-胍基丙基(GP)腺苷，胞苷和尿苷亚磷酰胺的合成，(i)丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室温；(ii)H2N-NH2.H20、甲醇、室温(腺苷和胞苷衍生物);尿苷衍生物未脱保护；(iii)H2(30bar)、NH3、甲醇、30-60分钟，室温；(iv) 1,3-二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺酰基)胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分钟)，然后室温30分钟；(v)N'，N-二甲基甲酰胺-二甲基双乙酸盐、甲醇、室温(腺苷衍生物)；苯甲酰氯、吡啶，(TC (30分钟)，然后室温30分钟(胞苷衍生物)；将非保护基团应用至尿苷衍生物；(vi)Et3N.3HF、THF、室温；(vii)4，4' _ 二甲氧基三苯甲基氯、吡啶，室温；(viii) 2-氰乙基N，N，N' ,N'-四异丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室温。
[0025]图2显示的是制备寡聚核糖核苷酸所需的2-0-胍基丙基鸟苷亚磷酰胺的合成，⑴丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室温；(ii)甲酸(70% )、二氧杂环乙烷/水；(iii)H2 (30bar)，NH3,甲醇、30-60分钟，室温；(iv) 1，3- 二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺酰基)胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分钟)，然后室温30分钟；(v)异丁酰氯、吡啶、室温；(viii)2_氰乙基N，N，N' ,N'-四异丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室温。[0026]图3显示的是用于寡聚核糖核苷酸合成的2-0-胍基丙基-N2-N'，N-二甲基甲酰胺-鸟苷亚磷酰胺的合成的改进方法，(i)丙烯腈、CsC03、叔丁醇、室温；(ii)甲酸(70% )、二氧杂环乙烷/水；(丨^)112(3(^&10，順3，甲醇、30-60分钟，室温；(iv) 1，3-二叔丁氧羰基-2-(三氟甲磺酰基)胍、Et3N、CH2C12、0°C (30分钟)，然后室温30分钟；(v) N，N-二甲基甲酰胺二甲缩醛、甲醇、室温12小时；(vi)Et3N.3HF, THF,室温；(vii)4，4-二甲酰氯、批啶、室温；(viii) 2-氰乙基N，N，N' ,N'-四异丙基膦、4，5-二氰基咪唑、012(:12、室温。
[0027]图4显示的是B型肝炎病毒基因组的组成并标示了本发明中使用的抗HBVsiRNA3的靶标位点。给出了相对于单个的EcoRI限制性位点(HBV基因型A，GenBank号:AP007263.1)的所述基因组的核苷酸坐标。HBV siRNA3的靶标序列从核苷酸1693延伸至1711。一部分双链HBV DNA包含带有粘性互补5'末端的正义链(+)和反义链(_)。调节HBV转录的正/反式作用元件分别用圆形和矩形符号表示。紧密环绕整个基因组的箭头表示病毒开放读码框(连同起始密码子)的方向。四个外部的箭头表示具有都包含HBx的普通末端的HBV转录产物。
[0028]图5显示的是用于测定2-0-胍基丙基修饰的抗HBV siRNA效率的双荧光素酶检测。A.双荧光素酶报告基因质粒的示意图。HBx靶标序列被插入到hRLuc读码框的下游。使用海肾萤光素酶活性作为靶标沉默的指示剂，同时相对于组成型表达的萤火虫荧光素酶的活性测定其效率。B.在紧接着与被指示的siRNA—起的双荧光素酶报告基因质粒共转染的海肾萤光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性之比。对照包括阴性转染，其中惰性质粒DNA被用来替代siRNA和替代不具有与HBx靶标互补序列的阴性对照siRNA (scrambled siRNA)。数值用海肾萤光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的均值比率(土SEM)来表示，并相对于阴性处理细胞进行修正。根据双尾配对T检验测定的P值小于0.05时，则认为差异呈统计学上的显著。
