专利名称：果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌a蛋白-酶联免疫吸附检测方法
技术领域：
本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及到果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋 白-酶联免疫吸附快速检测方法。
背景技术：
耐热菌是引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一，耐热菌超标也是苹果汁生产企 业最急需解决的问题。目前，生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌，平板培养计 数法主要包括美国KFL方法(美国库克实验室法)和澳大利亚Berri公司方法。KFL方法 主要是采用滤膜过滤，将耐热菌截留在滤膜上，再将滤膜置于培养基上培养计数，果汁厂多 采用此方法检测耐热菌。平板培养计数法最大的缺点是耗时长，一般检测周期为4 5天。 目前也有用PCR法(聚合酶链式反应法)检测耐热菌，基于PCR的耐热菌检测方法具有快 速、特异的优点，但对设备、实验室条件以及操作人员要求高，步骤较繁锁，且试验中有些试 剂对人体有一定的毒性，限制了 PCR检测法的广泛使用，推广应用也较困难。另一种方法是由本申请专利发明人所在的课题组提出的耐热菌的ELISA快速检 测方法，已申请了中国专利，专利申请号为200910022897. 7，这种方法简便易行，检测限达 国际标准，可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过1个/IOmL的检测标准，操作过程可在24小 时内完成，达到快速检测的效果。但该方法的加酶标抗体步骤中，采用酶标羊抗兔抗体，操 作步骤较繁琐，灵敏度相对较低，操作时间仍然较长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述耐热菌检测方法的缺点，提供一种操作 简便、检测时间短、灵敏度高、检测成本低的果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋白-酶联免 疫吸附检测方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是它由下述步骤组成1、捕集样品中耐热菌取待检果汁样品，用无菌水稀释10倍，用针筒式滤器过滤捕集耐热菌，滤膜直径 为25mm，膜孔径为0. 22 μ m，将耐热菌截留于滤膜表面。2、耐热菌的增菌培养将截留有耐热菌的滤膜转入装有50mL402培养基的三角瓶中增菌培养至少13小 时，得到增菌培养液。上述的402 培养基配制方法为取 0. 2g (NH4)2SO4^O. 25g CaCl2 ·2Η20、0· 5g MgSO4, 2. Og酵母粉、5. Og葡萄糖、5. Og KH2PO4,溶于IOOOmL蒸馏水中，混勻均勻，用质量分数为 10%的H2SO4调节pH值至4. 0。3、包被酶标板取ImL增菌培养液10000转/分钟离心10分钟，倾去上层清液，沉淀用ImL包被缓冲液稀释制备成待测样品悬液，向酶标板孔内加待测样品悬液，每孔加IOOyL;同时设 阳性对照和阴性对照，用包被缓冲液稀释人工培养的耐热菌至浓度为IX IO5 1乂108个/ mL为阳性对照耐热菌菌悬液，用包被缓冲液作为阴性对照液，置于烘箱中60°C烘干2小时， 用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲 溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。上述的包被缓冲液为物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲液或生 理盐水或物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0. 05mol/L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。4、封闭酶标板向酶标板孔内每孔加入200 μ L封闭液，置于恒温箱中37°C保温封闭30 75分 钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷 酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。上述的封闭液是质量分数为5%的脱脂奶或质量分数为2%的脱脂奶或质量分数 为0. 5 %的牛血清蛋白或质量分数为1 %的牛血清蛋白。5、酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应向酶标板孔内每孔加入质量浓度为0. 3125 160μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与 稀释至1000 8000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，置于 恒温箱中37V反应30 120分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度 为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100 μ L底物工作液，在恒温箱中37。C反应 5 20分钟，加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。上述的耐热菌多克隆抗体的制备方法采用王峰，李建科等报道的《苹果浓缩汁中 嗜酸耐热菌多克隆抗体的制备及纯化》(食品与发酵工业，2009年第35卷第4期，33-36页) 的方法。上述的底物工作液的配制方法为称取7. 16g Na2HPO4加蒸馏水定容至IOOmL, 配制成物质的量浓度为0. 2mol/L的磷酸盐缓冲溶液；称取2. Ig柠檬酸加蒸馏水定容 至IOOmL,配制成物质的量浓度为0. lmol/L的柠檬酸溶液；取25. 7mL物质的量浓度为 0. 2mol/L的磷酸盐缓冲溶液和24. 