专利名称：金黄色葡萄球菌特异性诊断学的制作方法
技术领域：
本发明涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的诊断学领域，更特别地涉及基于阵列的对金黄色葡萄球菌菌株进行分型(typing)的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是住院患者护理中的一个主要问题。有许多不同的金黄色葡萄球菌菌株，其中一些对很多种抗生素有抗性。金黄色葡萄球菌的不同菌株在感染性方面表现不同。一些菌株在患者之间快速传播，而另一些菌株不是很容易传播。鉴于至少一些金黄色葡萄球菌菌株能在住院患者中导致严重疾病，医院采取非常严格的卫生规定。先前不可能快速确定一个特定的菌株是否是快速传播菌株(流行性菌株)。因此面对二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的患者医院别无选择，只能是执行最严格的检疫和卫生规定。
阵列技术在与生物学和医学相关的各个领域中已成为重要工具。这些年来已开发了几种类型的阵列。随着小型化和自动化的到来，越来越多的信息已经进入阵列。阵列技术的目前趋势是产生更大的阵列，在它们之上携带越来越多的信息。
在基于阵列的诊断学中，杂交模式或者阵列上各种斑点与样品核酸杂交的强度模式含有待与另一种样品核酸的数据进行对比的数据。在传统阵列中，为了经济和精确性的原因，每个斑点的核苷酸数目保持在尽可能低。
阵列上所含的更高水平信息主要用于提供核酸样品的更详细的分析，即使得进行对比的两个这种样品之间的最小的差异变得可见或者被揭示。例如，在人类诊断学中，阵列被用于对具有相同疾病但不同预后的患者组进行分类，并由此揭示导致这种预后差异的基因。这些实验大多数基于表达阵列进行，因为只有特定基因的表达水平被认为提供区分两组患者必需的解决方案，即提供足够的区分它们的能力。
在这些已知为表达谱分析(expression profiling)的诊断方法中，用于探查阵列的核酸(即表达的mRNA)提供了复合核酸(complex nucleicacid)。在阵列中导入较大数量的核苷酸导致另一难题，特别是当复杂核酸被用于探查阵列时。在表达谱分析的情况下，大量的斑点具有值为0和1之间的信号，表明不是斑点中的所有核酸均与探针核酸杂交，而这是用于确定或量化所涉及的基因的表达水平的一个特征。
最终，当对比不同的杂交模式时，需要决定阵列中的哪些信号包括在分析中，哪些不使用。通常这基于截断值(cut-off value)进行，截断值的引入使得分析偏向包括特定斑点的强度的最显著或最大改变。参考模式在这一过程中起重要作用，该模式是用来与测试材料或样品核酸所产生的模式进行对比的模式。现有技术方法的一个问题是核酸的表达代表了生物体所处的状态，即根据环境不同，同一生物体可有不同的表达模式。现有技术方法由此不太适合在不考虑其代谢状态的情况下对生物体进行分型。
发明概述本发明人现已发现一种制备参考杂交模式的方法，其提供了高分辨能力，使得能对样品核酸在令人惊讶地详细的水平上进行分型。例如，本发明人现设计了一种分型方法，其使得不同细菌菌株的样品核酸在如流行性这样详细的表型参数的水平上进行分型，而分型本身基于全基因组阵列差异杂交(whole-genome-array differentialhybridization)而发生。在这些全基因组阵列差异杂交方法中，阵列上的核酸分子和样品核酸均由(随机)基因组DNA片段组成。获得这一详细水平是令人惊奇的，因为人们不会预期可以基于基因组DNA的组成而区分金黄色葡萄球菌菌株的流行性和非流行性亚型。
在一个方面，本发明提供了能够快速确定一种MRSA菌株是否是流行性菌株的手段和方法。本发明还适于确定特定的金黄色葡萄球菌菌株的其它特征。为此，本发明提供了特异的阵列，它们能区分金黄色葡萄球菌各种菌株，并且更重要地，用以估计特定金黄色葡萄球菌菌株的性质，甚至在阵列上产生的杂交模式与早先已产生的杂交模式不同的情况下进行。
因此，在一个方面，本发明提供了对衍生自或得自一金黄色葡萄球菌菌株的样品核酸进行分型的方法，包括-提供包含多个核酸分子的阵列，其中所述多个核酸分子衍生自第一组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株；-通过将所述阵列与得自或衍生自第二组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株的至少两种不同参考核酸进行杂交而提供至少两种不同的参考杂交模式，其中所述第二组中的所述金黄色葡萄球菌菌株基于至少一个表型参数的值可分成至少两组；-通过无监督的多变量分析(unsupervised multivariateanalysis)群集(clustering)参考杂交模式而产生参考杂交模式的至少两种不同的集群(cluster)；-将与用于制备参考杂交模式的阵列相同的阵列与样品核酸杂交以获得样品杂交模式；以及-将所述样品杂交模式归于(assign to)所述参考杂交模式的至少两种不同的集群中的一种。
在一个优选的实施方案中，所述样品核酸中的片段的平均大小在约50至5000个核苷酸之间。
在另一优选的实施方案中，所述多个核酸分子的分子平均大小在约200至5000个核苷酸之间。
在另一个优选的实施方案中，所述阵列包括随机选自所述至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株的片段化的基因组DNA的片段的约1500至5000个核酸分子。
在另一优选的实施方案中，所述样品核酸衍生自金黄色葡萄球菌的纯培养物。
在另一优选的实施方案中，所述多个核酸分子衍生自至少3种、优选地至少5种、更优选地至少8种不同的金黄色葡萄球菌菌株。
在另一优选的实施方案中，所述方法包括将样品杂交模式与至少3种、更优选地至少5种、更优选地至少50种不同参考杂交模式进行对比。
在另一优选的实施方案中，所述表型参数是所述金黄色葡萄球菌菌株的流行性。
在另一优选的实施方案中，所述对比包括参考杂交模式与样品杂交模式的偏最小二乘法判别分析(Partial Least Square-DiscriminantAnalysis，PLS-DA)，其中至少一个其值对于参考杂交模式是已知的(并且其信息被用于监督所述PLS-DA分析)的表型参数被针对样品核酸或其衍生来源而额外确定或估计。
在另一优选的实施方案中，所述方法进一步包括基于有监督的PLS-DA分析对模式进行群集。
在另一优选的实施方案中，所述方法进一步包括基于集群的存在与否对所述样品核酸进行分型。
