一种生物菌剂及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种生物菌剂，所述菌剂包括重量百分比为5～10％的PGPR菌液，所述菌剂中含有PGPR活菌量不少于1×1010CFU/ml。所述菌剂能够制成生物发酵菌肥和种衣剂，本发明的生物菌剂，不仅对于黄瓜枯萎病等真菌病害及黄瓜细菌性茎软腐病等细菌病害具有良好的防效，还可以改善连作条件下蔬菜的生长环境，增强蔬菜对土壤中难溶性磷的吸收和利用。从而有助于实现蔬菜的高产、安全、无公害生产。
【专利说明】
一种生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及到微生物菌剂，具体涉及主要成分是PGPR的生物 菌剂，并且还涉及生物菌剂包括生物发酵菌肥和种衣剂的制备方法，还涉及到生物菌剂的 应用。
【背景技术】
[0002] 随着设施连作年限的增加，连作障碍日趋严重，土传病原菌不断积累，并出现了土 壤次生盐渍化，养分失衡，重金属污染，土壤微生态环境恶化等诸多问题，已严重影响了蔬 菜的产量和品质，连作障碍已成为制约蔬菜生产可持续发展的重要因素，因此创造有利于 蔬菜生长的土壤环境已成为一个亟待解决的问题。
[0003] 乙烯是植物体内五大内源激素之一，在较低的浓度下表现出明显的生理作用，即 抑制茎的伸长生长、促进茎或根的增粗和使茎横向生长三重反应。植物一生大部分生长发 育阶段需要乙烯的浓度比较低，一般植物组织中乙烯含量不超过O.llpmol，只有在快要成 熟和衰老阶段才合成大量的乙烯。但是在土壤盐渍化、重金属超标、干旱及病原菌侵染条件 下，植物体内乙稀合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)大量合成乙稀，持续大量合成的乙 烯可以抑制根系伸长，阻碍根系生长。
[0004] PGPR是根际周围土壤中的一群自生细菌，可以通过产生ACC脱氨酶将乙烯合成的 直接前体ACC降解为α-丁酮酸和氨，以促进植物根的伸长，来吸取更多的营养物质、水分等。 Mayak等检测无色杆菌对番茄根系的促生作用，结果显示接种无色杆菌的番茄根系在盐浓 度为120mM时伸长了32.8_，而未接种的为27.4mm，由此可见，ACC活性菌在高盐环境条件下 能促进植物的生长。滕松山等从盐生植物碱蓬内分离到的ACC脱氨酶活性内生细菌SS12对 萝卜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用。刘维红等采用富集筛选法，以ACC为唯一氮源 从不同蔬菜植株根围中采集土样，筛选出46株ACC脱氨酶活性细菌，其中XG32菌株对番茄有 明显的促生作用，对辣椒疫霉等植物病原体有一定的抑制作用。
[0005] 黄瓜枯萎病是黄瓜种植过程中发生的一种常见土传病害，多在开花结果后陆续发 病，被害株最初表现为部分叶片或植株的一侧叶片中午萎蔫下垂，似缺水状，早晚可以恢 复，以后萎蔫叶片不断增多，逐渐遍及全株，早晚不能复原，并很快枯死;黄瓜炭疽病近年来 发生不断趋重，是由引进的种子带菌所造成的，春秋两季均有发生，防治难度较大，对生产 影响巨大。黄瓜细菌性茎软腐病是近两年黄瓜生产上新发现的严重细菌性病害，目前市场 上的防治细菌病害的化学杀菌剂和农用抗生素对该病害的防治效果均不理想，亟待开发防 治该种病害的药剂。
【发明内容】
[0006] 针对现状，本发明提供了一种生物菌剂，该生物菌剂主要成分是PGPR，能够有效的 防治黄瓜枯萎病、黄瓜炭疽病、黄瓜细菌性角斑病和黄瓜细菌性茎软腐病。
[0007] 本发明还提供了该生物菌剂的制备方法，通过制成生物发酵菌肥和种衣剂来有效 的防治黄瓜枯萎病、黄瓜炭疽病、黄瓜细菌性角斑病和黄瓜细菌性茎软腐病。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 一种生物菌剂，所述菌剂包括重量百分比为5~10%的PGPR菌液，所述菌剂中含有 PGPR活菌量不少于1 X 101QCFU/ml。
[0010]优选地，所述PGPR为嗜麦芽寡养单胞菌菌液。
[0011] 其中，所述菌剂可以制成生物发酵菌肥，所述菌剂由以下重量份的成分组成:PGPR 菌液5~10份、食用菌菌糠50~70份、黄粉虫虫粪5~25份、黄腐酸1~5份、FeS〇4 · 7H20 0.01 ~0.02份和ZnS〇4〇. 01~0.03份，其中，所述食用菌菌糠可以用草炭或生物炭代替；
[0012] 上述生物菌剂(生物发酵菌肥)的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0014] (2)采集海边盐渍植物的根际土壤，称取lg根际土放入含50ml PAF培养液的三角 瓶中，25°C或30°C、振荡速度为200r/min的条件下振荡培养24h，富集培养4d后，再转移lml 菌悬液至50ml ADF培养液中，继续25°C或30°C、振荡速度为200r/min条件下振荡培养48h， 用于含ACC脱氨酶活性细菌的分离纯化，梯度稀释ADF培养液中菌悬液，涂布于ADF固体平板 上，在温度为28 °C的恒温箱中培养72h，划线分离，纯化后-80 °C保存；