3mL物质的量浓度为0. lmol/L的柠檬酸溶液，加蒸馏水 定容至IOOmL,摇勻，配制成底物缓冲液；将0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺用IOOmL无水 乙醇溶解，加入IOOmL底物缓冲液中，再加入400 μ L质量分数为30%的H2O2溶液，摇勻，配 制成底物工作液，底物工作液现配现用。6、酶标仪测定用酶标仪在450nm波长测定加入待测样品悬液的酶标板孔即待测样品孔、加入阳 性对照耐热菌菌悬液的酶标板孔即阳性对照孔、加入阴性对照液的酶标板孔即阴性对照孔 的光密度值，即OD值，按⑴式计算P/N值P/N =(样品孔或阳性对照孔OD值-阴性对照孔OD值)/阴性对照孔OD值⑴ 式中P为样品孔OD值或阳性对照孔OD值与阴性对照孔OD值的差值，N为阴性对照孔的OD 值，P/N > 2. 1检出结果判定为阳性，表明样品中有耐热菌存在，P/N < 2. 1检测结果判定为 阴性，表明样品中无耐热菌存在。
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在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤5中，优选选择向酶标板孔内每孔加入质 量浓度为2. 5 μ g/mL 80 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至1000 4000倍的酶标葡 萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中优选37V反应30 90 分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的 磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶 标板孔内每孔加入100 μ L底物工作液，在恒温箱中优选37°C反应10 20分钟，加入50 μ L 物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤5中，最佳选择向酶标板孔内每孔加入质 量浓度为 ο μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至2000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比 1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中最佳37°C反应60分钟，取出，用吐温-20的质量 分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3 次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100μ L底 物工作液，在恒温箱中最佳37。C反应10分钟，加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶 液，终止反应。本发明与耐热菌的ELISA快速检测方法相比，检测时间由24小时缩短到19小时， 提高了灵敏度，耐热菌< 1个/10g，减少了检测所需步骤，降低了检测成本，可用于检测果 汁中的耐热菌。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1以检测pH值为3. 5 4. 5、可溶性固形物含量为71 士 1° Brix的苹果浓缩汁IOmL 为例，其检测方法如下1、捕集样品中耐热菌取待检的pH值为3. 5 4. 5、可溶性固形物含量为71 士 1° Brix的苹果浓缩汁样 品10mL，用无菌水稀释10倍，用针筒式滤器过滤捕集耐热菌，滤膜直径为25mm，膜孔径为 0. 22 μ m,将耐热菌截留于滤膜表面。2、耐热菌的增菌培养将截留有耐热菌的滤膜转入装有50mL 402培养基的三角瓶中增菌培养13小时， 得到增菌培养液。上述的402 培养基的配制方法为取 0. 2g(NH4)2SO4^O. 25g CaCl2 · 2Η20、0· 5g MgSO4,2. Og酵母粉、5. Og葡萄糖、5. Og KH2PO4，溶于IOOOmL蒸馏水中，混合均勻，用质量分 数为10^WH2SO4调节pH值至4. O03、包被酶标板取ImL增菌培养液10000转/分钟离心10分钟，倾去上层清液，沉淀用ImL包被缓 冲液稀释制备成待测样品悬液，向酶标板孔内加待测样品悬液，每孔加IOOyL;同时设阳 性对照和阴性对照，用包被缓冲液稀释人工培养的耐热菌至浓度为1X IO7个/mL的阳性对 照耐热菌菌悬液，用包被缓冲液作为阴性对照液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用吐温-20 的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。上述的包被缓冲液为物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲液，也可 用生理盐水。也可用物质的量浓度为0. Olmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液，还可用物 质的量浓度为0. 05mol/L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。4、封闭酶标板向酶标板孔内每孔加入200 μ L封闭液，置于恒温箱中37°C保温封闭60分钟，取 出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓 冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。上述的封闭液是质量分数为5%的脱脂奶，也可用质量分数为2%的脱脂奶，也可 用质量分数为0. 5 %的牛血清蛋白，还可用质量分数为1 %的牛血清蛋白。 5、酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应向酶标板孔内每孔加入质量浓度为10 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至2000 倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中37。