在另一优选的实施方案中，基本上所有参考杂交模式由金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生。
在另一优选的实施方案中，所述分型包括确定衍生所述样品核酸的金黄色葡萄球菌是否是流行株。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述阵列的组合，其中所述试剂盒进一步包括至少两种不同的参考杂交模式或衍生自上述金黄色葡萄球菌菌株的参考核酸。
附图简述
图1是金黄色葡萄球菌菌株列表及其流行性特征。每一MRSA菌株由一独特的TNO Type Collection编号(TTC nr，第1列)代表。每一菌株通过Riboprint分类被鉴定为金黄色葡萄球菌(第2列)。流行性特征通过日常医院实践确定(第3列)。
图2显示了通过全基因组阵列差异杂交数据的有监督的PLS-DA分析对MRSA菌株的流行性进行群集。将19种不同MRSA菌株的Cy标记的基因组DNA与含有金黄色葡萄球菌基因组的代表的阵列杂交。用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)基于每一MRSA菌株的已知流行性特征分析金黄色葡萄球菌菌株的量化的荧光杂交模式，这些模式代表了高度复杂的n维数据集。下方的PLS-DA图显示了每一单菌株复杂杂交模式在一2维平面的单点投影(小圈，文字表示图1所提到的菌株TTC.03编号)。In duplo杂交的菌株用粗体字表示。基于数据集的一个特异部分，PLS-DA分析能够根据其已知的流行性对在两个单独的集群中的菌株进行群集(手工椭圆，E＝流行性，N＝非流行性)。注Cy5/Cy3比例通过截断值0.5而转化为0和1数据集。PLS-DA通过平均中心化(mean centering)进行测量(scaling)。非流行性菌株“236”通过PLS-DA定位于E-集群和N-集群之间。数据集编号是指图1所示菌株编号。
图3示出了在如下偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)分析方法的部分中所述的模型复杂性的各个方面。
图4示出了如下在主成分判别分析(PrincipalComponent-Discriminant Analysis，PC-DA)的部分中所述的判别分析的各个方面。在本图中，D是判别轴，P是投影线，X1和X2是两个变量，x和o代表来自两个不同组的样品。
发明详述本发明的一个特征是，与样品核酸和参考核酸之间的遗传对比一起(例如，同时、之前或之后)，对于参考核酸的每一来源确定至少一个表型参数(例如流行性)，该表型参数然后被用于数据的统计学分类。
本发明一般地利用差异杂交来进行样品核酸分类并特别利用全基因组差异杂交来对生物体进行分类。本发明在一个实施方案中涉及采用来自不同金黄色葡萄球菌菌株的集合的随机基因组DNA片段的阵列来根据临床相关特征(如抗生素抗性、流行性、毒力、致病性等)对“新的”金黄色葡萄球菌菌株进行分类的方法。
由此，当本发明规定至少两个不同的金黄色葡萄球菌菌株必须是基于感兴趣的至少一个表型参数的值而可分成至少两组时，本发明的方法在一个优选的实施方案中使得可以区分流行性和非流行性亚型。
在本发明的一个方面，提供有关金黄色葡萄球菌参考菌株的至少一种表型特征的信息的额外步骤提供了一种方法，其使用来自由金黄色葡萄球菌不同菌株组成的组的例如基因组DNA片段的非特异性集合对用例如所述组内或组外的未知成员的gDNA获得的杂交模式根据相似性进行群集并进行分类，并且该方法能基于至少一种表型特征进一步区分或分离那些集群。
术语非特异性(a-specific)是有意使用的，因为本发明的阵列提供了一种分析工具，其不是必须仅适合分析与点在阵列上的不同金黄色葡萄球菌菌株的核酸相关的金黄色葡萄球菌菌株的核酸，而是提供了原则上足够的判别能力以分析与阵列上的核酸在分类学上远离的或不相关的基因组。然而，最佳结果和最高判别能力是当选择用于阵列的多个核酸分子的核酸从而使样品核酸是高度相关的(即其杂交模式在参考模式之间群集或与参考模式群集)时获得的。
阵列上的多个核酸分子衍生自至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株，优选地，所述多个核酸分子衍生自至少3种、更优选地至少5种、更优选地至少8种不同的金黄色葡萄球菌菌株。
阵列核酸分子典型地是金黄色葡萄球菌菌株的(通常单链的)基因组DNA片段。
在本发明的一个方法中，用于制备参考杂交模式的不同金黄色葡萄球菌菌株基于表型特征或参数可分成至少两组，在本文中也称为至少一个感兴趣的表型参数的值。术语“值(value)”包括定量和定性的值。因此，例如，阵列包含来自金黄色葡萄球菌流行性菌株的基因组DNA片段和来自非流行性菌株的基因组DNA片段。已发现本方法最终适合于对金黄色葡萄球菌的不同菌株进行快速和精确分型。例如，在二甲氧基苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的情况下，甚至能区分流行性菌株和非流行性菌株。
因此，在本发明的一个特别优选的方面，得自或衍生自至少两个不同金黄色葡萄球菌菌株的核酸被用于产生参考杂交模式。优选地，通过得自或衍生自不同金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生至少5个、更优选至少50个参考杂交模式。在一个特别优选的实施方案中，基本上全部参考杂交模式通过金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生。
这一特别优选的实施方案优选地与统计学分析组合以对比参考和样品杂交模式。以这种方式可以确定一个金黄色葡萄球菌菌株包含一些但不是全部金黄色葡萄球菌菌株的特定表型特征或基因型相关性的几率。所述核酸可以衍生自RNA但优选地衍生自或得自DNA，即衍生自基因组。因此，在本发明的一个优选实施方案中，核酸分子衍生自DNA。
参考杂交模式典型地通过将本发明的阵列与参考生物体杂交而衍生，其中典型地一个金黄色葡萄球菌菌株给出一个参考杂交模式。当然，为了确定菌株之间的关系，所述至少两种不同参考核酸和样品核酸衍生自不同的金黄色葡萄球菌菌株。在一个实施方案中，本发明涉及对金黄色葡萄球菌菌株进行分类的方法，包括将金黄色葡萄球菌测试菌株的DNA与本发明的DNA阵列杂交，所述DNA阵列包含大量随机选择的基因组DNA片段，所述基因组DNA片段衍生自至少2种、优选地至少3种、更优选地至少4种、更优选至少8种不同的金黄色葡萄球菌菌株，以在所述参考生物体中对所述测试生物体的基因组DNA进行分类。