[0015] (3)将纯化鉴定后的PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，温度为28~30°C，振荡速 度为200r/min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分别加入黄粉虫虫粪、黄腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且将含水量调成60 %后用塑料薄膜覆盖进行发酵直到黄粉虫虫粪完全腐熟，用搅拌机搅 拌均匀，装袋，即得生物发酵菌肥。
[0016]所述生物菌剂还可以制成种衣剂，所述菌剂由以下重量份的成分组成:PGPR菌液 50~100份、营养载体6~14份、娃藻土600~800份、羧甲基纤维素钠10~20份、木质素磺酸 钠60~80份、聚乙烯醇10~20份、FeS〇4 · 7H20 1~2份和ZnS〇4 · 7H20 1~3份，所述营养载 体由腐殖酸1~2份、谷氨酸2~5份和玉米粉3~7份组成，所述菌即中含有PGPR活菌量为1~ 2X10 10CFU/ml〇
[0017]上述生物菌剂(种衣剂)的制备方法，包括如下步骤：
[0018] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0019] (2)将PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，在温度为28~30°C、振荡速度为200r/ min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上、菌量为1~2 X 101()CFU/ml时，用所 述营养载体和灭菌后的硅藻土进行吸附，然后分别加入所述羧甲基纤维素钠粘着剂、木质 素磺酸钠分散剂、聚乙烯醇成膜剂、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均匀后即得种衣剂。
[0020] 所述种衣剂在使用时与种子混合搅拌均匀，使种衣剂均匀包裹在种子表面，完成 种衣剂对种子的丸化包衣处理，所述种衣剂与种子的重量比为1:10。
[0021] 所述生物菌剂用于防治黄瓜枯萎病、黄瓜炭疽病、黄瓜细菌性角斑病和/或黄瓜细 菌性茎软腐病。经过试验发现该菌株发酵液对黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜细菌性角 斑病均具有较好的防治效果，制成的种衣剂在田间防治效果试验中，对黄瓜细菌性茎软腐 的防治效果为62.67 %。
[0022] 本发明的有益效果是:本发明的生物菌剂，不仅对于黄瓜枯萎病等真菌病害及黄 瓜细菌性茎软腐病等细菌病害具有良好的防效，还可以改善连作条件下蔬菜的生长环境， 增强蔬菜对土壤中难溶性磷的吸收和利用。从而有助于实现蔬菜的高产、安全、无公害生 产。
【附图说明】
[0023]图1是本发明PGPR革兰氏染色效果图；
[0024] 图2是引物27f/1492r扩增的细菌16SrDNA图谱；
[0025] 图3是不同菌肥对黄瓜枯萎病防治效果对比图；
[0026] 图4不同药物对黄瓜细菌性茎软腐病防治效果对比图。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更 透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0030] 如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"或"包括"为一开放式用语，故应 解释成"包含但不限定于"。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃 以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权 利要求所界定者为准。
[0031] 实施例1
[0032] -种生物菌剂（生物发酵菌肥），所述菌剂由以下重量份的成分组成：PGPR菌液5 份、食用菌菌糠70份、黄粉虫虫粪22份、黄腐酸2.96份^504*7出0 0.01份和21^040.03份， 所述嗜麦芽寡养单胞菌菌液含有活菌量不少于l〇1()CFU/ml。
[0033] 上述生物菌剂(生物发酵菌肥)的制备方法，包括如下步骤：