C反应60 分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的 磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶 标板孔内每孔加入100 μ L底物工作液，在恒温箱中37。C反应10分钟，加入50 μ L物质的量 浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。上述的底物工作液的配制方法为称取7. 16g Na2HPO4加蒸馏水定容至IOOmL, 配制成物质的量浓度为0. 2mol/L的磷酸盐缓冲溶液；称取2. Ig柠檬酸加蒸馏水定容 至IOOmL,配制成物质的量浓度为0. lmol/L的柠檬酸溶液；取25. 7mL物质的量浓度为 0. 2mol/L的磷酸盐缓冲溶液和24. 3mL物质的量浓度为0. lmol/L的柠檬酸溶液，加蒸馏水 定容至IOOmL,摇勻，配制成底物缓冲液；将0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺用IOOmL无水 乙醇溶解，加入IOOmL底物缓冲液中，再加入400 μ L质量分数为30%的H2O2溶液，摇勻，配 制成底物工作液，底物工作液现配现用。6、酶标仪测定用酶标仪在450nm波长测定加入待测样品悬液的酶标板孔即待测样品孔、加入阳 性对照耐热菌菌悬液的酶标板孔即阳性对照孔、加入阴性对照液的酶标板孔即阴性对照孔 的光密度值，即OD值，按⑴式计算P/N值P/N =(样品孔或阳性对照孔OD值-阴性对照孔OD值)/阴性对照孔OD值(1) 式中P为样品孔OD值或阳性对照孔OD值与阴性对照孔OD值的差值，N为阴性对照孔的OD 值，P/N > 2. 1检出结果判定为阳性，表明样品中有耐热菌存在，P/N < 2. 1检测结果判定为 阴性，表明样品中无耐热菌存在。实施例2以检测pH值为3. 5 4. 5、可溶性固形物含量为71 士 1° Brix的苹果浓缩汁IOmL 为例，其检测方法如下在本实施例的封闭酶标板步骤4中，向酶标板孔内每孔加入200 μ L封闭液，置于 恒温箱中37°C保温封闭30分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为 0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在 纱布上倒扣轻轻拍干。
在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤5中，向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 0.3125yg/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至8000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1 混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中37°C反应20分钟，取出，用吐温-20的质量分数为 0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次 2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100 μ L底物工作液， 在恒温箱中37°C反应5分钟，加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。 该步骤的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例1相同。实施例3以检测pH值为3. 5 4. 5、可溶性固形物含量为71 士 1° Brix的苹果浓缩汁IOmL 为例，其检测方法如下在本实施例的封闭酶标板步骤4中，向酶标板孔内每孔加入200 μ L封闭液，置于 恒温箱中37°C保温封闭75分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为 0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在 纱布上倒扣轻轻拍干。在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤5中，向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 160 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至1000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1 混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中37°C反应120分钟，取出，用吐温-20的质量分数为 0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次 2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100 μ L底物工作液， 在恒温箱中37。C反应20分钟，加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。 该步骤的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例1相同。为了确定本发明检测步骤中的各最佳条件，发明人进行了大量的实验室研究试 验，每种实验重复三次，实验结果为三次重复试验的平均值，各种试验情况如下试验材料与试剂浓缩苹果汁，pH值3. 5 4. 