在一个优选的实施方案中，所述DNA阵列包含约1000至约10000个、优选约1500至约5000个、最优选约1800至约2400个、更优选约1900至约2200个随机选择的基因组DNA片段。
在一个优选的实施方案中，所述随机选择的基因组DNA片段长度为约500至约5000、更优选约1000至约2000、更优选约1300至约1800、更优选约1400至约1600个核苷酸。因此，在最优选的实施方案中，本发明方法采用的DNA阵列包含约3兆碱基。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种对微生物进行分类的方法。所述方法采用DNA阵列，所述阵列包含大量(约1000至约10000、优选约1500至约5000、最优选约1800至约2400、更优选约1900至约2200个)随机选择的基因组DNA片段(优选地长度为约500至约5000、更优选约1000至约2000、更优选约1300至约1800、更优选约1400至约1600个核苷酸)，所述基因组DNA片段衍生自至少2种、优选地至少3种、更优选地至少4种、例如5、6或7种、更优选至少8种不同微生物的混和物以对一种微生物的基因组DNA进行分类。所述混和物可以合适地代表不同金黄色葡萄球菌菌株的gDNA库。
本发明的方法优选地使用全基因组阵列以通过杂交研究或确定在其它金黄色葡萄球菌菌株中是否存在相对的(即互补的)DNA区域。与现有技术方法不同，本发明优选地不采用所谓的开放读框(ORF)-探针作为阵列上的核酸分子。这些探针衍生自并且仅检测金黄色葡萄球菌菌株的特异基因的片段或gDNA片段。相反，本发明优选地采用消化的基因组DNA以获得双链gDNA片段，所述片段然后优选地被变性以作为单链随机gDNA探针，其可以在适于构建本发明的阵列的多个核酸分子中形成。在本发明的用于对金黄色葡萄球菌DNA进行分型的方法的另一优选的实施方案中，对现有技术方法的进一步改进通过提供衍生自各种不同金黄色葡萄球菌菌株的gDNA库的随机基因组DNA片段的阵列而实现。这具有这样的优点用一个单一实验或分析，可以建立测试生物体与一组具有限定的表型特征的参考生物体之间的关系。
本发明现在最终使得可以研究金黄色葡萄球菌中的多基因特征。本文描述的方法因此支持或允许掺入金黄色葡萄球菌表型特征的分类，例如测试生物体的抗生素抗性，而无论其遗传基础如何。因此，当将本发明方法用于对金黄色葡萄球菌进行分类并包括所述金黄色葡萄球菌菌株的至少一个临床相关参数(例如抗生素抗性或流行性)时，不仅基因型特征用于对菌株进行分类，而且该菌株的组合的基因型和表型特征也可用于对菌株进行分类，而无论这两者之间是否有因果关系。
不需要存在于阵列上的序列的详细知识。在本发明中，模式之间互相对比。
为了构建含有至少两种不同金黄色葡萄球菌菌株的基因组范围的代表性阵列，可以通过混和所述至少两种菌株的gDNA制备所述至少两种菌株的混和基因组文库。优选地，选择针对一个表型参数每一个菌株显示不同值的多个菌株，例如对广泛的抗生素有不同的抗性谱，优选地总体覆盖大多数类型的抗生素抗性。优选地，生物体在其分离的gDNA的琼脂糖凝胶分析中不含显著的质粒条带。然后，所述gDNA混和物可被片段化(例如通过超声剪切)，片段可在例如琼脂糖凝胶中分离。合适大小的DNA片段(优选约1-3kb)可随后被分离(例如通过从凝胶中切下并结合于固体载体如玻璃乳而分离)。合适数量的gDNA片段随机回收自所述gDNA混和物，因此数量可以是约1000至约10000，优选约1500至约5000，最优选约1800至约2400，更优选约1900至约2200个随机选择的基因组DNA片段。多个菌株的gDNA混和物的作用是在从其中分离DNA片段时，获得来自各种菌株的片段的随机库，其用于构建阵列。
随机选择的分离的片段优选地进一步倍增以提供合适的原料储备。所述片段的倍增例如可以通过实施例1所述的克隆和核酸扩增技术的组合而进行。双链gDNA片段随后可末端修饰以使它们固定在阵列表面上，例如通过进行PCR扩增反应修饰，其中一个引物或两个引物都含有经一C6接头与引物的5’末端偶联的游离NH2基团。
随机选择的、分离的、以及任选地扩增的gDNA片段然后可以被点印(spotting)在表面上以提供DNA微阵列。为了促进片段的偶联，所述阵列的表面(例如玻片，其表面可以是玻璃、金等)可以被改性(modified)。所述点印可以通过任何已知方法进行，例如通过使用ElectroSpray Ionization(ESI)微阵列印刷进行。点印片段后，可以封闭玻片表面以防止核酸的进一步附着，例如，在甲醛改性的玻片表面情况下用硼酸酐处理。
各个菌株的原始gDNA材料的一部分被用于提供可与阵列杂交的材料，即提供参考核酸。为了促进检测成功的杂交，将gDNA适当地标记，优选地荧光标记(例如使用CyTM标记[Amersham PharmaciaBiotech])。荧光标记试剂盒可商购自多个厂商。
样品核酸的平均大小对阵列上信号分布有作用。较大的样品分子包含更多的信息并因此更易于在更多个点中发现合适的杂交配体。降低样品核酸的平均大小可降低这一现象。另一方面，当样品核酸太小时，样品中的核酸片段含有太少遗传信息并且也在许多斑点中发现合适的杂交配体。样品核酸中片段的平均大小优选地在50至5000个核苷酸之间。更优选地，样品核酸中片段的平均大小包含约50至1000个核苷酸、更优选地约50至500个核苷酸的大小。
样品核酸优选地代表完整样品基因组。用阵列上的样品核酸获得的杂交模式与参考杂交模式对比。所述参考杂交模式可以人工产生，例如通过用参考样品的核酸组成的知识产生，所述核酸组成是例如基因组序列已知的金黄色葡萄球菌菌株的基因组序列。但是，在一个优选的实施方案中，所述参考杂交模式通过参考核酸与阵列杂交产生。样品杂交模式与参考的对比可至少被用于确定样品核酸是否与参考核酸相同或相似。当需要确定例如样品核酸是否含有特定的金黄色葡萄球菌菌株时这是有用的。在这一情况下，用该特定金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生参考杂交模式，并且当样品杂交模式基本上与参考杂交模式相同时，该样品被鉴定为含有该特定金黄色葡萄球菌菌株。在一个优选的实施方案中，本发明方法进一步包括对比样品杂交模式和至少一种另外的参考杂交模式。以此方式，所述样品可以与至少两种不同的参考核酸对比。当然，通过持续使用该阵列，越来越多的金黄色葡萄球菌杂交模式被产生，所有这些均可用于与样品核酸对比。因此，当用样品核酸产生一杂交模式时，这一杂交模式可以在随后实验中用作参考杂交模式。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括将杂交模式与至少2个、优选地至少5个、更优选地至少50个参考杂交模式对比。更优选地与至少100个、更优选地至少1000个参考杂交模式对比。
