一种空间葡萄球菌lct-h4的制作方法
【专利摘要】一种空间葡萄球菌LCT?H4，更具体的说是一种太空微生物，运用空间技术从“神舟九号”飞船返回舱内部冷凝水分离获得。其特征：化学异养革兰阳性菌，有菌毛，与琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus亲缘关系最近，对环氧树脂等5种高分子材料具有腐蚀能力。LCT?H4全基因组序列总长2.78Mbp，具有2,562个蛋白编码基因和27个RNA基因。其中334个蛋白注释为 “一般功能预测”，260个蛋白为“氨基酸转运和代谢”，186个蛋白为“糖转运和代谢”，176个蛋白为“无机盐离子转运和代谢”，167个蛋白为“转录”，145个蛋白为“翻译、核糖体结构和形成”，206个蛋白为“未知功能”。CGMCC No.1257220160601
【专利说明】
一种空间葡萄球菌LCT-H4
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物及生物技术领域，涉及一种新的微生物菌株葡萄球菌LCT-H4以 及其生物学特性、基因组DNA序列，利用生物信息学技术进行了组学分析，获得其在基因组 的特性。
【背景技术】
[0002] 在随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领 域。太空密闭舱中存在着特定的微生物群落。虽然每一件物品都经过了严格消毒，微生物仍 会随航天员身体、人体分泌物、航空部件等进入太空，并在航天器密闭舱室内形成特定微生 物群落，既包括无害微生物，也包括一些致病性和腐蚀性微生物。"和平"号运行十余年来空 间站内检测到234种微生物。太空密闭舱内的特殊环境因素，包括微重力、弱磁场和粒子辐 射等，使得微生物会产生变异，导致它们对生存环境的要求很低，更加容易生长和繁殖，某 些微生物的腐蚀性会增强。太空密闭舱中腐蚀性微生物的大量繁殖，使得各种航天材料逐 渐产 生腐蚀，加速航天器件的降解耗损，将可能导致空间站内的设备运行失灵，影响航天器 的长期正常运行及其在轨使用寿命，甚至对飞行安全也会造成很大威胁。航天器服役条件 恶劣，在轨时间长，而维修条件相对不足，一旦发生微生物腐蚀设备故障，损失不可估量。国 外载人航天器在轨经验和国内地面研究的初步结果表明，微生物会严重威胁航天设备安 全。开展长期太空密闭舱中微生物对航天器材腐蚀的机理及防控措施研究，深化对载人航 天器中微生物风险的认识和加强相关技术储备，探索更加有效的载人航天器微生物综合控 制措施，为载人航天器的研制和运营提供技术支撑。
[0003] 针对空间环境下微生物材料腐蚀研究，目前尚无葡萄球菌的相关报道。
【发明内容】
[0004] 在本发明的目的在于提供一种空间葡萄球菌LCT-H4。对空间菌株进行表型检测， 然后对其进行全基因组测序，阐明该细菌的特性及用途。
[0005] 本发明提供的菌株葡萄球菌LCT-H4,其保藏号为CGMCC 12572。
[0006] 所述的葡萄球菌LCT-H4,革兰阳性菌，具有菌毛，与琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus亲缘关系最为相近。对环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯、硫化天然橡胶和 聚乙烯醇聚缩醛5种高分子材料具有腐蚀能力。
[0007] 所述的葡萄球菌LCT-H4，全基因组序列总长度为2.78Mbp，GC含量为33.8%，具有2， 562个蛋白编码基因和27个RNA基因。其中2302个蛋白被分类注释为21类C0G家族，其中334 个蛋白注释为"一般功能预测"，260个蛋白注释为"氨基酸转运和代谢"，186个蛋白注释为 "糖转运和代谢"，176个蛋白注释为"无机盐离子转运和代谢"，167个蛋白注释为"转录"， 145个蛋白注释为"翻译、核糖体结构和形成"，206个蛋白注释为"未知功能"，以及其他。
【附图说明】
[0008] 图1葡萄球菌LCT-H4的革兰氏染色。
[0009] 图2葡萄球菌LCT-H4进化树。
[0010] 图3葡萄球菌LCT-H4在不同琼脂浓度平板表面的菌落扩散。
[0011] 图4葡萄球菌LCT-H4在透射电镜下的特殊结构形态观察。
[0012] 图5葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征。
[0013] 图6葡萄球菌LCT-H4在环氧树脂为唯一碳源培养条件下增长曲线。
[0014]图7葡萄球菌LCT-H4对环氧树脂腐蚀的SEM观察。
[0015] 图8葡萄球菌LCT-H4在酯类聚氨酯为唯一碳源培养条件下增长曲线。
[0016] 图9葡萄球菌LCT-H4对酯类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
[0017] 图10葡萄球菌LCT-H4在醚类聚氨酯为唯一碳源培养条件下增长曲线。
[0018] 图11葡萄球菌LCT-H4对醚类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
[0019]图12葡萄球菌LCT-H4在硫化天然橡胶为唯一碳源培养条件下增长曲线。