[0034] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0035] (2)采集海边盐渍植物芦苇、艾蒿、苍耳或碱蓬的根际土壤，称取lg根际土放入含 50mlPAF培养液的三角瓶中，25°C、振荡速度为200r/min的条件下振荡培养24h，富集培养4d 后，再转移lml菌悬液至50ml ADF培养液中，继续25°C、振荡速度为200r/min条件下振荡培 养48h，用于含ACC脱氨酶活性细菌的分离纯化，梯度稀释ADF培养液中菌悬液，涂布于ADF固 体平板上，在温度为28°C的恒温箱中培养72h，划线分离，纯化后-80°C保存；
[0036] (3)将纯化鉴定后的PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，温度为28~30°C，振荡速 度为200r/min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分别加入黄粉虫虫粪、黄腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且将含水量调成60 %后用塑料薄膜覆盖进行发酵直到黄粉虫虫粪完全腐熟，用搅拌机搅 拌均匀，装袋，即得生物发酵菌肥。
[0037] 实施例2
[0038] 一种生物菌剂(生物发酵菌肥），所述菌剂包括重量百分比为8 %的PGPR菌液。所述 PGPR菌液为嗜麦芽寡养单胞菌菌液。所述菌剂由以下重量份的成分组成:嗜麦芽寡养单胞 菌菌液8份、草炭67份、黄粉虫虫粪20份、黄腐酸4.97份、？6304?7出0 0.02份和2113040.01 份，所述嗜麦芽寡养单胞菌菌液含有活菌量不少于l〇1()CFU/ml。
[0039] 上述生物菌剂(生物发酵菌肥)的制备方法，包括如下步骤：
[0040] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为:蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0041] (2)采集海边盐渍植物芦苇、艾蒿、苍耳或碱蓬的根际土壤，称取lg根际土放入含 50mlPAF培养液的三角瓶中，30°C、振荡速度为200r/min的条件下振荡培养24h，富集培养4d 后，再转移lml菌悬液至50ml ADF培养液中，继续30°C、振荡速度为200r/min条件下振荡培 养48h，用于含ACC脱氨酶活性细菌的分离纯化，梯度稀释ADF培养液中菌悬液，涂布于ADF固 体平板上，在温度为28°C的恒温箱中培养72h，划线分离，纯化后-80°C保存；
[0042] (3)将纯化鉴定后的PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，温度为28~30°C，振荡速 度为200r/min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分别加入黄粉虫虫粪、黄腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且将含水量调成60 %后用塑料薄膜覆盖进行发酵直到黄粉虫虫粪完全腐熟，用搅拌机搅 拌均匀，装袋，即得生物发酵菌肥。
[0043] 实施例3
[0044] -种生物菌剂(种衣剂），所述菌剂由以下重量份的成分组成:PGPR菌液61份、营养 载体14份、硅藻土800份、羧甲基纤维素钠20份、木质素磺酸钠80份、聚乙烯醇20份、FeS04· 7H20 2份和ZnS〇4?7H20 3份，所述营养载体由腐殖酸2份、谷氨酸5份和玉米粉7份组成。
[0045]上述生物菌剂(种衣剂)的制备方法，包括如下步骤：
[0046] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为:蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0047] (2)将PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，在温度为28~30°C、振荡速度为200r/ min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上、菌量为1~2 X 101()CFU/ml时，用所 述营养载体和灭菌后的硅藻土进行吸附，然后分别加入所述羧甲基纤维素钠粘着剂、木质 素磺酸钠分散剂、聚乙烯醇成膜剂、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均匀后即得种衣剂。
[0048] 所述种衣剂在使用时与种子混合搅拌均匀，使种衣剂均匀包裹在种子表面，完成 种衣剂对种子的丸化包衣处理，所述种衣剂与种子的重量比为1:10。
[0049] 实施例4
[0050] -种生物菌剂(种衣剂），所述菌剂由以下重量份的成分组成：嗜麦芽寡养单胞菌 菌液100份、营养载体10份、硅藻土787份、羧甲基纤维素钠15份、木质素磺酸钠70份、聚乙烯 醇15份、FeS〇4 · 7H20 1份和ZnS〇4 · 7H20 2份，所述营养载体由腐殖酸2份、谷氨酸3份和玉 米粉5份组成。