样品杂交模式和参考杂交模式可以是得自阵列的信号的一个亚集合。杂交模式可以由一个信号组成，优选地，所述杂交模式由与阵列杂交后获得的信号的20％组成。更优选地，所述杂交模式由来自阵列的信号的至少50％组成。在一个特别优选的实施方案中，所述杂交模式包括阵列信号的至少80％。
本发明的方法不仅可用于确定一个金黄色葡萄球菌样品核酸是否与一特定的金黄色葡萄球菌参考核酸相同。当样品杂交模式发生时，其可以与任何参考杂交模式不同。本发明的方法和阵列的一个特别有用的特征是在这种情况下本发明的方法可以提供有用的信息。与衍生或获得样品核酸的金黄色葡萄球菌菌株相关的表型特征通常是大量不同序列和/或基因相互影响的结果。在这些情况下，不可能基于得自一或多个点的信号对一特定样品进行分型。相反，非常多的不同点的信号需要被对比。本发明的方法和阵列特别适于对这一分析类型进行分型。为此参考杂交模式和样品杂交模式用统计学软件进行分析。在一个实施方案中，本发明方法进一步包括金黄色葡萄球菌参考杂交模式与由金黄色葡萄球菌样品核酸产生的杂交模式的无监督的多变量分析(例如主成分分析(Principal Component Analysis，PCA))。基于这一分析，杂交模式被赋予一个n维值(n代表2至分析中包括的数据点总数之间的一个值)，其可以被减少至其优选的2个主要成分。这些成分可在多维显像(multi-dimensional visualization)中显现，优选地在二维显像中显现。成分的维量值(dimensional value)可以相对分析中包括的所有杂交模式作图，其中杂交模式的优选的二维值的编组(grouping)或群集可被仔细观察。在一个优选的实施方案中，样品杂交模式的二维值与参考杂交模式的所有二维值进行对比。以此方式可以提供用于衍生或获得样品核酸的金黄色葡萄球菌菌株与所包括的参考相对比的相关性(relatedness)的统计学估计。
在一个优选的实施方案中，参考杂交模式的二维值被群集。这一群集优选地基于相关性进行。这一分型典型地与分类的误差幅度相关，所述误差幅度即样品核酸被错误地分类为与特定(集群)的参考菌株相关的概率。因此本发明的方法优选地进一步包括基于在集群中的存在与否对用于产生所述样品核酸的金黄色葡萄球菌的相关性进行分型。
术语“群集(clustering)”是指将具有相同或相似特征的事件(item)收集、组装或统一成一个或多个集群(cluster)的行为，“集群(cluster)”是指一组或一些聚集在一起的或紧密地在一起发生的相同或相似事件。“被群集的(clustered)”是指一个事件已被进行群集。本发明方法所用的群集方法可以用手、眼或任何已知的用于对比事件之间的特征、属性、性质、质量、作用等的相似性的(数学)方法通过来自可测量的参数的数据进行。可以使用统计学分析。
主成分分析(Principal component analysis，PCA)可以使用平均中心(mean centering)作为所选择的测量方法(scaling method)进行。用其它测量方法可以获得相当的结果。在一个优选的实施方案中，使用平均中心测量方法。主成分分析参考文献综述见Joliffe IT.1986.Principal Component Analysis.New YorkSpringer-Verlag。
本发明的一个特征是杂交模式用有关用于获得或衍生参考和/或样品核酸的金黄色葡萄球菌菌株的进一步信息扩展。例如，杂交模式可以用经不同于核酸杂交的方式确定的参数扩展。对于金黄色葡萄球菌菌株，通常重要的是知道菌株的抗生素抗性表型。这一抗性参数可以被加入到统计学分析中。这一参数的值(抗性或敏感，或进一步微调)可以被加入到杂交模式或杂交模式的统计学分析中。随后可基于这一附加参数进行群集。因此在本发明的一个优选的实施方案中，对于是参考杂交模式的来源的生物体确定至少一种不是基于核酸的参数。随后可使用统计学分析确定或估计作为样品核酸来源的金黄色葡萄球菌的这一参数的值。在这一实施方案中，本发明的方法进一步包括参考杂交模式与由样品核酸产生的杂交模式的偏最小二乘法判别分析(Partial Least Square-Discriminant Analysis，PLS-DA)，其中使用至少一个其值对于参考杂交模式是已知的的参数监督所述PLS-DA分析。
偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)偏最小二乘法(PLS)已经在文献中广泛描述(P.Geladi and B.R.Kowalski，Partial Least Squares RegressionA Tutorial，AnalyticaChimica Acta，185，1986，1-17.H.Martens and T.Naes，MultivariateCalibration，John Wiley&Sons，Chichester，1989.)。尽管主成分分析(PCA)模型具有描述性质，但是PLS模型具有预测性质。在PLS中，计算数值*加载对(loading pairs)(也称为潜变量(LV))不仅是为了在预测数据集(predicting data set)中使解释方差(explained variance)最大化，也是为了使待预测数据的协方差(covariance)最大化。PLS模型可通过方程(1)和方程(2)而数学概括。
X＝TPT+E(1)Y＝TBQT+F (2)矩阵X(也称为X-块(block))代表自变量的n*p矩阵(例如，n个色谱图，每个色谱图p保留时间)，Y(也称为Y-块)是含有因变量(例如浓度)的n*q矩阵；PT和QT是转置S*p和S*q矩阵，分别含有因变量和自变量加载(loadings)；T是S潜在值(latent scores)的n*S矩阵，B是S*S矩阵，代表X矩阵的值在Y-数据的值上的回归；E和F是n*p和n*q矩阵，分别含有自变量和因变量的残差。
提取A对潜变量后的验证标准误差(SEV)由方程(3)计算。
SEV=ΣI=1Ic(Yi,j-yi,j)2Ic---(3)]]>其中Lc是校准样品数目，yi，j是组分j在物体i中的浓度的真值；Yi，j是yi，j的PLS预测值；q是Y变量数目。只要SEV显著改善则持续提取LV。