[0020]图13葡萄球菌LCT-H4对硫化天然橡胶腐蚀的SEM观察。
[0021]图14葡萄球菌LCT-H4在聚乙烯醇缩甲醛为唯一碳源培养条件下增长曲线。
[0022] 图15葡萄球菌LCT-H4对聚乙烯醇缩甲醛腐蚀的SEM观察。
[0023] 图16葡萄球菌LCT-H4的C0G功能分析和G0分析。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0026] 一、葡萄球菌LCT-H4的表型 1.菌株来源:对"神舟九号"飞船返回舱内部的冷凝水进行了微生物的采集，选用细菌 培养基对样品进行初筛，然后挑取菌落形态不同的单菌落进行划线培养，纯化到单一菌株 后，使用生理盐水加80%甘油保藏菌种。菌株命名为葡萄球菌LCT-H4,保存于中国普通微生 物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC 12572。
[0027] 2.葡萄球菌LCT-H4菌株16s rDNA鉴定：16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约 1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经 扩大培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下： SgF： AGAGTTTGATCATGGCTCAG SgR： TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABI 3730x1全自动序 列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果 去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序）即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server 2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌 16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega 5 · 0软件clusterW多重比 对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为 bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果显示LCT-H4与琥珀葡萄球菌 Staphylococcus succinus的相似性为99%(图2)。
[0028] 3.形态学及运动表型：LCT-H4样品进行稀释涂布，进行革兰氏染色。葡萄球菌 LCT-H4为革兰氏阳性杆菌，菌体单个、成双或成葡萄串状排列（图1)。将LCT-H4单菌落接种 至不同琼脂浓度平板上观察菌落的扩散，并用透射电镜观察鞭毛、菌毛。葡萄球菌LCT-H4在 软琼脂上有明显的扩散(图3);透射电镜下H4观察到菌毛（图4)。
[0029] 4.生化代谢(Biolog)实验:过夜培养葡萄球菌LCT-H4,离心收集菌体后，用接种 液(IF)悬浮菌体配成指定浓度的菌悬液。将菌悬液按每孔100μΙ的量加入Biolog96孔板中， 37°C孵育24h。孵育后，通过显紫色孔所产生的表型指纹同Biolog数据库中的数据进行比较 (见图5)。该菌株生化代谢如表1。
[0030] 表1葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征
注:+阳性，表示LCT-H4可利用该底物生长;+/-弱阳性，表示LCT-H4可部分利用该底 物生长。
[0031] 5.腐蚀性实验:选择航天器已采用的5种高分子材料环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类 聚氨酯、硫化天然橡胶和聚乙烯醇聚缩醛为葡萄球菌LCT-H4腐蚀特性研究对象。
[0032]分别以这5种高分子材料为唯一碳源对菌株LCT-H4进行培养，在不同时间点进行 取样并测定培养液在600 nm波长下的吸光度(0D600)，以判断细菌利用单一高分子材料作 为唯一碳源的生长情况。具体操作如下：向100 mL无菌三角烧瓶中倒入40 mL无机盐基础培 养基，每个培养瓶中加入10个高分子材料试样，接种5 mL菌悬液，透气膜封口，放入32 °C，相 对湿度为75%的恒温培养箱中。每株菌和每个材料准备3个平行样品。设置4个时间点：1、3、 6、10周取样。测定各个时间点培养液600 nm波长下的吸光度，判断细菌利用高分子材料作 为唯一碳源的生长情况。结果（图6、8、10、12、14)表明在1至10周内，菌株^：1'-!14的00600均 大于对照菌株，具有明显的增长现象。
