一种鱼类败血病病原维氏气单胞菌减毒活疫苗及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种鱼类败血病病原维氏气单胞菌减毒活疫苗及其应用，其将野生型维氏气单胞菌通过基因改造导入一种特异性肽适体SNP?L1，使其毒力减弱，得到维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，利用该减毒株L1制备的活疫苗通过腹腔注射斑马鱼，后期免疫保护率可达65％，可有效预防鱼类细菌性败血病的发生，具有一定的应用价值和减毒活疫苗的开发前景。CGMCC No.1192220151223
【专利说明】
一种鱼类败血病病原维氏气单胞菌减毒活疫苗及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种鱼类细菌性败血病病原维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒 活疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002] 自改革开放以来，我国水产养殖业发展迅速，取得了瞩目的成就，2014年全年水产 品产量6450万吨，比上年增长4.5%。但是人们过于追求经济效益，不断扩大养殖规模，养殖 密度增大，以及一些不科学地管理养殖模式，导致水产养殖细菌病害频发，严重限制水产养 殖业的快速稳定发展。
[0003] 其中由维氏气单胞菌引起的细菌性病害在水产养殖业中很常见。它是一种革兰氏 阴性杆状细菌，一般从临床、自然环境和食品中分离获得，能够侵染多种水产养殖动物，如 虾，鲫鱼、中华绒螯蟹、团头鲂、泥鳅、锦鲤等，严重危害我国水产养殖业的发展。同时对人类 健康安全也造成威胁，它能够引起人类伤口感染，腹泻及免疫功能低下患者的败血症。
[0004] 目前，水产养殖业中主要采用药物防控细菌病害，如大量使用广谱抗生素等化学 药物进行防治。然而，抗生素在长期使用过程中容易导致病原菌耐药性增强、药物残留、生 态环境污染以及危害人类健康等诸多问题，很难实现我国水产养殖业的可持续健康发展。 相对于化学药物，疫苗可以安全有效预防鱼类传染性疾病的发生，是当前鱼类细菌性疾病 防控的最有效方法。但相对于人用和兽用疫苗，鱼用疫苗很少，尤其关于维氏气单胞菌减毒 活疫苗目前在国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鱼类细菌性败血病病原维氏气 单胞菌(Aeromonas veronii)减毒活疫苗及其应用。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人经过大量试验研究筛选特异性肽适体，并将特异 性肽适体通过细菌三亲接合方式导入到野生型毒株维氏气单胞菌中，从而获得了一种维氏 气单胞菌减毒活疫苗。具体地，本发明的技术方案概况如下：
[0007] -种维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会微生物中心(保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所;邮编100101)，保藏日期为2015年12月23日，保藏编号为CGMCC No.11922。
[0008] 本发明所述的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，它是将能表达特异 性肽适体SNP-L1的pRE112质粒导入野生型维氏气单胞菌后而得，所述的特异性肽适体SNP-L1的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0009] 本发明还提供了一种特异性肽适体SNP-L1，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。 [0010]另外，本发明还提供了一种编码上述特异性肽适体SNP-L1的核苷酸序列。优选地， 编码上述特异性肽适体SNP-L1的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
[0011]进一步地，本发明还提供了 一种含有上述特异性肽适体SNP-L1的重组质粒 PRE112-SNP-L1;以及提供了一种含有该重组质粒pRE112-SNP-Ll的宿主。
[0012] 最后，本发明还提供了上述维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1在制备 预防鱼类免受维氏气单胞菌侵染方面的减毒活疫苗中的应用。
[0013] 与现有技术相比，本发明对野生型毒株维氏气单胞菌导入含有特异性肽适体SNP-L1的质粒pRE112-SNP-Ll后制备维氏气单胞菌减毒株L1，其相对于野生毒株具有明显的低 生长能力和低毒性，具有免疫保护能力，对鱼种的免疫保护率可达65%，可有效保护鱼种免 受维氏气单胞菌野生毒株的侵染。所获得的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1 添加佐剂被制备成疫苗并免疫鱼类后，对鱼类具有较好的免疫保护效果，能够有效防控野 生型毒株维氏气单胞菌的感染。
【附图说明】
[0014] 图1为PCR扩增SNP-L1片段的电泳检测图，其中Μ为DS? 5000 Marker;l号为SNP-L1 片段。
[0015] 图2为PCR扩增pkl8mobSacB质粒上的npt II的启动子区及PTRG-SNP-L1质粒上的 SNP-L1片段的电泳检测图，其中Μ为DS? 5000 Marker;l号为npt II片段；2号为SNP-L1片 段。
[0016] 图3为融合片段电泳图，其中Μ为DS? 5000 Marker; 1号为npt II启动子片段和 SNP-L1的融合片段。