[0029]图6显示的是在培养细胞中通antiHBV siRNA对HBV复制的抑制。A.带有HBVsiRNA3靶标位点的HBV可复制质粒pCH_9/3091的示意图。将pCH_9/3091用于转染肝脏来源的培养中的Huh7细胞。B.与2-0-胍基丙基修饰的siRNA共转染后测定细胞培养上清液中的HbsAg的浓度。数值以ELISA分析的相对光密度(OD)表示。未修饰的siRNA不包含2-0-胍残基。对照为不含有与HBx靶标互补的序列的siRNA。数值用海肾萤光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的均值比率(土SEM)来表示，并相对于阴性处理细胞进行校准。差异根据双尾配对T检验，若P值小于0.05，则认为统计学显著。
[0030]图7表示的是2-0-胍基丙基修饰的siRNA的稳定性评估。2_0_胍基丙基修饰的siRNA的反应板单独用DMEM或含有80%胎牛血清的DMEM孵育0_24小时。然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及溴化乙锭染色判断siRNA的降解。
[0031]图8显示了在转染的HEK293细胞中干扰素反应评估。细胞用所述指示siRNA或聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly (1:C))转染。24小时后从细胞中提取RNA并进行定量实时PCR来检测IFN- β和GAPDH mRNA的浓度。从3个独立实验中显示出IFN- β和GAPDHmRNA浓度的校准比值的均值。poly(1:C)阳性对照表明在此处使用的条件下可以诱导细胞发生干扰
素反应。
[0032] 图9显示转染了指示的未修饰和修饰的siRNA之后的细胞毒性评估。通过进行MTT (3- (4，5- 二甲基吡啶-2-基)-2，5- 二苯基溴化)分析评估体外siRNA毒性。细胞要么转染有被修饰的siRNA (实验对象)，要么转染未修饰的siRNA或者没有转染(对照)。数据通过对570nm(产物)处的光密度与655nm(指示剂或细胞数量)处的光密度的定量比值来分析。数据表明，转染和未转染的细胞不存在显著差异，这证明了被测siRNA没有体外毒理作用。数值表示3个重复转染的均值土标准差(*p〈0.05)。
[0033]图10显示了 HBV靶标部分和全部融入双荧光素报告基因构建的示意图。包括完整靶标(A)，不完整靶标I (ITl) (B)，不完整的靶标2 (IT2) (C)和种子区(SO) (D)的HBx靶标序列被插入到hRLuc读码框的下游。海肾萤光素酶活性用作靶标沉默的指示剂并且效率通过相对于组成型表达的萤火虫荧光素酶的活性测定。这些报告质粒被用于比较抗HBVsiRNA的2-0-胍基丙基修饰位点在完全互补的和不完整的HBV靶标的沉默上的效果。
[0034]图11显示了与紧接着指示的siRNA共转染的融合完整(CT)的，不完整的I (ITl)、不完整的2(IT2)和种子区的(SO)HBV靶标序列的双荧光素酶报告基因质粒的海肾萤光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性之比。对照包括用惰性质粒DNA替代siRNA和不具有与HBx祀标互补的序列的阴性对照siRNA (scrambled siRNA)的阴性转染。每组实验进行3个重复，并批量进行，其中修饰的siRNA包括1,2, 3,4, 5,6, 7, 8&9 (A), 9, 11，14，16&19(B)和10，17，18，20&21(C)位点上的GP基团。数值用海肾萤光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的均值比率(土SEM)表示，并相对于阴性处理细胞进行校准。根据双尾配对T检验，若P值小于0.05，则认为统计差异显著。
[0035]图12显示了是在经流体动力注入法的小鼠中检测到的HBV表面抗原的血清浓度。血清分离自第3天(A)和第5天⑶的小鼠后利用BioRad ELISA试剂盒进行HBsAg检测。平均值由每组小鼠的每个值确定，同时结果根据从阴性对照scrambled siRNA处理的小鼠中获得的值进行校准。根据双尾配对T检验，若P值小于0.01 (**)或0.001 (***)，则认为统计差异显著。 [0036]图13显示在已经受到流体动力注入法的小鼠中检测到的循环B型肝炎病毒颗粒当量的血清浓度。从第3天(A)和第5天(B)的小鼠中分离出血清，然后利用实时定量PCR分析进行病毒DNA检测。循环病毒颗粒当量(VPEs)的平均值由每组小鼠的每个值确定。根据双尾配对T检验，若P值小于0.01 (**)或0.001 (***)，则认为统计差异显著。
[0037]图14显示的是当细胞经包含正义链和反义链上GP修饰的siRNA转染后，利用双荧光素酶报告基因分析评估体外HBV基因敲除。双链siRNA包含与具有在一个位点(位点17，SEQ ID NO: 31)或三个位点(位点5，13&17，SEQ ID NO: 32)有GP修饰的正义链进行杂交的带有指示的GP修饰的反义siRNA。数值代表3个重复转染的均值土标准差(*p〈0.05 (*)或 0.01 (**)) ο