5，可溶性固形物含量为 71 士 Γ Brix，由陕西恒兴果汁有限公司以及国投中鲁果汁股份有限公司提供；耐热菌，由 发明人所在的实验室从陕西恒兴果汁饮料有限公司苹果汁中分离并保存的菌种；耐热菌多 克隆抗体，由发明人所在的实验室制备及保存；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨 大芽孢杆菌、黑曲霉菌及金黄色葡萄球菌，均由陕西师范大学生命科学学院微生物实验室 提供；硫酸铵(SAS)，由北京鼎国生物公司提供；酶标牛血清蛋白，由北京博奥森生物技术 有限公司提供。试验仪器BX41-12P02奥林巴斯显微镜，由泽仕光电科技(上海)有限公司生 产；UNICO WFJ2000型可见分光光度计，由上海龙尼柯仪器有限公司生产；U-3010型紫外 可见分光光度计，由日本HITACHI公司生产；GSP-9080-MBE型隔水式恒温培养箱，由上海 博讯实业有限公司医疗设备厂生产；TGL-16G型台式离心机，由上海安亭科学仪器厂生产； SW-CJ-IF型超净操作台，由苏净集团安泰公司生产；HHW-21⑶-600型电热恒温水槽，由上 海福玛实验设备有限公司生产；XW-80A漩涡混合仪，由海门市其林贝尔仪器制造有限公司 生产；KQ3200B型超声波清洗机，由昆山市超声仪器有限公司生产；TDL-4型离心机，由上海 医用分析仪器厂生产；伯乐680型酶标仪，由美国伯乐公司生产；微孔板振荡器，由杭州奥 盛仪器有限公司生产；D25mm透析袋，由北京鼎国生物技术有限公司；德国Eppendorf精密微量移液器(10 100 μ L，0. 1 10 μ L，30 300 μ L)。1、确定耐热菌的增菌培养时间将浓度为1个/IOmL的耐热菌苹果浓缩汁用无菌水稀释至10倍，用针筒式滤器 过滤捕集耐热菌，滤膜直径为25mm，膜孔径为0. 22 μ m,将耐热菌截留于滤膜表面，将截留 有耐热菌的滤膜转入装有50mL402培养基中增菌培养，在不同培养时间取增菌培养液lmL， 10000转/分钟离心10分钟，倾去上层清液，沉淀分别用ImL物质的量浓度为0. 05mol/L pH 值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成耐热菌菌悬液，每孔加100 μ L，同时设阴性对照，阴性对照 用物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，按照实施例1中步骤3至步骤 6进行操作，并按式(1)计算P/N值，实验及计算结果见表1。表1不同增菌培养时间的耐热菌检测结果 由表1可见，将浓度为1个/IOmL的耐热菌培养13小时以上，检测所得P/N值均 大于2. 1，培养时间越长，所得P/N值越大，即在实际检测中从果汁样品捕集耐热菌后至少 增菌培养13小时以上即可检出耐热菌。2、确定包被缓冲液取耐热菌，分别以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液、生 理盐水、物质的量浓度为O.Olmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为 0. 05mol/L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液制备成浓度为 1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液各100 μ L，同时设阴性对照，阴性对照分别用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液、生理盐水、物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为 7. 4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为8. 5的Tris-HCl缓冲溶液，置 于烘箱中60°C烘干2小时，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/LPH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣 轻轻拍干。按照实施例1中步骤4至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值。实验及计算结果见表2。表2不同包被缓冲液的耐热菌检测结果 由表2可见，以物质的量浓度为0.05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液或生 理盐水或物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0. 05mol/L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液制备的耐热菌菌悬液，P/N值均 大于2. 1，其中以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲液制备的耐热菌菌悬 液，P/N值最大。本发明选择以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液或 生理盐水或物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0. 05mol/L pH值为8. 5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液作为包被缓冲液制备耐热菌菌 悬液，最佳为物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲液。3、阳性对照耐热菌菌悬液浓度的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 分别为1 X IO5个/mL、1 X IO6个/mL、1 X IO7个/mL、1 X IO8个/mL的耐热菌菌悬液400 μ L ； 取4块酶标板，分别将4份耐热菌菌悬液加入4块酶标板孔内，每孔加100 μ L，同时设阴 性对照，阴性对照用物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中 60°C烘干2小时，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为 7. 