[0017] 图4为筛选PRE112-SNP-L1阳性克隆子电泳图，其中2、4、8、10号为阳性克隆子。 [0018]图5为PCR验证是否细菌三亲结合成功的电泳检测图，其中Μ为DS? 5000 Marker; 1-2号为成功导入pREl 12-SNP-L1的维氏气单胞菌;3为空白对照。
[0019] 图6为用野生型毒株维氏气单胞菌和减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1的PCR检 测，其中a-b图分别为取生理盐水组的斑马鱼麻醉致死后，以及用野生型毒株维氏气单胞菌 和减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1腹腔注射后死亡的斑马鱼，取腹腔组织液在LB加氨苄 青霉素固体平板上划线;d图为对在a-b中在LB加氨苄青霉素固体平板上培养的菌落进行菌 落PCR验证，其中Μ为DS? 5000 Marker; 1-2号为注射野生型毒株维氏气单胞菌后死亡的斑 马鱼组织液;3号为空白对照;4-5为注射减毒株维氏气单胞菌A.veronii L1后死亡的斑马 鱼组织液;6号为空白对照。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若 未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;若未特别指 明，实施例中所用试剂均为市售。
[0021] 实施例1维氏气单胞菌减毒活疫苗的制备
[0022] 1、构建 pTRG-SNP-Ll 重组质粒
[0023] 1)PCR 扩增 SNP-L1 片段
[0024] PCR 反应体系（50μ1):1Χ
[0026] SNP F l:5'-CGCGGATCCATGGGTTACCCATACGACGTTC-3'
[0027] SNP R1:5'-CCGCTCGAG TTATCAGCGTTGTCTTCAGAC-3'
[0028] PCR反应条件：
[0030] PCR运行结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照(见图1)。
[0031] 2)PCR产物回收
[0032] 利用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(离心柱型)进行PCR产物 纯化回收，用30μ1 ddH20洗脱。
[0033] 3)SNP-L1PCR纯化产物双酶切 [0034] 其双酶切体系如下：25μ1
[0036] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，37°C酶切5h。然后过柱回收纯化，用30ylddH20 洗脱。
[0037] 4) "革巴"空载体pTRG双酶切
[0038] 其双酶切体系如下：25μ1
[0040] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，37°C酶切5h。然后取1U CIP 37°C处理30min。 然后过柱回收纯化，用30μ1 ddH20洗脱。
[0041] 5)连接反应
[0042]按照载体:基因片段摩尔比为1:3的比例，使用T4DNA ligase进行4°C过夜酶连，酶 连反应体系如下：1〇μ1
[0044] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，4°C冰箱过夜酶连。可以暂时放在_20°C保存。 [0045] 6)制备E.coli XLl-Blue MRF'感受态细胞及热激转化
[0046] 1)采用化学方法0.1M CaC12制备E.coli XLl-Blue MRF'感受态细胞。验证好感受 态细胞质量之后，取?〇μ1连接产物加到?〇〇μ1感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰上静置 30min，不时轻柔旋转；
[0047] 2) 42 °C水浴热激90sec，立即放置冰上冷却2min;
[0048] 3)加入900μ1 37 °C预热的LB液体培养基，混匀，37 °C 150rpm振荡培养lh;
[0049] 4)取200μ1菌液用玻璃棒涂布在LB+Cam+IPTG+X-Gal平板上，37°C倒置培养12-16h〇
[0050] 7)筛选阳性克隆子及测序
[0051 ] 1)挑取上述平板中白色单菌落，点缀到新鲜的LB+Cam平板上，37 °C倒置培养；
[0052] 2)菌落PCR验证阳性克隆子，采用SmpB上下游引物对上述单菌落进行菌落PCR验 证；
[0053] 3)菌落PCR验证成功之后，摇菌扩增质粒，提取质粒送往上海生工测序。测序结果 见SEQ ID N0.1。其中无移码突变，有正确的起始密码子和终止密码子，成功构建"祀"重组 质粒 pTRG-SNP-Ll。
[0054] 2、构建 pRE112-SNP-Ll 重组质粒
[0055] 1)PCR扩增npt II片段和SNP-L1 片段
[0056] PCR 反应体系（50μ1):1Χ
[0058] npt II F:5'-CCCCCGGGAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAG-3'
[0059] npt II (50μ1)：1Χ
[0061] SNP F2:5'-CGCATGATTGAACAAGATGGATGGGTTACCCATACGACGTT-3'SNP R1:5'_ CCGCTCGAGTTATCAGCGTTGTCTTCAGAC-3'
[0062] PCR反应条件：
[0064] PCR运行结束后用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照(见图2)。
[0065] 2)PCR产物回收
[0066] 利用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(离心柱型)进行PCR产物 纯化回收，用30μ1 ddH20洗脱。
[0067] 3)重叠 PCR对npt II片段和SNP-L1片段进行融合
