专利名称：壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品领域，更具体地讲，涉及一种能够减少流感病毒减毒活疫苗用量的佐剂。
背景技术：
流行性感冒病毒(influenza virus)是一种常见的急性呼吸道传染病，易于发生抗原漂移和抗原转变，并且传染性极强，严重危害人类的健康和生命。疫苗接种是预防流感病毒感染的最有效的方式之一。但是，目前流感疫苗的生产能力和技术有限。在2009 年-2010年的甲型流感病毒HlNl大流行期间，据世界卫生组织数据更新，到2010年11月为止，世界上有77个国家共获得了仅仅7800万支疫苗，而且所有这些疫苗都是在第二波流感发生之后才送到的，这远远难以满足人类的需求。佐剂可提高疫苗的免疫应答水平并降低疫苗使用剂量，在疫苗中使用佐剂有可能解决疫苗供应不足的问题。因此需要研究一些新的佐剂，通过增加疫苗的免疫原性，减少疫苗免疫的剂量，从而扩大免疫的人群。但是目前批准的应用于人体上的佐剂只有铝佐剂和MF59两种，难以满足疫苗的需求。已经有研究表明壳聚糖作为佐剂能够在动物模型中增强疫苗的系统性和局部性免疫应答。壳聚糖广泛的存在于自然界中，由几丁质经过脱乙酰作用得到，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，具有无毒性、生物粘附性、生物降解性等特性，且对人体无刺激性和过敏反应，是一种安全可靠的天然活性物质在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。美国食品药品监督管理局已经批准壳聚糖应用于食品和药品中。因此，壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗的佐剂具有重要的应用价值。我们以前的研究《流感病毒灭活疫苗新型佐剂——壳聚糖增强免疫作用研究》(常海燕，陈建军等，中国生物制品学杂志，2004年06期)表明将壳聚糖与流感病毒灭活疫苗混合经腹腔免疫BALB c小鼠，间隔3周，免疫2次。免疫后取血清，检测血清中所产生的IgG、IgGl、IgG2a等抗体水平，同时，取小鼠鼻洗液检测IgA抗体；加强免疫后I周，用致死性(40LD50 )流感病毒A PR 8 34 (HlNl)攻击小鼠，观察小鼠的体重变化和保护作用。结果表明，壳聚糖作佐剂能显著增强血清抗体含量，并提高小鼠抗病毒攻击的能力。说明壳聚糖可以作为流感病毒灭活疫苗的新型佐剂，增强疫苗的抗体反应。流感病毒减毒活疫苗的免疫方式是经鼻腔免疫，目前尚没有发现壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂的相关研究。壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗中的佐剂与作为流感病毒灭活疫苗中的佐剂，两者作用机理不一样，所起的效果也不一样。与灭活疫苗相比，流感病毒减毒活疫苗最适pH值为4-5，需要调整壳聚糖溶液的相关条件比如浓度，使其能够保证疫苗的活性，细微条件的变化，可能就会导致活疫苗失活。壳聚糖作为佐剂应用于流感病毒减毒活疫苗能够提高粘膜抗体的产生
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是，提供壳聚糖在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用。本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种能够减少流感病毒减毒活疫苗的用量的佐剂。为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫。作为一个优选方案，壳聚糖溶液的pH值为4-5，壳聚糖溶液的浓度是O. 4g/100mL。为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种能够减少流感病毒减毒活疫苗的用量的佐剂，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫，所述佐剂为壳聚糖。流感病毒减毒活疫苗是指哺乳动物包括人预防流感病毒感染的预防性疫苗，免疫方式是经鼻腔免疫，壳聚糖作为粘膜佐剂的添加可以减少流感病毒减毒活疫苗的用量。 主要包括以下步骤
O壳聚糖溶液的配制配制O. 4% (质量/体积)壳聚糖(sigama)溶液。2)流感病毒温度敏感株的制备及生物学特性研究从接种A/PuertoRico/8/34 (HlNl)病毒中抽提RNA，利用RT-PCR制备cDNA，扩增流感病毒的八个基因片段。利用重叠PCR的方法分别在PBl (K391E, E581G, A661T)和PB2 (N265S)上引入突变。
麈A Phw2000质粒载体上，共同转染293T细胞。72小时后，收获样本，接种10日龄鸡胚，48-72小时后，收获鸡胚尿囊液，血凝实验和基因抽提、测序验证病毒序列的正确性。3)使用不同剂量的流感病毒温度敏感株在存在或不存在壳聚糖溶液作为佐剂时，研究其是否能够抵抗同源的HlNl和异亚型的H9N2病毒的攻击。本发明的优点在于，首次采用壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂，并通过大量创造性劳动得出壳聚糖在流感病毒减毒活疫苗中充分发挥作用，且疫苗活性不降低的应用条件。壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂能够增强疫苗的免疫原性，诱导机体更强的免疫应答，有效的减少疫苗的用量，在现有的生产能力和技术下，能够有效扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。