[0038]图15显示了当细胞经正义链和反义链上均有GP修饰的siRNA转染后，利用双荧光素酶报告基因分析评估体外HBV基因抑制。双链siRNA包含与具有三个位点(位点5，13&17, SEQ ID NO: 32)有GP修饰的正义链进行杂交的带有指示的GP修饰的反义siRNA。数值表示3个重复转染的均值土标准差Op〈0.05 O)或0.01 O*))。
[0039]本发明的详细说明
[0040]现在将参照附图在下文中对本发明进行更详细地描述，但仅仅是部分而不是本发明全部实施例都被在此描述。
[0041]所描述的本发明不应限于所公开的具体实施例和修改中，其它实施例应包括在本发明的范围内。尽管在本文中采用了特定的术语，它们的使用仅具有通用的和描述性的意思而不是为了限制的目的。
[0042]本文所使用的术语具有它们在本领域中公认的的含义，除非另有说明。根据本文中的使用，下列术语具有以下限定的含义。
[0043]本文中使用的术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限定，包括以类似天然存在的核苷酸的方式与核苷酸杂交的天然核苷酸的类似物。除非另有指明，特定核苷酸序列包括其互补序列。
[0044]术语“核苷”指通过β糖苷键与核糖或脱氧核糖连接的嘌呤或嘧啶碱基。核苷的常见示例有鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。
[0045]术语“核苷酸”指在其核糖或脱氧核糖结构上磷酸化的核苷。最常见的磷酸化位点是糖的5'碳原子。核苷酸的聚合物形成DNA或RNA。所述聚合物的糖和磷酸组成核酸骨架。“核糖”指RNA中发现的单糖，并且它的化学式为C5H1005，同时“脱氧核糖”指DNA中发现的单糖，并且它的化学式为C5H1004。
[0046]“siRNA”是“小干扰RNA”的缩写。siRNA包括小的双链RNA分子，反义_(引导)链和正义_(随从)链。典型的siRNA分子包含19bp双链区域，3'末端具有2个核苷酸悬垂。一条链与胞质RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。通过RISC的影响直接导致序列特异性RNA裂解。siRNA引导链和其靶标之间的错配可能导致翻译抑制而不是RNA裂解。siRNA可以是合成的或通过Dicer酶对前体进行加工而来。 [0047]本文中使用的“RNA干扰”(RNAi)是一个通过合成的siRNA或核酸(包括miR, siRNA, shRNA)表达导致互补RNA发生序列特异性降解、序列特异性翻译抑制或转录基因沉默的过程，并且本文中进一步使用的“RNAi编码序列”指当其表达时能导致RNA干扰的核酸序列。
[0048]术语“Dicer酶”指能消化双链RNA并负责RNAi前体突变的RNAse III酶。例如，Dicer负责作用于miRs前体形成成熟的miRs。“Drosha”是一种形成核微处理器复合体的一部分的RNAse III,该部分能识别特异性pr1-miR次级结构,裂解并释放约60_80nt的miR前体序列。
[0049]术语“转录”指从DNA模板产生RNA的过程。“体外转录”指利用包含RNA聚合酶核RNA前体等实验介质将DNA序列转录成RNA分子转录过程，并且“细胞内转录”指在活细胞中的DNA序列转录成RNA分子的转录过程，此外，“体内转录”指在活体生物中DNA序列转录成RNA分子的转录过程。
[0050]本文中使用的术语“靶标核酸”或“核酸靶标”指源自基因的核酸序列，关于该序列，本发明所述RNA1-编码序列被设计用来抑制、阻碍或阻止基因表达、酶活性或与其它细胞或病毒因子的相互作用。在本发明中，“靶标核酸”或“核酸靶标”包括任何可以被作为靶标的核酸，包括但不限于DNA、转录自DNA的RNA (包括mRNA前体核mRNA或其部分)以及同样来自DNA的cDNA。
[0051]术语“引导序列”等同于术语“反义链”，并且如本文中所用，指源自RNAi效应器的短单链RNA片段，例如融入RISC的siRNA，miR, shRNA,负责序列特异性降解或在靶标识别序列对靶标RNA的进行翻译抑制。此外，术语“RNAi效应器”指任何包括其前体的能导致RNA干扰的RNA序列(如shRNA, miR和siRNA)。[0052]当涉及连接至核苷的基团时，此处描述的“胍基”指一种包括三个氮原子和一个碳原子并具有下述化学结构式的化学基团。“丙基”指一种包括3个碳原子并具有下述化学结构式的化学基团，并且“胍基丙基”指包含胍基共价连接至丙基组件上的化学基团。
[0053]
【权利要求】