所选择的LV数必须获得感兴趣的变量的最佳预测。但是，在方差和偏倚(bias)(或匹配(fit))之间有一个平衡(pay-off)一种太复杂的模型匹配良好，但是可能预测不好。这导致了最佳模型复杂度(optimalmodel complexity)这一概念获得匹配和方差之间的最佳平衡。这在图3中示出，其中模型的增加的复杂度能够匹配数据中更多的特征，但是估计的参数的方差升高并且总体结果在最佳模型复杂度中得到最小值。
X和Y之间的纯线性关系将产生通常具有2至5对LV的简单模型。复杂的非线性关系也可以被建模。但是，这需要取显著更多的LV以将Y与X相关联。
偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA)在PLS-DA中，类别(classes)(预先确定的组(predefined groups))被用作因变量。Y-块Y是n*类别数的矩阵。Y-块由0和1填充。
例子类别＝ Y=10010110]]>使用PLS中的依赖于每一样品所属类别的由0和1填充的Y-块将PLS转变成判别分析。
主成分判别分析(Principal Component-Discriminant Analysis，PC-DA)
如果兴趣集中于各样品组之间差异，施用判别分析(DA)[D.L.Massart，B.G.M.Vandeginste，L.M.C.Buydens，S.De Jong，P.J.Lewiand J.Smeyers-Verbeke，Handbook of Chemometrics and QualimetricsPart A，Elsevier，Amsterdam，1997；B.G.M.Vandeginste，D.L.Massart，L.M.C.Buydens，S.De Jong，P.J.Lewi and J.Smeyers-Verbeke，Handbook of Chemometrics and QualimetricsPart B，Elsevier，Amsterdam，1998]。该技术基于同组样品与其它组样品相比更相似这一假设。DA的目的是发现和鉴别原始数据的结构，其显示组平均值中的大的差异。这一方法涉及预先了解哪些样品是相似的。因此，DA被称为有监督的(supervised)分析技术。这使得其与其它无监督的技术如主成分分析(PCA)区分开来，后者不需要对样品的预先知识。
DA中的第一个步骤是将原始变量组合成一组相互独立的新变量，所述组合使得在由最小数目的这些新变量跨越的空间中原始样品的投影使组平均值之间的差异最大化。这一原则示于图4。测量两组样品的两个变量X1和X2。使用主成分(PC)最大方差标准，这些样品应被投影在由图4的线P所示的穿过样品的线上。为了区分不同样品集群，这不是一个最佳方案。但是样品在线D上的投影显示了两个集群之间的完全分离。计算出的因子被称判别子(discriminant)或D-轴。所有其它投影给出亚最佳方案。这在图4中通过对比样品在D线上的投影与在X1或X2轴上的投影而示出。
DA最有效地描述样品组之间的差异。但是，变量数相比于样品数经常是大的。这可能导致简并的方案。例如，三个样品可以总是被两个变量分开，而不论它们的相似性如何。如果包括更多的样品，这一简并作用会消失。通用经验法则是样品数应至少是变量数的4倍。这一法则可以导致例如核磁共振(NMR)谱检查中的问题。在天然产物分析中每NMR谱的峰(变量)数通常是几百个的量级。在正常情况下这意味着应当测量至少400-800个样品。在实践中这从未发生。基于这一点，不可能在天然产物的NMR谱上进行DA。但是这一问题有一个解决方案。Hoogerbrugge et al.[R.Hoogerbrugge，S.J.Willig andP.G.Kistemaker，Discriminant Analysis by Double Stage PrincipalComponent Analysis，Analytical Chemistry，55，1983，1710-1712.]开发了一个方案，其中变量数首先被在第一PC轴上的样品分值的PCA、随后被DA减少。这一技术被称为主成分判别分析(PC-DA)。确定所包括的PC的精确数目是困难的。数目应该不太小，因为仅包括前几个可导致许多组之间信息(between-group information)的丢失。数目也不应太大，因为这会超出样品数除以4的法则(number-of-samples-divided-by-four rule)。因此，看起来可推荐的是包括所有PC，其解释了高达样品数除以4这一最大值的显著量的方差(例如高于原始方差的1％)。如果由这些PC解释的方差总量非常低，则数目总是可以增加。但是，如果解释的方差非常低，则原始变量之间的相关性也低。结果，DA将产生与原始问题一样复杂的结果。
PLS-DA分析中所用的参数优选地是表型参数。术语“表型参数”用于本文是为了定义任何描述由金黄色葡萄球菌或其功能部分展现或表达的任何性质的参数。基于这一分析，杂交模式被被赋予一个n维值(n代表2至分析中包括的数据点总数之间的一个值)，其可以被减少至其(优选的2个)主要成分，以与在一个(优选为二维)显像中的表型参数最佳相关。这一优选的二维值可针对所有杂交模式作图，由此所述杂交模式的优选的二维值的分组或集群可被细察。在一个优选的实施方案中，所述样品杂交模式的二维值与参考杂交模式的所有二维值相对比。以此方式，可以提供对用于获得或衍生样品核酸的金黄色葡萄球菌菌株包含或不包含特定表型特征的概率的统计学估计。这当然需要这种表型特征对于用于获得或衍生参考核酸的金黄色葡萄球菌菌株是已知的。在一个优选的实施方案中，所述参考杂交模式的二维值基于有监督的PLS-DA分析被群集。
群集优选地基于表型特征进行，针对该表型特征，样品杂交模式被细察。群集优选地产生两个集群，其中一个集群具有特定的表型，而另一个没有。样品杂交模式可因此被容易地鉴别为具有或不具有该特定表型。这一分型典型地与分类的误差幅度相关，所述分类的误差幅度即样品核酸被错误地分类为具有或不具有该特定表型特征的概率。集群的边界可以被设定为容纳误差的较小或较大的统计学概率。因此本发明的方法优选地进一步包括基于在集群中的存在或不存在而对所述样品核酸进行分型。优选地，本发明的方法进一步包括基于在集群中的存在或不存在而对所述样品核酸进行分型。在一个优选的实施方案中，参数包括流行性。优选地，杂交模式基于其流行性表型即菌株在医院环境下传播至其它患者的潜力而被群集或分组。