4的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣 轻轻拍干。按照实施例1中步骤4至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值。实验及计 算结果见表3。表3阳性对照耐热菌菌悬液浓度的选择 由表3可见，耐热菌菌悬液浓度为IX IO5 IX IO8个/mL时，P/N值均大于2. 1， 即当耐热菌菌悬液浓度为IXio5个/mL以上时均可检测出样品中存在耐热菌。本发明选 择阳性对照耐热菌菌悬液浓度为IX IO5 IX IO8个/mL，最佳为lX107f/mL。4、封闭液的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液4份每份100 μ L，取4块酶标板，向酶标板孔内每孔加入 100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲洗酶标 板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，再在纱布上倒扣轻轻拍干，再分别向酶标板孔内加入质 量分数为5%的脱脂奶、质量分数为2%的脱脂奶、质量分数为0. 5%的牛血清蛋白(BSA)、 质量分数为的牛血清蛋白作为封闭液，每孔加入200yL，置于恒温箱中37°C保温封闭 60分钟，取出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。按 照实施例1中步骤5至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值，实验及计算结果见表4。表4封闭液的选择 由表4可见，以质量分数为5 %的脱脂奶或质量分数为2 %的脱脂奶或质量分数为 0.5%的牛血清蛋白或质量分数为的牛血清蛋白作为封闭液，P/N值均大于2. 1，其中以 质量分数为5%的脱脂奶为封闭液时P/N值最大。本发明选择质量分数为5%的脱脂奶或 质量分数为2 %的脱脂奶或质量分数为0. 5 %的牛血清蛋白或质量分数为1 %的牛血清蛋 白作为封闭液，最佳为质量分数为5%的脱脂奶。5、封闭时间的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液4份每份100 μ L，取4块酶标板，向酶标板孔内每孔加入 100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲洗酶标 板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，再向酶标板孔内每孔加入质量分数为5%的脱脂奶200 μ L，分别置于恒温箱中37°C保温封闭30、45、60、75分钟，取出，用 吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶 液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。按照实施例1中 步骤5至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值，实验及计算结果见表5。表5封闭时间的选择 由表5可见，封闭时间为30 75分钟时，P/N值均大于2. 1，封闭60分钟P/N值 最大，封闭效果最好。本发明选择封闭时间为30 75分钟，最佳为60分钟。6、耐热菌多克隆抗体浓度的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液10份每份100 μ L，取10块酶标板，分别向酶标板孔内每 孔加入100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的 量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲 洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，再向酶标板孔内每孔加 入200 μ L质量分数为5%的脱脂奶，置于恒温箱中37°C保温封闭60分钟，取出，用PBST冲 洗酶标板3次，每次2 3分钟，分别向酶标板孔内每孔加入质量浓度为160、80、40、20、10、 5,2. 5、1. 25,0. 625,0. 3125 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至2000倍的酶标葡萄球菌A 蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中37°C保温反应60分钟，其他步骤 按照实施例1中步骤5至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值。实验及计算结果见表 6。表6耐热菌多克隆抗体浓度的选择 由表6可见，耐热菌多克隆抗体的质量浓度为0. 3125 160 μ g/mL时，Ρ/Ν值均大 于2. 1。本发明选择质量浓度为0.3125 160 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体，最佳为IOyg/
mLo7、酶标葡萄球菌A蛋白稀释倍数的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液4份每份100 μ L，取4块酶标板，向酶标板孔内每孔加入 100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲洗酶标 板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，再向酶标板孔内每孔加入质量 分数为5%的脱脂奶200 μ L，置于恒温箱中37°C保温封闭60分钟，取出，用PBST冲洗酶标 板3次，分别向酶标板孔内加入质量浓度为10 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至1000、 2000、4000、8000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物，每孔加入200 μ L， 置于恒温箱中37°C保温反应60分钟，其他步骤按照实施例1中步骤5至步骤6进行操作， 并按式(1)计算P/N值，实验及计算结果见表7。表7酶标葡萄球菌A蛋白稀释倍数的选择 由表7可见，酶标葡萄球菌A蛋白稀释1000 8000倍时，P/N值均大于2. 1，稀释 2000倍时P/N值最大。本发明选择酶标葡萄球菌A蛋白稀释1000 8000倍，最佳为2000倍。8、耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应时间的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度