1.一种修饰的小干扰RNA(SiRNA)核苷酸分子，包括正义连和反义链，其中正义链中的至少一个核苷酸或反义链中的至少一个核苷酸是衍生自2, -O-胍基丙基(GP)修饰的核苷酸，并且所述核苷酸分子能够沉默靶标序列的表达。
2.权利要求1所述的核苷酸分子，其中，其中至少一个所述修饰的核苷酸选自由.2-0-胍基丙基腺苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基鸟苷亚磷酰胺和.2-0-胍基丙基尿苷亚磷酰胺组成的组或它们的组合。
3.权利要求1或2所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链的长度分别为18-26个核苷酸。
4.权利要求3所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链的长度分别为21个核苷酸。
5.权利要求1至4任一所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链都包括人工合成序列。
6.权利要求1至5任一所述的核苷酸分子，所述修饰的SiRNA以病毒的一个互补核苷酸序列为靶标。
7.权利要求1至6任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的SiRNA抑制病毒的复制。
8.权利要求6或7所述的核苷酸分子，其中所述病毒为肝炎病毒。
9.权利要求8所述的核苷酸分子，其中所述病毒是B型肝炎病毒。
10.根据权利要求1~9任一所述的核苷酸分子，当转染到培养细胞中时，与未修饰的siRNA相比，其中所述修饰的siRNA不诱发可检测的干扰素反应。
11.根据权利要求1~10任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的siRNA比具有相同序列的未修饰的siRNA在标准血清检测中具有更高的稳定性。
12.根据权利要求1~11任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的siRNA比具有相同序列的未修饰的siRNA表现出更大的对靶标基因表达的抑制。
13.根据权利要求1~12任一所述的核苷酸分子，其中反义链包括SEQID NO:1所示的核苷酸序列且所述反义链的 .2.，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和/或21位点插入有至少一个Gp修饰的核苷酸。
14.根据权利要求1~13任一所述的核苷酸分子，其中所述正义链包括SEQID NO:2所述的序列并且在所述正义链的5，13和/或17位点插入至少一个GP修饰的核苷酸。
15.一种治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗剂量的权利要求1~14任一所述的核酸分子以及药学上可接受的佐剂和/或载体。
16.根据权利要求15所述的方法，所述受试者是人类。
17.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述病毒感染是肝炎病毒感染。
18.根据权利要求15至17任一所述的方法，其中所述肝炎病毒感染是B型肝炎所导致。
19.权利要求1~14任一所述的核苷酸分子在治疗或预防病毒感染中的应用，其中所述应用包含向需要其的受试者施用治疗有效量的所述核酸分子以及药学上可接受的佐剂和/或载体。
20.根据权利要求19所述的核苷酸分子，所述受试者为人类。
21.根据权利要求19或20所述的核苷酸分子，其中所述病毒感染是肝炎病毒感染。
22.根据权利要求19至21任一所述的核苷酸分子，其中所述肝炎病毒感染是B型肝炎所导致。
23.权利要求1~14任一所述核苷酸分子在用于治疗或预防病毒感染的药剂制备中的应用，其中所述应用包含向需要其的受试者施用治疗有效量的所述核酸分子以及药学上可接受的佐剂和/或载体。
24.权利要求23所述的应用，所述受试者为人类。
25.根据权利要求23或24所述的应用，所述病毒感染为肝炎病毒感染。
26.根据权利要求23~25任一所 述的应用，所述肝炎病毒感染为B型肝炎所致。
【文档编号】A61P31/20GK104011209SQ201280053081
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】帕特里克·阿巴思诺特, 贾斯廷·希恩, 阿布杜拉·伊利, 穆萨·马里亚尼, 约兰塔·布瑞恩斯卡, 詹尼弗·多诺费奥, 马克西米利安C.R.·布夫, 约阿希姆W.·恩格斯, 斯蒂芬·贝恩哈特 申请人:约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学, 歌德大学