参考杂交模式可产生自各种核酸。如上所述，参考杂交模式优选地产生自得自或衍生自天然金黄色葡萄球菌来源的核酸。优选地，通过得自或衍生自不同金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生至少5种、更优选至少50种参考杂交模式。在一个特别优选的实施方案中，基本上所有参考杂交模式均由金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生。以此方式可以对样品分型以检测其中存在所衍生的核酸或作为特定的某个或某些金黄色葡萄球菌菌株而包含相似的表型参数。这一特别优选的实施方案优选地与参考和样品杂交模式的统计学分析组合。以此方式可以确定样品中的金黄色葡萄球菌包含由一些但不是全部金黄色葡萄球菌菌株共有的特定表型特征的概率。金黄色葡萄球菌核酸可以衍生自RNA但优选地衍生自或得自金黄色葡萄球菌DNA，即衍生自基因组。因此在本发明的一个优选的实施方案中，所述多个核酸分子衍生自金黄色葡萄球菌DNA。
本发明方法的一个重要优点是无需首先在分类学上对菌株进行分类(例如鉴别)，然后由此属于所鉴别的菌株的临床相关参数可以被例如基于与已知参考菌株的数据列表对比而确定。因此，本发明的一个优点是无需确定物种就可以确定测试生物对特定抗生素的例如敏感性(或抗性)的存在，或任何其它临床相关参数。这通过如下事实实现这些信息现在可以在阵列的多个核酸分子“内”提供。
用于产生杂交模式的样品和/或参考核酸可含有其所衍生自或得自的金黄色葡萄球菌菌株的核酸的亚集合。但是，优选地不进行选择。在任何情况下，样品和参考核酸的选择优选地是相同或相似的。这使得可以容易地对比参考和样品杂交模式。
术语“得自或衍生自……的核酸”是指用于在阵列上杂交的核酸不一定是直接得自金黄色葡萄球菌来源的。在用于杂交之前，其可经历克隆、选择和其它操作。样品和参考核酸可例如得自克隆的文库如表达或基因组文库。或者，样品和参考核酸可以基于数据库中的核酸信息而从最开始产生，所述数据库例如是发展中的基因组学的努力的结果。但是优选地样品和参考核酸直接从天然金黄色葡萄球菌来源获得或通过从其扩增获得。优选地样品杂交模式从金黄色葡萄球菌菌株的单培养物起始产生。以此方式，保证了在阵列上仅有一个金黄色葡萄球菌被分析，同时产生的杂交模式是从一个金黄色葡萄球菌菌株产生的杂交模式。
在一个方面，本发明提供了一种阵列，其包含多个金黄色葡萄球菌核酸分子，其中所述核酸分子包含约200-5000个核苷酸的平均大小。本发明的阵列优选地包含至少500,000个核苷酸。优选地，所述阵列携带甚至更多的核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述阵列包含至少1百万个碱基(106个核苷酸)。优选地，它们包含至少2百万碱基。与传统阵列不同，每个点的碱基数是高的，即200-5000个核苷酸之间。优选地，所述多个核酸分子衍生自天然金黄色葡萄球菌来源。优选地，其中所述多个核酸分子衍生自金黄色葡萄球菌DNA。已发现不同的金黄色葡萄球菌菌株尽管属于相同物种，但是其携带的DNA的量和种类可以有很大的变化。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的阵列包含衍生自至少两种不同金黄色葡萄球菌菌株的多个核酸分子。优选地，阵列中的多个核酸分子至少包含金黄色葡萄球菌菌株基因组的代表(representation)。这优选地用衍生自至少另一种金黄色葡萄球菌菌株的核酸扩展。以此方式，所述阵列更代表金黄色葡萄球菌物种的完整遗传多样性。在一个特别优选的实施方案中，阵列包含衍生自至少三种不同金黄色葡萄球菌菌株的多个核酸分子。通过增加金黄色葡萄球菌菌株的数目以产生阵列中的多个核酸，阵列越来越模拟金黄色葡萄球菌物种的完整遗传潜力并因此分型变得越来越特异。因此在一个优选的实施方案中，阵列包含多个核酸分子，所述核酸分子包含金黄色葡萄球菌物种的基因组多样性的代表(representation)。这不意味着用携带数量少的不同金黄色葡萄球菌菌株的阵列进行分型不是一个有效的方法；它仅意味着预测和估计变得更精确和完整。
实施例通过全基因组阵列差异杂交数据的有监督的PLS-DA分析，基于流行性和非流行性金黄色葡萄球菌菌株之间的区别进行群集一组31种不同金黄色葡萄球菌菌株的荧光标记的基因组DNA(gDNA)分别与用随机选择的8种不同金黄色葡萄球菌菌株的混和物的gDNA片段包被的阵列杂交(约2100个片段/阵列，约1500bp/片段)。对荧光杂交模式进行定量产生对于每种测试菌株的每个基因组DNA片段的杂交信号列表。为了更特异，将每个阵列同时与2种标记的gDNA杂交一种涉及进行调查的特异金黄色葡萄球菌菌株(用Cy5标记)，另一种涉及用于制备阵列的8种金黄色葡萄球菌菌株的标准混和物，用作参考物以使在所有独立的玻片上进行的杂交归一化(用Cy3标记)。
不同细菌菌株的组一组19种多抗性金黄色葡萄球菌菌株用于实施例3(图5)。该组由19种医院分离株组成。对于所有菌株从日常医院实践中获得其流行性特征(图1)。所有用于产生这些菌株的微阵列结果的实验程序均参照实施例1的描述。
金黄色葡萄球菌菌株的生长和gDNA分离金黄色葡萄球菌分离株(经单菌落)生长在TSA琼脂平板和/或TSA培养基上(过夜，37℃)并作为甘油培养物储存(-80℃)。为分离gDNA，将平板生长的细菌(例如10-20个菌落的量)重悬于在2ml小瓶中的400μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)中。加入400μl水洗的0.1mm锆玻璃珠悬浮液(Biospec ProductsTM)而裂解细胞，在冰上预冷，在细胞破坏仪(minibeadbeater 8，Biospec ProductsTM)中中度振荡120秒，并在冰上冷却。离心后(5min，14krpm，4℃)，gDNA根据标准程序(Sambrook，1989)经用酚/氯仿/异戊醇提取(室温)、用氯仿/异戊醇提取(室温)、用乙醇/醋酸钠沉淀(-20℃，在4℃离心)、用70％乙醇(-20℃，4℃离心)洗涤、干燥(真空)、沉淀溶解于含有RNAseA(1-100μg/ml)的100μl TE缓冲液中、以及在0.6％琼脂糖溴化乙锭染色的凝胶中对gDNA的量进行半定量(例如1-5μl制备物/槽)而从澄清的裂解物中分离。