[0068] 1)将第2步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pf u酶进 行PCR 15个循环即可；
[0069] 2)取上述步骤中的PCR产物做为模板，加入引物npt II F及SNP R1进行PCR扩增融 合好的基因片段npt II+SNP-L1，见图3。
[0070] 3)利用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(离心柱型）进行PCR产 物纯化回收，用30μ1 ddH20洗脱。
[0071] 4)酶切
[0072] 1)对融合PCR产物进行双酶切 [0073] 其双酶切体系如下：25μ1
[0075] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，37°C酶切5h。然后过柱回收纯化，用30ylddH20 洗脱。
[0076] 2)自杀质粒pRE112双酶切
[0077] 其双酶切体系如下：25μ1
[0079] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，37°C酶切5h。然后取1U CIP 37°C处理30min。 然后过柱回收纯化，用30μ1 ddH20洗脱。
[0080] 5)连接反应
[0081]按照载体:基因片段摩尔比为1:3的比例，使用T4DNA ligase进行4°C过夜酶连，酶 连反应体系如下：1〇μ1
[0083] 掌型离心机上瞬间离心lOsec混匀，4 °C冰箱过夜酶连。可以暂时放在-20 °C保存。 6)制备E. coli WM3064感受态细胞及热激转化
[0084] 1)采用化学方法0.1M CaC12制备E.coli WM3064感受态细胞。验证好感受态细胞 质量之后，取1〇μ1连接产物加到1〇〇μ1感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰上静置30min，不时 轻柔旋转；
[0085] 2)42。(：水浴热激9〇86(：，立即放置冰上冷却21^11;
[0086] 3)加入900μ1 37 °C预热的LB液体培养基，混匀，37 °C 150rpm振荡培养lh;
[0087] 4)取200μ1菌液用玻璃棒涂布在LB+Cam+IPTG+X-Gal+Dap固体平板上，37°C倒置培 养12-16h。
[0088] 7)筛选阳性克隆子及测序
[0089] 1)挑取上述平板中白色单菌落，点缀到新鲜的LB+Cam+Dap平板上，37 °C倒置培养；
[0090] 2)菌落PCR验证阳性克隆子，采用npt II F和SNP R1引物对上述单菌落进行菌落 PCR验证，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，见图4。
[0091 ] 3)挑取2、4、8、10号，摇菌扩增质粒，提取质粒送往上海生工测序。成功构建好含 npt II启动子的pRE112-SNP-Ll质粒。
[0092] 3、三亲接合法将pREl 12-SNP-L1导入维氏气单胞菌
[0093] 1)从新鲜培养的供体菌E.coli WM 3064(pRE112-SNP-Ll)的平板上挑取单菌落接 种到含Dap和氯霉素的LB液体培养基中，37 °C振荡培养过夜。同时从新鲜培养的受体菌维氏 气单胞菌平板上挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C培养过夜。
[0094] 2)将两种菌液按供体菌:受体菌体积比4:1的比例混合，将细菌重悬液点种于LB加 Dap固体培养基平板上，进行接合反应。
[0095] 3)然后用LB加氨苄青霉素和氯霉素的筛选固体平板进行筛选。
[0096] 4)挑取单菌落，进行菌落PCR验证:用维氏气单胞菌特异性引物ArfA验证是否为维 氏气单胞菌；
[0097] ArfA F:5'-ATGGCCAATATTCGGGTCAA-3'
[0098] ArfA R:5，-TTAGCAGCAGACGCGGATCA-3'
[0099] 同时用pRE112载体上的氯霉素基因引物进行验证是否为pRE112-SNP-Ll质粒。1% 琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照(见图5)。将获得的维氏气单胞菌减毒株命名为维 氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株L1，并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微 生物中心（保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮编 100101)，保藏日期为2015年12月23日，保藏编号为CGMCC No.11922。
[0100] 实施例2以斑马鱼为对象的致病感染实验
[0101] 1)从-70°C取出甘油保存的野生型毒株维氏气单胞菌，在添加有氨苄青霉素的LB 固体培养基上进行划线活化，置30°C培养箱倒置培养16h;
[0102] 2)挑取维氏气单胞菌单菌落，接种到添加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C 过夜振荡培养，测0D600，然后在新鲜的LB培养液中以初始0D600为0.05，30 °C振荡培养至 0D600达到0.6-0.8，室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，用PBS重悬洗涤一遍，然后 室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，再用PBS重悬，然后进行十倍稀释，然后每个梯 度取10μ1对已经在实验室驯养7d的斑马鱼进行腹腔注射攻毒，每个梯度注射10尾，观察注 射后一周内斑马鱼的死亡情况，统计数量；对照组为〇 . 86%的生理盐水。最后用Reed-Muench方法分析结果显示腹腔注射野生型维氏气单胞菌对斑马鱼的半致死浓度为2.25 X 106CFU/ml〇