[0033]高分子材料表面微生物膜和腐蚀形态SEM观察：将环氧树脂膜加工成尺寸为10mm (直径）X0.5mm(厚度)圆片;醚类聚氨酯、酯类聚氨酯泡沫和聚乙烯醇缩甲醛泡沫分别加工 成10 mm(长）X 10 mm(宽）X5mm(厚度）的小方块;硫化橡胶膜加工成尺寸为6mm(直径）X 0.5mm(厚度）圆片;所有样品用丙酮浸泡1天，5%乙醇/水溶液中15min灭菌，无菌水清洗至 中性。将培养的菌株LCT-H4分别接种至5种高分子材料膜表面，在不同时间点对高分子材料 膜表面用扫描电子显微镜（SEM)进行观察，如图7、9、11、13、15所示，1至10周内菌株LCT-H4 能在5种高分子材料膜表面形成微生物膜，说明菌株LCT-H4具有降解和腐蚀5种高分子材料 的潜力。
[0034] 二、空间葡萄球菌LCT-H4全基因组测序 采用高通量Solexa测序技术对该样品的DNA进行Paired-End测序。首先提取细菌的基 因组DNA，离心方法收集葡萄球菌LCT-H4菌体，经过重悬、裂解、酚氯仿抽提、异丙醇沉淀、 75%乙醇洗涤、RNase去除RNA和溶解基因组DNA等步骤获得LCT-H4的基因组DNA，并检测其纯 度使之符合建库指标。采用超声法Covaris将大片段基因组DNA随机打断并产生一系列DNA 片段；然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的粘性末 端修复成平末端，再通过3'端加碱基"A"，使得DNA片段能与3'端带有"T"碱基的特殊接头 连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA 片段;建立300bp的小片段文库。对测序得到的原始数据进行过滤及统计;运用SOAP denovo ￥1.05软件和3(^?&1181^以8〇&?2软件对处理后的^&(18数据进行组装。并对基因组和基因 区覆盖度进行评价;采用GlimmeU.O软件从组装结果中获得基因序列并将基因的序列与各 数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。LCT-H4的全基因组序列总长度为2.78Mbp，GC 含量为33.8%，具有2,562个蛋白编码基因和27个RNA基因。其所含蛋白中的2302个蛋白被分 类注释为21类C0G家族，其中334个蛋白注释为"一般功能预测"，260个蛋白注释为"氨基酸 转运和代谢"，186个蛋白注释为"糖转运和代谢"，176个蛋白注释为"无机盐离子转运和代 谢"，167个蛋白注释为"转录"，145个蛋白注释为"翻译、核糖体结构和形成"，206个蛋白注 释为"未知功能"，以及其他(图16)。
[0035]本发明的特点和应用价值:本研究是我国第一次利用自己研发的空间技术获得对 常用航天高分子材料具有腐蚀性的太空舱定植葡萄球菌LCT-H4,为研究载人航天器微生物 腐蚀提供了宝贵的样本。同时，我们对这一分离菌进行了全基因组测序，其序列已经测通， 从而为更好地揭示其腐蚀机制打下了坚实的基础。本研究有助于长期太空密闭舱中微生物 对航天器材腐蚀的机理及防控措施研究，有助于深化对载人航天器中微生物风险的认识和 加强相关技术储备，有助于探索更加有效的载人航天器微生物综合控制措施，从而为载人 航天器的研制和运营提供技术支撑。
[0036] 关于保藏的LCT-H4菌株说明 A. 菌种的保藏单位名称和地址 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 B. 交机构保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏机构给予的保藏号 CGMCC No.12572 D. 分类命名 葡萄球菌 Staphylococcus sp.〇
【主权项】
1. 一种空间葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:保藏号为CGMCC 12572。2. 根据权利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:革兰阳性菌，具有菌毛，与琥珀 葡萄球菌Staphylococcus succinus亲缘关系最为相近;对环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚 氨酯、硫化天然橡胶和聚乙烯醇聚缩醛5种高分子材料具有腐蚀能力。3. 根据权利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于：LCT-H4的全基因组序列总长 度为2.78Mbp，GC含量为33.8%，具有2，562个蛋白编码基因和27个RNA基因。4. 根据权利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于:其所含蛋白中的2302个蛋白被 分类注释为21类COG家族，其中334个蛋白注释为"一般功能预测"，260个蛋白注释为"氨基 酸转运和代谢"，186个蛋白注释为"糖转运和代谢"，176个蛋白注释为"无机盐离子转运和 代谢"，167个蛋白注释为"转录"，145个蛋白注释为"翻译、核糖体结构和形成"，206个蛋白 注释为"未知功能"。
【文档编号】C12R1/44GK105950515SQ201610456293
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】刘长庭, 张学林, 姜学革, 方向群, 郭英华, 王俊峰, 李天志, 周宏 , 潘磊, 徐绸, 黄兵, 余昳
【申请人】中国人民解放军总医院