CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及基因敲除技术领域，具体设及 CRISPR-化s9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性祀向SALL1基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002] 器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的 患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手 术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。W肾脏移植为例， 我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部 分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其 他物种，W提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。
[0003] 目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪 成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到 人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，W产生适合于人体移植 的器官，成为异种移植的终极目标。
[0004] 传统的技术路线通过减少猪与人的免疫差异W获得可用于移植的猪的品系。近年 来，利用器官发育缺陷型猪作为培养环境产生由人类细胞构成的器官成为新的思路。通过 基因工程有效干扰控制猪自身器官发育的基因，使猪在发育过程中某个器官缺失，从而为 人源细胞器官的发育提供了关键的培养环境。
[00化]目前已知SA化1基因是肾脏发育中的必需基因。SA化1在果蛹中存在同源基因，在 进化上高度保守。SA化1基因仅在肾发育阶段表达，组织学上分布于后肾间叶细胞W及肾基 质，对于输尿管芽进入间质组织是必需的。缺失SALL1基因会导致新生鼠肾发育不全或缺 失，表明SALL1调控肾发育过程中的关键步骤。敲除SALL1基因能够使猪在发育过程中不 产生肾脏，为人类细胞来源肾提供了良好的发育环境。而准确高效的敲除猪的SALL1基因， 是首要步骤。
[0006] 目前，常见的基因敲除技术包括同源重组化omologus Recombination, HR)技术、 类转录激活效应子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技术、锋指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技术W及最近发展的规律成簇间隔短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Siort Palin化omic Repeat, CRISPR)技术。 皿技术由于重组效率低下（效率大约只有10 6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已 逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20%，但都需要构建可W识别 特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱祀 率，其应用有限。
[0007] CRISIS是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋 白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有Ξ种类型，其中第二类化s9 系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。化s9祀向切割DM是通过两种小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)与祀序列互补识别的原理实现 的。现在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，能够识别 特定的基因序列，引导化s9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源重组 末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。
[0008] 相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的祀向切 害d。因此，通过CRISPR技术敲除SALL1基因能够极大地提高SALL1缺失细胞及肾发育缺失 基因工程猪的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确祀向的sgRNA，因为 基因的祀向精确度高度依赖于sgRNA祀序列，能否成功设计出精确祀向的sgRNA成为敲除 目的基因的关键技术问题，本发明意在解决该技术问题从而为敲除SALL1基因提供坚实的 基础。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供CRISPR-化s9特异性敲除猪SA化1基因的方法及用于特异 性祀向SALL1基因的SgRNA。
[0010] 根据本发明的第一方面，本发明提供在CRISPR-化s9特异性敲除猪SALL1基因中 用于特异性祀向SALL1基因的SgRNA,该SgRNA具有W下特点： W11] (1)该SgRNA在SA化1基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列规则，其 中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的祀序列位 于正义链或反义链；
[0012] 似该SgRNA在SA化1基因上的祀序列位于SA化1基因的N端的3个外显子编码 区，或祀序列的一部分位于SALL1基因的N端的3个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的 交界，位于相邻内含子； 阳〇1引 （3)该SgRNA在SA化1基因上的祀序列是唯一的。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID NO :1~49中任一条序列 所示的序列。
[0015] 作为本发明的优选方案，上述祀序列为序列表中SEQ ID NO :3或4所示的序列。
[0016] 根据本发明的第二方面，本发明提供运用CRISPR-化s9特异性敲除猪SALL1基因 的方法，该方法包括如下步骤：
[0017] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列对应的互补序列的两端加 上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；将合成的正向寡核巧酸 序列与反向寡核巧酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0018] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入线性化的携带化s9基因的表达载体，得到携带含 相应祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正 确的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0019] (3)用上述携带有SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表达载体、包装质粒和包装细 胞系包装出同时携带祀向SALL1基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0020] (4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的 细胞，W其基因组DM为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确 定SALL1基因的献除情况。
[0021] 作为本发明的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQ ID NO :50所示序列的载 体。
[0022] 作为本发明的优选方案，上述方法包括如下步骤：
[002引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列对应的互补序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；将合成的正向寡核巧酸序列与反向寡核巧 酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核巧酸；
[0024] (2)将上述双链寡聚核巧酸连入如序列表中SEQ ID NO :50所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带SgRNA寡聚核巧 酸的重组表达载体1 entiCRISPR V2-SA化1，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆， 并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0025] (3)用上述表达载体lentiCRISPR V2-SA化1、包装质粒和包装细胞系包装出同时 携带祀向SALL1基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0026] (4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染 的目的细胞，W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因片段，经过变性、复性及酶 切，确定SALL1基因的献除情况。
[0027] 作为本发明的优选方案，上述包装质粒为质粒pLPl、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG ; 上述包装细胞系为肥K293T细胞。
[0028] 作为本发明的优选方案，上述目的细胞为猪PIEC细胞。
[0029] 作为本发明的优选方案，上述W其基因组DNA为模板扩增包含上述祀序列的基因 片段，经过变性、复性及酶切，确定SALL1基因的敲除情况，具体为：
[0030] (a) W感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用SA化1基因的上下游引物扩增 包含上述SgRNA的祀序列的SALL1基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细 胞的基因组DNA ;
[00川 化）纯化上述扩增到的SA化1基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的SA化1 基因片段和来自野生型细胞的SALL1基因片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子； 阳0巧 （C)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA分子；