12为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液4份每份100 μ L，取4块酶标板，向酶标板孔内每孔加入 100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲洗酶 标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，再向酶标板孔内每孔加入质 量分数为5%的脱脂奶200 μ L，置于恒温箱中37°C保温封闭60分钟，取出，用PBST冲洗酶 标板3次，每次2 3分钟，向酶标板孔内每孔加入质量浓度为10 μ g/mL的耐热菌多克隆 抗体与稀释至2000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，分别 置于恒温箱中37°C保温反应30、60、90、120分钟，其他步骤按照实施例1中步骤5至步骤6 进行操作，并按式(1)计算P/N值，实验及计算结果见表8。表8耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应时间的选择 由表8可见，耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应30 120分钟，P/N值均大于2. 1， 60分钟时P/N值最大。本发明选择耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应30 120分钟，最佳为 60分钟。9、底物工作液反应时间的选择取耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度 为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液4份每份100 μ L，取4块酶标板，向酶标板孔内每孔加入 100 μ L浓度为1 X IO7个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照用物质的量浓度 为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，置于烘箱中60°C烘干2小时，用PBST冲洗酶标 板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，再向酶标板孔内每孔加入质量 分数为5%的脱脂奶200 μ L，置于恒温箱中37°C保温封闭60分钟，取出，用PBST冲洗酶标 板3次，每次2 3分钟，向酶标板孔内每孔加入质量浓度为10 μ g/mL的耐热菌多克隆抗 体与稀释至2000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温 箱中37°C保温反应60分钟，取出，用PBST冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，向酶标板孔内 每孔加入100 μ L底物工作液，分别置于37°C恒温箱中保温反应5、10、15、20分钟，向酶标板 孔内每孔加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。用酶标仪在450nm波 长测定OD值，按式⑴计算P/N值。实验及计算结果见表9。表9底物工作液反应时间的选择 由表9可见，底物工作液反应时间5 20分钟，P/N值均大于2. 1，10分钟时P/N 值最大。本发明选择底物反应时间为5 20分钟，最佳为10分钟。为了证明本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1的方法测试苹果汁中耐 热菌的检出限、特异性试验以及重复性试验，并与传统平板培养计数法(KFL法)的测试结 果进行了比较，各种试验情况如下1、特异性试验分别取耐热菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、黑曲霉菌、金黄色葡萄球 菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液制备成浓度为1 X IO7个/mL 的菌悬液，按照实施例1中步骤3至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值。实验及计算结果见表10。表10特异性试验 由表10可见，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、黑曲霉菌及金黄色葡萄 球菌制备的菌悬液，ρ/Ν值均低于2. 1，为阴性；而以耐热菌制备的菌悬液，P/N值为27，呈 强阳性，说明本发明与果汁中除耐热菌之外的其他常见菌无交叉反应，特异性良好。2、重复性试验(1)板内重复试验按照实施例1的方法，重复实验4次，测试4块用耐热菌包被的酶标板，计算板内 变异系数，实验及计算结果见表11。
表11板内重复性试验 (2)板间重复性试验按照实施例1的方法，重复实验5次，测试5块用耐热菌包被的酶标板，计算板间 变异系数，实验及计算结果见表12所示。表12板间重复性试验 由表10和11可见，本发明板内变异系数及板间变异系数均小于10%，说明本发明