[0103] 实施例3导入SNP-L1的维氏气单胞菌A.ver L1半致死浓度LD50的测定：
[0104] 1)从_70°C取出甘油保存的导入SNP-L1的维氏气单胞菌A.veronii L1，在添加有 氨苄青霉素的LB固体平板上进行划线活化，置30°C培养箱倒置培养16h;
[0105] 2)挑取A.veronii L1单菌落，接种到添加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C 过夜振荡培养，测0D600,然后在新鲜的LB培养液中以初始0D600为0.05 30°C振荡培养至 0D600达到0.6-0.8，室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，用PBS重悬洗涤一遍，然后 室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，再用PBS重悬，十倍稀释，每个梯度取10μ1对已 经在实验室驯养7d的斑马鱼进行腹腔注射攻毒，每个梯度注射10尾，观察注射后一周内斑 马鱼的死亡情况，统计数量；用Reed-Muench方法分析结果显示腹腔注射A. veronii L1对斑 马鱼的半致死浓度为1.12 X 107CFU/ml。与野生型维氏气单胞菌毒株具有显著性差异。
[0106] 实施例4野生型毒株和减毒株检测实验：
[0107] 1)将注射维氏气单胞菌A.veronii和维氏气单胞菌减毒株A.veronii L1后死亡的 斑马鱼立即取出，同时也取出注射生理盐水的斑马鱼，麻醉处理。
[0108] 2)分开用75%乙醇浸泡5min，在超净台中用无菌剪刀剪开斑马鱼腹部，用无菌接 种环挑取腹腔液体，在添加有氨苄青霉素的LB固体培养基上划线分离，置30°C培养箱倒置 培养16h，观察两组是否都有菌落长出来，以及观察长出来的菌落形态；同时用维氏气单胞 菌的特异性引物ArfA和肽适体SNP-L1引物进行菌落PCR验证(见图6)，结果表明均为目的菌 株。
[0109] 实施例5斑马鱼的免疫保护率分析
[0110] 1)从-70°C取出甘油保存的维氏气单胞菌减毒株A.veronii L1，在添加有氨苄青 霉素的LB固体培养基上，进行划线活化，置30°C培养箱倒置培养16h;
[0111] 2)挑取维氏气单胞菌减毒株A.veronii L1单菌落，接种到添加有氨苄青霉素的LB 液体培养基中，3 0 °C过夜振荡培养，测0 D 6 0 0，然后在新鲜的L B培养液中以初始0 D 6 0 0为 0.05，30°C振荡培养至0D600达到0.6-0.8，室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，用 PBS重悬洗涤一遍，然后室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，再用PBS重悬，以 104CFU/尾对已经在实验室驯养7d的斑马鱼进行腹腔注射，注射20尾，对照组为同剂量的 0.86 %的生理盐水。
[0112] 3)免疫周期14d之前几天，从_70°C取出甘油保存的野生型维氏气单胞菌，在LB加 氨苄青霉素的固体培养基上，进行划线活化，置30°C培养箱倒置培养16h;
[0113] 4)挑取维氏气单胞菌单菌落，接种到添加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C 过夜振荡培养，测0D600，然后在新鲜的LB培养液中以初始0D600为0.05，30 °C振荡培养至 0D600达到0.6-0.8，室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，用PBS重悬洗涤一遍，然后 室温5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，再用roS重悬，以2.25X 106CFU/尾对已经免疫 14d的斑马鱼进行腹腔注射攻毒，对照组为未免疫组及0.86%生理盐水组，也用野生型毒株 维氏气单胞菌进行攻毒，每组注射10尾，观察注射后一周内斑马鱼的死亡情况，统计数量， 使用公式相对免疫保护率(RBS) = (对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率。计算维 氏气单胞菌减毒株A.veronii L1对斑马鱼的免疫保护率。统计结果表明相对免疫保护率 (RBS)=(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率=(100%-35% )/100% = 65% (见 表1)。显示出较好的免疫保护效应。
[0114] 表1减毒株对斑马鱼免疫保护实验结果
[0115]
【主权项】
1. 一种维氏气单胞菌（Aeromonas veronii)减毒株LI，其保藏编号为：CGMCC Νο·11922〇2. 根据权利要求1所述的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株LI，其特征在于， 它是将能表达特异性肽适体SNP-Ll的pRE112质粒导入野生型维氏气单胞菌后而得，所述的 特异性肽适体SNP-Ll的氨基酸序列如序列表中序列1所示。3. 权利要求1所述的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)减毒株Ll在制备预防鱼类免 受维氏气单胞菌侵染方面的减毒活疫苗中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK105950526SQ201610368276
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年1月7日
【发明人】刘鹏, 刘柱, 章跃陵, 胡新文, 唐燕琼, 唐鸿倩
【申请人】海南大学