减毒流感疫苗和其用图
【专利说明】减毒流感疫苗和其用途
[0001 ]本申请要求2013年7月19日提交的美国临时申请号61/856，442的权益，该美国临 时申请的公开内容是W全文引用的方式并入本文中。
[0002] 关于联邦资助研究的声明
[0003] 本发明是在政府资助下根据国家卫生研究院(NIH)授权号皿SN2662007000008C、 NIH授权号T32 GM068411和NIH授权号T32 GM07356来进行。政府享有本发明的某些权利。
[0004] 背景
[0005] 流感是W轻度至重度疾病为标志且在一些情况下甚至W死亡为标志的严重公共 卫生问题。目前的活减毒流感疫苗(LAIV)的减毒程度不足W施用于2岁W下的儿童、孕妇、 免疫性受损人±或处在流感并发症的高风险之下的人±。然而，运些人群处在流感并发症 的高风险之下。 发明概要
[0006] 本文中提供了一种经修饰的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310至325中具有一个 或多个突变的PB1聚合酶。还提供了一种编码甲型流感病毒的PB1聚合酶的重组核酸，其中 所述核酸编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。还提供了包含本文 中所描述的任何甲型流感病毒或包含本文中所描述的任何编码PB1聚合酶的核酸的细胞群 体。聚合酶突变产生溫度敏感性病毒，其中所述病毒具有从约37°C至约39°C(即，在体溫下） 减缓的生长。运种减缓的生长潜力在用于诱导免疫反应时有利于提高病毒的安全性。
[0007] 还提供了一种用于在受试者中引发针对流感病毒的免疫反应的方法，其包括施用 有效剂量的本文中所描述的经修饰的甲型流感病毒和药学上可接受的载体。
[0008] 还提供了一种用于在受试者中治疗或预防流感感染的方法，其包括向已受流感感 染或易受流感感染的受试者施用有效剂量的如本文中所描述的经修饰的甲型流感病毒和 药学上可接受的载体。
[0009] 还提供了一种产生本文中所描述的甲型流感病毒的方法，其包括(a)用一个或多 个包含W下各项的载体转染宿主细胞群体:i)编码甲型流感病毒的内部基因组节段的核酸 序列;和ii)编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶的核酸；（b)培养所 述宿主细胞;和(C)回收经修饰的甲型流感病毒。
[0010] 还提供了一种用于产生流感免疫原的方法，其包括：（a)用本文中所描述的任何甲 型流感病毒感染细胞群体；（b)培养所述细胞；（C)从步骤(b)的培养物中收集所述病毒;和 (d)用所收集的病毒制备免疫原。
[0011] 附图描述
[0012] 图1示出了对在37°C下具有溫度敏感性的PB2单基因置换病毒的鉴定。用单基因置 换病毒W0.01的感染复数(M0I)将MDCK细胞感染化，其中PB2来自于冷传代A/AnnArbor/6/ 60,并且所有其他基因都来自于季节性病毒株A/Korea/82。用含儀和巧的杜尔贝科氏憐酸 盐缓冲生理盐水(PBSKinvitrogen)将细胞洗涂一次，然后在34°C、37°C或39°C下在含有 0.15%牛血清白蛋白（BSA)和化g/ml甲苯横酷基横酷基苯基丙氨酷基氯甲基酬(TPCK)-膜 蛋白酶的DMEM中培养。在所指示的时间点，收集并置换10%培养物上清液，并且通过TCID-50测量来测定病毒效价。
[OOK]图2示出了 PB1319Q突变显著降低人类甲型流感病毒RNA聚合酶在37°C下的功能活 性。在人类肥K-293FT细胞中通过定量在经PB1、PB2、PA和NP蛋白表达质粒W及表达流感病 毒样RNA构建体的报告质粒转染的细胞的澄清细胞溶解产物中对蛋火虫巧光素酶的巧光素 酶活性来表征所指示的聚合酶的聚合酶活性。在所指示的溫度下解育细胞。所有测定都利 用相同的NP质粒。描绘了蛋火虫发光与海肾发光之比。数据是最少Ξ个独立实验的平均值。 误差线表示一个平均标准误差。运一小基因组测定中所使用的所有质粒都相同，但在残基 319处编码Q的PB1质粒(如所指示)除外。运些质粒是通过将共有序列从病毒生长曲线克隆 到哺乳动物pCAGGS表达载体中而由病毒母液产生。