[0051 ]上述生物菌剂(种衣剂)的制备方法，包括如下步骤：
[0052] (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培养液配方 为:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值为7.2; 所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值为7.5;
[0053] (2)将嗜麦芽寡养单胞菌菌株接种于TSB液体培养基中，在温度为28~30°C、振荡 速度为200r/min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液0D值达到0.8以上、菌量为1~2X 101()CFU/ml时，用所述营养载体和灭菌后的硅藻土进行吸附，然后分别加入所述羧甲基纤维 素钠粘着剂、木质素磺酸钠分散剂、聚乙烯醇成膜剂、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均匀 后即得种衣剂。所述种衣剂在使用时与种子混合搅拌均匀，使种衣剂均匀包裹在种子表面， 完成种衣剂对种子的丸化包衣处理，所述种衣剂与种子的重量比为1:10。
[0054]为了证明本发明的有效性，
【申请人】进行了如下试验：
[0055] 一、PGPR菌的分离、纯化和鉴定
[0056]含ACC脱氨酶活性PGPR的富集培养:采集海边盐渍植物芦苇、艾蒿、苍耳或碱蓬的 根际土壤，称取lg根际土于含50ml PAF培养液的250ml三角瓶中，25°C或30°C、200r/min振 荡培养24h。第2d，转移1 ml菌悬液至另一50mlPAF培养液中，同等条件下培养24h。第3d，从 PAF培养液中转移lml菌悬液至50ml DF培养液中，相同条件下培养24h。第4d，再转移lml菌 悬液至50mlADF培养液中，相同条件下培养48h，用于含ACC脱氨酶活性细菌的分离纯化。梯 度稀释（10-3-ΚΓ 7次方稀释)ADF培养液中菌悬液，涂布于ADF固体平板，28 °C恒温箱中培养 72h，划线分离，纯化后-80°C保存。
[0057]将纯化的菌株按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999)和中科院 微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978)等介绍的方法进行形态学特征和生理生化 特征的测定。菌株菌体杆状，（0.3~0.5)μηιΧ (1.3~1.5)μηι，革兰氏染色呈阴性，无荚膜，无 芽孢，有运动能力，数根鞭毛;菌落呈圆形，淡绿色，表面光滑、湿润、隆起(如图1所示）。 [0058]采用细菌提取试剂盒（天根生物科技有限公司）提取细菌基因组DNA，以DNA为模 板，用通用引物27付卩14921对16510嫩序列扩增。？〇?反应体系为?代11^12.5以1^，1(^111〇1^· L一1引物各lyL，模板DNA lyL，以ddH20补足至25μΙ^ΡΟ?反应条件：94°C预变性5min;94°C变性 30s;55°C退火lmin;72°C延伸2min;35个循环，72°C后延伸lOmin。扩增产物经1%琼脂糖凝 胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序(如图2所示）。将测序结果进行拼接后，取一完 整序列在GenBank上进行序列比对，参考相似度、同源性最高的菌株对目标菌株进行分类鉴 定。经过比对，本发明的菌株与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)相似度 为100%，可以确定为嗜麦芽寡养单胞菌。
[0059]二、PGPR菌株产生ACC脱氨酶活性测定
[0060]将纯化后的各菌株接种于TSB液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养24h，4°C， 5000rpm离心10min收集菌体，弃上清，用DF液体培养基洗涤离心两次。将菌体重悬浮于ADF 液体培养基，28°C，200r/min培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶。参照Honma和Saleh方法测定 八(^脱氨酶活性。经测定嗜麦芽寡养单胞菌(3丨61101：1'0卩1101]101^3 11^11：0卩11；[1丨3)的4(^脱氨酶 活性在56~324nmol a-丁酮酸/mg/h之间，其中本发明制得的菌株ACC脱氨酶活性最高，为 324nmol a_丁酬酸/mg/h0 [0061 ] 三、PGPR耐盐性测定