图I为mPR8疫苗和PR8病毒的温度敏感性试验。图2为不同剂量的mPR8 (加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠后使用ELISP0T检测脾细胞中INF-γ的分泌水平。图3为不同剂量的mPR8 (加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率和体重变化。a: 10 TCID5tl (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。b:10 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在100 X LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。c :100 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在100 X LD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。d:100 TCID5tl (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。e :1000 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。图4为100 TCID50 mPR8(加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的存活率和体重变化。a: IOOTCId50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的存活率。b:100 TCID50 (力口或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的体重变化。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I 一壳聚糖溶液的配制
称量3. 38g谷氨酸钠溶于IOOml水中配制成0. 2mol谷氨酸钠溶液。用乙酸调节溶液的pH值至2-3。称取0.4g壳聚糖加入溶液，搅拌至完全溶解。用氢氧化钠调节溶液的pH值至4-5，用0. 22纳米的滤膜过滤除菌，分装保存于4°C，备用。二 流感病毒减毒活疫苗的制备
从接种A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RT-PCR的技术制备cDNA，扩增流感病毒的PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M、NS八个基因片段。利用重叠PCR的方法分别在PBl (K391E, E581G, A661T)和PB2 (N265S)上引入突变。沒側_51酶切PCR片段和Phw2000质粒，T4 DNA连接酶连接。在转染试剂脂质体Lipofectamine 2000辅助下8质粒共同转染293T细胞。72小时后，收获样本，接种10日龄鸡胚，48-72小时后，收获鸡胚尿囊液，血凝实验和基因抽提、测序验证病毒序列的正确性。该毒株命名为mPR8。三mPR8生物学特性的研究
I):温度敏感特性的研究把mPR8毒株在冰上按照100 μ I病毒+900 μ IDMEM (2. 5 μ g/ml TPCK胰酶)方法进行一系列10倍倍比稀释。分别取100 μ I加入至MDCK细胞丰度为85%-90%的96孔细胞培养板上。用同样的方法接种另外一块96孔细胞培养板。将这两块细胞培养板分别放入34°C和39°C的CO2培养箱，培养72小时，观察细胞病变，使用Reed-Muench方法计算病毒滴度。2)减毒特性的研究6-8周龄的雌性BALB/c小鼠分别经鼻腔接种105TCID50的mPR8和PR8病毒株，在感染后第2、3、4天取小鼠气管-肺泡洗液，用细胞半数感染剂量检测小鼠肺部病毒滴度。3)壳聚糖作为佐剂对流感病毒温度敏感株免疫原性的研究
免疫程序和步骤6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分7组
①mPR8 (10TCID50)+壳聚糖溶液(共20 μ 1，壳聚糖终浓度为0. 2%)，@ mPR8 (10TCID50)
③mPR8 (100TCID50)+壳聚糖溶液(共20 μ 1，壳聚糖终浓度为0. 2%)④mPR8 (100TCID50)(20μ I)⑤mPR8 (1000TCID50) +壳聚糖溶液(共20 μ 1，壳聚糖终浓度为0. 2%)⑥mPR8(1000TCID50)⑦PBS空白对照组。戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经鼻腔免疫一次，间隔三周后，取血，分离血清用于抗体检测。免疫一次后间隔三周，分离脾细胞，用于ELISPOT检测分泌IFN-Y的T细胞。a抗体检测(I)用10 μ g/ml的PR8全病毒灭活疫苗包被96孔酶标板，4°C，孵育过夜。(2)用PBST洗涤三次后，加入100 μ I含10%脱脂奶粉的PBST封闭液，37°C封闭I小时。(3)用封闭液稀释的血清后加入酶标板，37°C反应I小时。(4) PBST洗涤三次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37°C反应I小时。 (5) PBST洗涤三次，每孔加入TMB液体，室温反应显色15_30分钟。(6)每孔加入50 μ I 2Μ的H2SO4终止反应，用酶标仪检出450nm出的OD值，记录数据，用对照组的平均值加上2SD，作为阳性结果的判断标准。b酶联免疫斑点实验
为了检测小鼠的细胞免疫应答水平，使用ELISPOT检测了小鼠脾脏淋巴细胞分泌的细胞因子IFN- Y的情况，简单介绍如下(I)预包被板的活化每孔加入200 μ I DMEM，室温静置IOmin,扣出液体。(2)加入细胞悬液每孔加入100 μ I浓度为I X IO3ceIls/μ I脾脏单核细胞。(3)加入刺激物3复孔只加入100 μ I DMEM，用作背景负对照，正对照孔加入10 μ I工作浓度的PMA和Ionomycin，负对照孔加入10 μ 1DMEM,实验组加入终浓度10 μ g/ml的PR8全病毒灭活苗。(4)培养37°C，5%C02细胞培养箱中培养24hr。(5)裂解细胞倾倒扳内的培养基和细胞，加入200 μ I预冷的去离子水，4°C放置lOmin，低渗裂解细胞。(6)洗板甩去孔内液体,用200 μ I/孔IXWashing buffer洗5次。(7)检测抗体每孔加入100 μ I稀释好的生物素标记的一抗，37°C孵育I小时。(8)洗板甩去孔内液体,用200 μ I/孔IXWashing buffer洗6次。(9)酶联亲和素孵育每孔加入100 μ I稀释好的酶表亲和素工作液，37°C孵育I小时。(10)洗板甩去孔内液体,用200 μ I/孔IXWashing buffer洗5次。(11)显色每孔加入100μ现用现配的AEC显色液，室温避光显色30min左右。(12)终止倾倒孔内液体，打开底座，用去离子水洗涤正反面5遍，将板放置于阴凉处室温晾干。(13) ELISPOT斑点计数，统计分析数据。ELISPOT斑点计数是由达科为生物技术有限公司读数。三共免疫壳聚糖和流感病毒温度敏感株能提供针对同源病毒保护