重复性较好。3、对耐热菌人工培养样品的检出限验证取人工培养的耐热菌，以物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液 分别制备成浓度为 5 X IO3 个 /mL、1 X IO4 个 /mL、5 X IO4 个 /mL、1 X IO5 个 /mL、1 X IO6 个 / mL、1 X IO7个/mL、1 X IO8个/mL、1 X IO9个/mL的耐热菌菌悬液，同时设阴性对照，阴性对照 用物质的量浓度为0. 05mol/L pH值为9. 6的碳酸缓冲溶液，按照实施例1步骤3至步骤6 进行操作，并按式(1)计算P/N值，每个浓度设两个平行孔，实验及计算结果见表13。表13耐热菌人工培养样品检出限的确定 由表13可见，当耐热菌菌悬液浓度高于1 X IO4个/mL时，检测所得P/N值均大于 2. 1，呈阳性，低于1 X IO4个/mL时，P/N值均小于2. 1，呈阴性，即本发明对耐热菌人工培养 样品的检出限为IXlO4个/mL。4、对耐热菌人工回添果汁样品的检出限验证将浓度为1 X IO4个/mL、5 X IO4个/mL、IX IO5个/mL的耐热菌菌悬液分别回添入
灭菌果汁中，按照本发明实施例1中步骤3至步骤6进行操作，并按式(1)计算P/N值，实 验及计算结果见表14。表14耐热菌人工回添果汁样品的检测结果 由表14可知，将浓度为1 X IO4个/mL、5 X IO4个/mL、1 X IO5个/mL的耐热菌菌悬
液分别回添入灭菌果汁中后，采用本发明检测，所得P/N值均大于2. 1，呈阳性，说明本发明 方法可检测出人工回添果汁中1 X104f/mL以上含量的耐热菌。5、对实际果汁样品中耐热菌的检测限确定按照本发明实施例1中的方法和传统平板培养计数法(KFL法)检测果汁中的耐 热菌，实验结果见表15。表15实际果汁样品中耐热菌的检测结果 *检测结论按< 1个/IOgAJC为合格的标准，“ + ”表示阳性，即有耐热菌，“_”表 示阴性，即无耐热菌。由表15可见，其中4份果汁样品采用本发明检测结果的P/N值分别为4. 41,5. 2、16. 13,25. 32，均大于2. 1，为阳性；而采用传统培养计数检测结果分别为4、9、18、29 ；另外1 份样品传统培养计数检测结果为耐热菌< 1个/10g，本发明检测结果P/N值为0. 23，为阴 性。5份样品采用本发明方法检测结果与传统培养计数法完全符合，说明本发明建立的检测 体系结果可靠，在实践中可推广使用。
权利要求
一种果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋白 酶联免疫吸附检测方法，由捕集样品中耐热菌、耐热菌的增菌培养、包被酶标板、封闭酶标板、加酶标抗体与底物反应、酶标仪测定组成，其特征在于所说的加酶标抗体与底物反应步骤为向酶标板孔内每孔加入质量浓度为0.3125～160μg/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至1000～8000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比1∶1混合的混合物200μL，置于恒温箱中37℃反应30～120分钟，取出，用吐温 20的质量分数为0.05％的物质的量浓度为0.01mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2～3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100μL底物工作液，在恒温箱中37℃反应5～20分钟，加入50μL物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。
2.按照权利要求1所述的果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋白-酶联免疫吸附检测方 法，其特征在于在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤中，向酶标板孔内每孔加入质量浓 度为2. 5 μ g/mL 80 μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至1000 4000倍的酶标葡萄球 菌A蛋白按体积比1 1混合的混合物200μ L，置于恒温箱中37°C反应30 90分钟，取 出，用吐温-20的质量分数为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓 冲溶液冲洗酶标板3次，每次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内 每孔加入100 μ L底物工作液，在恒温箱中37°C反应10 20分钟，加入50 μ L物质的量浓 度为2mol/L的硫酸溶液，终止反应。
3.按照权利要求1所述的果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋白-酶联免疫吸附检测 方法，其特征在于在酶标葡萄球菌A蛋白与底物反应步骤中，向酶标板孔内每孔加入质量 浓度为 ο μ g/mL的耐热菌多克隆抗体与稀释至2000倍的酶标葡萄球菌A蛋白按体积比 1 1混合的混合物200 μ L，置于恒温箱中37°C反应60分钟，取出，用吐温_20的质量分数 为0. 05%的物质的量浓度为0. 01mol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每 次2 3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，向酶标板孔内每孔加入100 μ L底物工作 液，在恒温箱中37。C反应10分钟，加入50 μ L物质的量浓度为2mol/L的硫酸溶液，终止反 应。
全文摘要
一种果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌A蛋白-酶联免疫吸附检测方法，由捕集样品中耐热菌、耐热菌的增菌培养、包被酶标板、封闭酶标板、加酶标抗体与底物反应、酶标仪测定组成。本发明与耐热菌的ELISA快速检测方法相比，检测时间由24小时缩短到19小时，提高了灵敏度，耐热菌＜1个/10g，减少了检测所需步骤，降低了检测成本，可用于检测果汁中的耐热菌。
文档编号G01N33/569GK101900732SQ20101024978
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者余朝舟, 李建科 申请人:陕西师范大学