[0014] 图3示出了 PB1L319Q突变显著降低禽甲型流感病毒RNA聚合酶在37°C下的功能活 性。在人类肥K-293FT细胞中通过在经PB1、PB2、PA和NP蛋白表达质粒W及表达流感病毒样 RNA构建体的报告质粒转染的细胞的澄清细胞溶解产物中定量对蛋火虫巧光素酶的巧光素 酶活性来表征各病毒聚合酶的聚合酶活性。在所指示的溫度下解育细胞。描绘了蛋火虫发 光与海肾发光之比。数据是最少3个独立实验的平均值。误差线表示一个平均标准误差。在 运个实验中，所有聚合酶基因节段都来源于禽流感病毒。PA和PB2节段来源于A/C 曰1 ifornia/04/09 H1N1，并且PB1 和NP节段来源于A/CMcken/Nanchang/3 H3N2。质粒仅在 所指示的残基处不同：（1)编码265S或265N的PB2[野生型];(2)编码319Q或31化的PB2[野生 型]。
[0015] 图4示出了PB1中的319Q突变与LAIV PB1中所存在的Ξ个突变的组合的效应。
[0016] 图5示出了PB1中的319Q突变与LAIV PB1中所存在的四个突变的组合的效应。
[0017] 图6示出了 PB1的319位上的突变的稳定性。
[001引发明描述
[0019] 本文中提供了一种经修饰的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310至325中具有一个 或多个突变的PB1聚合酶。PB1聚合酶的氨基酸310至325在本文中阐述为肥NQNPRMFLAM 口 YI (沈Q ID N0:1)。
[0020] 如全文所使用，任何甲型流感病毒都可W经修饰W包含在氨基酸310至325中具有 一个或多个突变的PB1聚合酶。举例来说，甲型流感病毒可W选自H2N2病毒、H3N2病毒、H1N1 病毒、H9N2病毒和H5N1病毒。任选地，甲型流感病毒可W选自A/Ann Arbor/6/60、A/ California/04/2009、A/Wisconsin/22/20U和A/如ail/Hong Kong/Gl/9 7。甲型流感病毒 还可W是禽甲型流感病毒。运些病毒包括但不限于A/化icken/化nchang/3-120/01 H3N2、 A/Hong Kong/485/1997化5Nl)、A/Anhui/l/2013W7N9WPA/aia^hai/l/2013W7N9)。
[0021] 还涵盖包含来自于一种或多种甲型流感病毒的一个或多个基因组节段的重排甲 型流感病毒。更具体来说，所述病毒包括来源于多于一种亲本病毒株或来源的基因和/或多 肤组分。举例来说，7:1重排病毒包括7个来源于第一亲本病毒的病毒基因组节段(或基因节 段)和单个来自于第二亲本病毒的例如编码血凝素或神经氨酸酶的互补病毒基因组节段。 6: 2重排病毒包括6个来自于第一亲本病毒的基因组节段，最常见为6个内部基因，和两个来 自于不同的亲本病毒的互补节段，例如血凝素和神经氨酸酶。任选地，重排病毒是通过引入 包括由于其在疫苗生产方面的良好性质而选择的病毒株的六个内部基因与编码所选择的 例如病原性病毒株的表面抗原的基因组节段化A和ΝΑ)的组合的载体来产生。举例来说，HA 节段可W选自H1、H3或B病毒株，如同常规情况下进行疫苗生产时。类似地，HA节段可W选自 其他病原性病毒株，诸如H2病毒株(例如H2N2)、册病毒株(例如册N1)、H7病毒株(例如H7N7) 或H9病毒株（H9N2)。在某些经修饰的病毒中，内部基因节段来源于甲型流感病毒/Ann Arbor/G/GO 病毒株。
[0022]如本文中所阐述，修饰包括但不限于PB1聚合酶的氨基酸序列中的突变。任选地， PB1聚合酶中的一个或多个突变是非天然存在的，并且是通过人类干预(例如，通过对所克 隆的DNA序列进行突变诱发)而产生，诸如诱导的点突变、缺失、插入和取代突变体。氨基酸 序列突变典型地属于W下Ξ个类别中的一个或多个:取代突变、插入突变或缺失突变。插入 包括氨基和/或簇基末端融合W及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入一般将为比 氨基或簇基末端融合小的插入，例如大约一至四个残基。缺失是W从蛋白质序列中去除一 个或多个氨基酸残基为特征。典型地，在蛋白质分子内的任何一个位点上缺失不超过约2至 约6个残基。氨基酸取代典型地是单个残基的取代，但可能一次性在多个不同的位置发生， 例如在如SEQ ID N0:1所阐述的多肤序列的一、二、Ξ、四、五、六、屯或更多个氨基酸上;插 入通常将是大概约1至10个氨基酸残基;且缺失将介于约1至10个残基的范围内。缺失或插 入优选地在相邻的对中进行，即，缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组 合可W组合W得到最终构建体。突变不能将序列置于阅读框之外，并且优选地不会形成可 能产生二级mRNA结构的互补区。取代修饰是其中至少一个残基已经被去除并且在其位置上 插入一个不同的残基的那些修饰。运样的取代可W根据W下表1来进行，并且被称为保守取 代。