构建金黄色葡萄球菌gDNA阵列(玻片)为了制备含有金黄色葡萄球菌物种的基因组范围的代表的阵列，通过混和8种金黄色葡萄球菌菌株的gDNA制备该生物体混和的基因组文库(菌株选择见图3)。选择这样的菌株(a)对一广泛组的抗生素各显示一不同的抗性谱(总体上覆盖大多数类型的抗生素抗性)，和(b)在其分离的gDNA的琼脂糖凝胶分析中不含显著的质粒条带。gDNA混和物用超声剪切(Branson sonifier 450)并在0.8％琼脂糖凝胶中几条泳道中分离。切下DNA片段(约1-3kb)并经与玻璃乳(Biol01-kit)结合而分离。分离的片段用DNA-terminator End-repair试剂盒(Lucigen Corp.)预处理以促进有效(平端)克隆进细菌质粒中(pSmartHCkan vector，CloneSmart Blunt Cloning Kit，Lucigen)。部分连接混和物(1μl)经电穿孔(0，1cm-gap cuvets Eurogentec，BioRad Pulsor，25μF，200 ohms，1，6kV)转化至25μl E.coli细胞(E.kloni 10G supremeelectrocompetent cells，Lucigen)并在TB培养基中再生并铺板在含有30μg/ml卡那霉素的TY平板上，在37℃过夜生长。用牙签将菌落转移至96孔微滴板(32个板，150μl/孔含30μg/ml卡那霉素的TY培养基)。37℃过夜生长后，加入甘油(终浓度15％)并将甘油原液储存在-80℃。
来自孔板中每一克隆的基因组插入物通过PCR扩增在96孔PCR平板中倍增(22个平板)。PCR反应含有50μl反应混和物/孔，其含有1x SuperTaq缓冲液，0.2mM每种dNTP(Roche Diagnostics)，0.4M引物L1(5′-cag tcc agt tac gct gga gtc-3′)和0.4M引物R1(5′-ctt tct gct atggag gtc agg tat g-3′)，1.5U SuperTaq-DNA-聚合酶和1μl来自gDNA库相应孔的甘油原液。两种引物均含有游离的NH2-基团，其经C6接头与引物的5’末端偶联。使用下述PCR程序4min 94℃，30x(30sec94℃，30sec 50℃，3min 72℃)，10min 72℃和浸在4℃。扩增后，将50μl PCR产物转移至96孔圆底板并通过加入150μl NaAc/异丙醇混和物(每一个0.2M NaAc，67％异丙醇终浓度)沉淀，在-80℃温育1小时，离心(1hr，2.5krpm，4℃)，除去上清并用100μl 70％乙醇洗涤。DNA沉淀重悬于50μl水/孔中，转移至384孔平板，干燥(speed vac)并重悬于10μl 3xSSC-缓冲液/孔。6个所得的384孔平板含有约2100个PCR产物，被用于点印微阵列。用ESI微阵列printer组合24TeleChem Stealth micro spotting quill-pins(约100μm直径)将PCR产物点在一系列最多75个“醛”包被玻片(Cell Associates)上。点印后，玻片表面通过在室温用硼酸酐处理而封闭2x5min于0.2％SDS中，2x5min于水中，10min于硼酸酐缓冲液中(1.7g NaBH4于510ml PBS缓冲液和170ml100％乙醇中)，3x5min于0.2％SDS中，3x5min于水中，2sec于100℃水中，用N2流干燥。PBS(磷酸盐缓冲盐水)是6.75mM Na2HPO4，1.5mM K2HPO4，140mM NaCl，和2.7mM KCl pH7.0.(1.2g Na2HPO4，0.2g K2HPO4，8.0g NaCl，0.2g KCl/升，pH7.0)。
gDNA标记gDNA的荧光标记在基于BioPrimeRDNA Labeling System(Invitrogen，Cat.No.18094-011)的25μl反应中在0.5-2μg分离的金黄色葡萄球菌gDNA上在37℃进行1.5小时。反应含有(终浓度)1xRandomPrimer溶液(50mM Tris-HCl PH 6.8，5mM MgCl2，30μg/ml随机八聚物，BioprimeR)，1x lowT dNTP-混和物(0.25mM dATP，0.25mMdGTP，0.25mM dCTP，0.1mM dTTP)，0.06mM Cy-dUTP(Cy＝Cy5或Cy3，1μl 1mM原液，Amersham Biosciences)和20单位DNA-聚合酶(Klenow片段；0.5μl 40U/μl原液，BioprimeR)。反应后，通过在AutoseqG50柱(Amersham Biosciences)上纯化除去盐、未掺入的(标记的)核苷酸和引物。纯化后，1/10部分的标记材料用于分光光度分析以确定DNA(A260nm)和Cy5(A649nm)或Cy5(A550nm)的量。剩余的标记材料用于阵列杂交。
阵列的(预)杂交在杂交准备中，将玻片置于Petri皿中的20ml预杂交溶液(1％BSA，，5xSSC，0.1％SDS，经0.45μm滤器过滤，42℃)中并在42℃轻摇(温和旋转)45分钟。接着玻片在40ml水中洗2次(在40ml加盖试管中)并用N2枪迅速干燥。
用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记的合适的gDNA样品与4μl酵母tRNA(25μg/μl)组合，干燥(用SpeedVac)，重溶于40μl EasyHyb溶液(Roche Applied Science)，变性(1.5min，95℃)，短暂旋转沉淀(1sec，10krpm)，置于预保温(42℃金属板)的干的预杂交阵列上，用塑料纸覆盖(Hybrislip，Molecular Probes)，插入到水蒸气饱和的预加热的(42℃)杂交室(Corning)中并在42℃水浴中杂交过夜。对于每一杂交，来自测试菌株的gDNA用Cy5-dUTP标记，而参考库(来自用于阵列构建的菌株的gDNA混和物)用Cy3-dUTP标记。杂交后，通过在加盖的40ml试管中的40ml(不同)缓冲液中摇动玻片4次而洗涤阵列(洗涤缓冲液11x SSC，0.2％SDS，37℃，5-10sec；洗涤缓冲液20.5x SSC，37℃，5-10sec；洗涤缓冲液3和40.2x SSC，20℃，各10min)。
扫描和图像分析洗涤后，玻片储存在黑暗中(以防止Cy荧光衰减)或直接用于用扫描装置(来自PerkinElmer的ScanArray 4000，带有来自PackardBioscience的Scanalyse软件)扫描荧光Cy染料。进行快速扫描(分辨率30μm/像素)以选择最佳激光(强度)和检测(光电倍增管)设置以防止低信号或饱和信号的过量。玻片被扫描两次针对Cy5和Cy3荧光。用ImaGene软件(BioDiscoveryInc.，version 4.2)量化数字扫描图，产生针对阵列上每一点的点身份(spot identity)以及针对Cy5和Cy3的信号(S)和背景(B)值。数据储存在电子文件中并用于进一步数据加工。