免疫程序和步骤6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分7组①mPR8 (10TCID50) +壳聚糖溶液(共 20μ 1，壳聚糖终浓度为 0. 2%)，@ mPR8 (10TCID50)③ mPR8 (100TCID50)+壳聚糖溶液(共20 μ 1，壳聚糖终浓度为0.2%)④mPR8 (100TCID50)(共20yl) mPR8(1000TCID50 )+壳聚糖溶液(共20 μ I，壳聚糖终浓度为O. 2%)⑥mPR8 (1000TCID50 )⑦PBS空白对照组。经鼻腔接种免疫一次，3周后100LD50的PR8攻毒，病毒攻击后3天，取支气管-肺洗液测定病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。病毒滴度的测定将气管-肺洗液作系列10倍稀释，用每个稀释度感染培养于96孔板中的MDCK细胞(密度约为80°/Γ90%)，每个稀释度平行接种4个细胞孔，并将感染细胞置于CO2培养箱中。37°C培养72hr后，血凝试验检测每个温度下病毒的滴度，用Reed-Muench方法计算TCID5tlt5每个实验组病毒滴度是用每组所有5只小鼠样本的病毒滴度的平均值土 SD来表不。四共免疫壳聚糖和流感病毒温度敏感株能提供针对异亚型病毒保护
免疫程序和步骤6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分3组〔D mPR8 (100TCID50)+壳聚
糖溶液(共20μ1，壳聚糖终浓度为O. 2%)，@ mPR8 (100TCID50)③PBS空白对照组，滴鼻
接种免疫一次，3周后100LD50的H9N2攻毒，病毒攻击后3天，取支气管-肺洗液测定病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。五实验结果
l)mPR8病毒株温度敏感性结果表明，mPR8突变病毒在34°C和39°C培养时，在MDCK细胞水平上mPR8病毒复制滴度相差约IO4倍，而PR8病毒在34°C和39°C培养条件下的复制滴度相差仅约10倍。2) mPR8病毒株减毒特性表I表明，mPR8突变病毒在感染小鼠后第2天检测不到病毒滴度，到第3、4天也仅有I只小鼠可检测到IO175 TCID5ciAil的低滴度病毒。而其对应的wPR8野生病毒在感染小鼠后第2天即可检测到IO5 25 TCID5ciAil的高滴度病毒，且到第
3、4天肺部病毒滴度一直维持在很高水平。表I mPR8病毒株在小鼠肺内复制受到抑制
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注a 6-8周龄的BALB/c小鼠分别经鼻腔接种IO5 TCID50 mPR8或PR8病毒。b感染三天后每组五只小鼠分别收获气管-肺洗液.病毒滴度用均值土 SD表
/Jn ο。ND，没有检测到。d与PR8感染组相比有显著性差异(P < O. 05)。3) mPR8病毒株免疫原性
a =ELISA抗体为了评价壳聚糖是否会增强mPR8减毒活疫苗的特异性抗体应答能力，小鼠免疫21天时采用眼球静脉取血的方法收集血清，通过ELISA方法测定血清中PR8特异性IgG抗体。结果表明(表2)，mPR8与壳聚糖共免疫小鼠组的IgG滴度均显著高于相同剂量未加佐剂组，且抗体滴度的增加存在剂量依赖关系。尤以100 TCID5tl mPR8与壳聚糖共免疫组抗体滴度增高明显，其抗体滴度甚至高于1000 TCID5tl mPR8组，说明壳聚糖佐剂可节约至少10倍抗原剂量。壳聚糖佐剂的加入使100 TCID50和1000 TCID50 mPR8组IgGl和IgG2a抗体滴度均显著增高，但机体的特异性免疫应答没有明显的偏向性。表2壳聚糖和减毒活疫苗共免疫诱导的抗体应答
权利要求
1.壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫。
2.根据权利要求I所述的壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，其特征在于，壳聚糖溶液的PH值为4-5，壳聚糖溶液的浓度是O. 4g/100mL。
3.—种能够减少流感病毒减毒活疫苗的用量的佐剂，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫，其特征在于，所述佐剂为壳聚糖。
全文摘要
本发明公开了壳聚糖在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，提供了一种能够减少流感病毒减毒活疫苗用量的佐剂。本发明首次采用壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂，能够增强疫苗的免疫原性，诱导机体更强的免疫应答，有效的减少疫苗的用量，在现有的生产能力和技术下，能够有效扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。
文档编号A61P31/16GK102824635SQ20121029613
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者陈则 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司