数据预加工通过使用空白表格软件(Excel，Microsoft)对于每一点进行下列运算Cy3和Cy5的S-B值、Cy5/Cy3比率[R＝Cy5(S-B)]/[(Cy3(S-B)]。去除低质量数据(例如具有S＜2B的Cy3数据的点)。然后，对于每一玻片，基于玻片上的所有点的平均Cy5-和Cy3-信号计算归一化因数N(N＝[平均Cy5(S-B)]/[平均Cy3(S-B)]。接着，对于在所有阵列上的每一点计算归一化比率(Rn)(Rn＝R/N)。许多玻片(与金黄色葡萄球菌菌株相关的玻片)的每一点的归一化比率的矩阵(＝数据集)被用于进一步数据预加工。
由于Cy3信号通常存在于大多数点(8个菌株的Cy3标记的参考gDNA库与所有玻片杂交)，并且Cy5信号可以变化(不同菌株的Cy5标记的gDNA各自与单个玻片杂交)，所以如果一个gDNA片段分别存在或不存在于Cy5测试的菌株中，则Cy5/Cy3比率在理论上可以有两个值。但是在实践中，这些值围绕1和0变化。因此，在许多分析中在进一步分析之前对比率数据集施加0和1的截断值(例如Rn＜0.5和Rn＞0.5分别由0和1代替，或者Rn＜0.3和Rn＞0.7分别由0和1代替，同时保持Rn值在0.3和0.5之间)。这些“截断值数据集”用于最终数据分析。
结果一组19种不同的金黄色葡萄球菌分离株被加工以用于来自在全基因组微阵列上的差异杂交的数据的PLS-DA分析(图2)。
所述PLS-DA分析根据其已知的流行性特征产生金黄色葡萄球菌菌株的显著群集(图2，E＝流行性，N＝非流行性)。
这表明总差异杂交数据集的一部分含有可用于预测未知金黄色葡萄球菌菌株的流行性的信息。
权利要求
1.一种对衍生自或得自金黄色葡萄球菌菌株的样品核酸进行分型的方法，包括-提供包含多个核酸分子的阵列，其中所述多个核酸分子衍生自第一组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株；-通过将所述阵列与得自或衍生自第二组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株的至少两种不同参考核酸进行杂交而提供至少两种不同的参考杂交模式，其中所述第二组中的所述金黄色葡萄球菌菌株基于至少一个表型参数的值可分成至少两组；-通过无监督的多变量分析群集参考杂交模式而产生参考杂交模式的至少两种不同的集群；-将与用于制备参考杂交模式的阵列相同的阵列与样品核酸杂交以获得样品杂交模式；以及-将所述样品杂交模式归于所述参考杂交模式的至少两种不同的集群中的一种。
2.权利要求1的方法，其中所述样品核酸中的片段的平均大小在约50至5000个核苷酸之间。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多个核酸分子的平均大小在约200至5000个核苷酸之间。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述阵列包括随机选自所述至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株的片段化的基因组DNA的片段的约1500至5000个核酸分子。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述样品核酸衍生自金黄色葡萄球菌的纯培养物。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述多个核酸分子衍生自至少3种、优选地至少5种、更优选地至少8种不同的金黄色葡萄球菌菌株。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述方法包括将样品杂交模式与包含至少3种、更优选地至少5种、更优选地至少50种不同参考杂交模式的参考杂交模式集群相对比。
8.前述任一项权利要求的方法，其中所述表型参数是所述菌株的流行性。
9.权利要求7或8的方法，其中所述对比包括参考杂交模式和样品杂交模式的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，其中至少一个其值对于参考杂交模式是已知的(并且其信息用于有监督的PLS-DA分析)的表型参数被针对样品核酸或其衍生来源而额外确定或估计。
10.权利要求9的方法，进一步包括基于有监督的PLS-DA分析对杂交模式进行群集。
11.前述任一项权利要求的方法，其中基本上所有参考杂交模式由金黄色葡萄球菌菌株的核酸产生。
12.前述任一项权利要求的方法，其中所述分型包括确定衍生所述样品核酸的金黄色葡萄球菌是否是流行株。
13.前述任一项权利要求的方法，其中所述第二组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株包含来自所述第一组的菌株。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-13任一项定义的阵列与权利要求1-13任一项定义的至少两种不同的参考杂交模式或参考核酸的组合。
全文摘要
一种对衍生自或得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株的样品核酸进行分型(typing)的方法，包括提供包含多个核酸分子的阵列，其中所述多个核酸分子衍生自第一组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株，通过将所述阵列与得自或衍生自第二组的至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株的至少两种不同参考核酸进行杂交而提供至少两种不同的参考杂交模式，其中所述第二组中的所述金黄色葡萄球菌菌株基于至少一个表型参数的值而可分成至少两组，通过无监督的多变量分析(unsupervised multivariate analysis)群集(clustering)参考杂交模式而产生参考杂交模式的至少两种不同的集群(cluster)，将与用于制备参考杂交模式的阵列相同的阵列与样品核酸杂交以获得样品杂交模式，以及将所述样品杂交模式归于(assign)所述参考杂交模式至少两种不同的集群中的一种。
文档编号G06F19/20GK101018872SQ200580021593
公开日2007年8月15日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者弗兰克·亨利·约翰·许伦, 扬·费尔霍夫, 罗伊·克里斯蒂安·蒙泰因 申请人:荷兰应用科学研究会(Tno), Umc乌得勒支控股有限公司