[0062]在LB培养基中，分别加入2%、5%、7%不同浓度的似(：1，取培养2411的幼龄菌种液 接种，28°C培养3d和7d，与未接种的对照管相比，目测生长情况，如生长则为阳性。结果表明 本发明菌株在含盐量为2%、5%、7%的LB培养基中均能生长。
[0063]四、PGPR对病原菌的生物活性测定
[0064] 通过牛津杯法测定不同PGPR发酵液对黄瓜细菌性角斑病菌、黄瓜细菌性茎软腐病 菌2种病原细菌和黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌2种病原真菌的抑菌活性。将活化后的病菌 和不同的PGPR分别接种于NB液体培养基中，于28 °C、126rpm条件下振荡培养24~36h，然后 利用紫外可见分光光度计(波长650nm)测量吸光度值后，调整细菌悬液的0D 65Q为0.8，浓度 约109cfu/ml。吸取100yL病原细菌悬浮液于NA平板表面，用涂布器涂匀，在每个平板上放置 3个牛津杯，往其中加入100yL的供试PGPR发酵液，每个处理重复3次，以加入3 %中生菌素可 湿性粉剂600倍液和空白培养基为对照，28 °C恒温培养箱中培养，48~72h后测量抑菌圈直 径。
[0065]真菌用打孔器(d = 0.6mm)在培养3d的菌落上打菌饼接种于PDA平板中央。有菌丝 的一面朝下，培养24h后，在培养皿的上下左右距离中心30mm处以十字交叉均匀旋转4个牛 津杯，注入芽PGPR发酵液50yL，28 °C恒温培养箱中培养。待对照菌落菌丝即将布满整个平板 时，测量菌落的直径，按下面公式计算抑菌率(刘永峰等，2007)。
[0067]从表1和表2中可以看出，部分菌株如CRG-2菌株的发酵液对黄瓜枯萎病菌的抑菌 率为85.96 %，对黄瓜炭疽病菌的抑菌率为60.24% ; JPG-4对黄瓜炭疽病菌的抑菌率为 60.24% ; AHG-6、LWG-2对黄瓜枯萎病菌的抑菌率为85.96% ; CRG-8对黄瓜细菌性角斑病菌 和黄瓜细菌性茎软腐病菌的抑菌圈直径分别为47 · 00mm和46 · 67mm; LWG-5对黄瓜细菌性角 斑病菌的抑菌圈直径为20mm;CRG-2对黄瓜细菌性角斑病菌的抑菌圈直径为15.33mm;AHG-5 对黄瓜细菌性茎软腐病菌的抑菌圈直径为48.33mm;CRG-2对黄瓜细菌性茎软腐病菌的抑菌 圈直径为48.33_。可见所分离出来的菌株对病原真菌具有一定的抑制作用。
[0068] 表1 PGPR对病原真菌的抑菌效果
[0071] 注:表中AHG-1~AHG-6是从艾蒿根际土壤中分离出来的PGPR菌株，LWG-1~LWG-6 是从芦苇根际土壤中分离出来的PGPR菌株，CRG-1~CRG-5和CRG-8是从苍耳根际土壤中分 离出来的PGPR菌株，JPG-4、JPG-10、JPG-11是从碱蓬根际土壤中分离出来的PGPR菌株。下 同。
[0072] 表2 PGPR对病原细菌的抑菌效果
[0074] 五、PGPR产生吲哚乙酸（IAA)的能力
[0075]参照Brie (1991)方法，将LB培养基分装于试管中灭菌后，加入无菌色氨酸溶液 lml，接入24h培养菌液0. lml，培养12h后，吸取2ml菌液加入4ml的显色液，观察颜色变化，确 定PGPR产生IAA能力。最终鉴定结果是确定该菌株产生吲哚乙酸（IAA)。
[0076]六、生物发酵菌肥的使用
[0077]将本发明的生物发酵菌肥与育苗基质按不同比例施用后，测定黄瓜幼苗生长性状 (见表3)。人工接种尖孢镰刀菌黄瓜专化型，调查发病率，计算病情指数及测定菌肥对黄瓜 枯萎病的防治效果。
[0078]黄瓜枯萎病分级标准：
[0079] 0级地上、地下部均无症状；
[0080] 1级子叶萎蔫或真叶轻微萎蔫，须根10%以下变褐；
[0081 ] 2级子叶较重萎蔫，主根变褐或须根10 %~50 %变褐；
[0082] 3级子叶及真叶均萎蔫，主根1/2变褐；
[0083] 4级主根大部分变褐及地上部萎蔫或枯死。
[0086] 表3菌肥对黄瓜幼苗生长性状的影响
[0087]
[0088]
[0089]从表3可以看出，在菌肥与育苗基质按不同比例混合后，均能促进黄瓜幼苗生长， 提高壮苗指数。黄瓜株高在菌肥与基质的比例为7:3时最高，为61.6cm;黄瓜茎粗在以9:1时 最粗，为0.65cm，和对照相比差异不显著，与1:9中茎粗差异极显著，为0.48cm，与3:7、4:6和 2:8差异显著;黄瓜根长在比例为9:1时最长，为32.25cm，与其他处理的根长差异达到极显 著水平，与5:5和6:4根长差异显著;黄瓜叶片数在比例为6:4时最多，为6个，与对照2、9:1、 3:7、2:8和1:9中叶片数差异极显著，与对照1和8:2叶片数差异显著;黄瓜须根数在1:9时最 多，为28个，与对照2、5:5、6 :4、8:2、3:7、4:6和7:3中须根数差异极显著，与2:8须根数差异 显著;黄瓜第二片叶叶面积在复合基质与土的比例为9:1时最大，为180.28cm 2,与其他比例 的育苗基质相比叶面积差异性均达到极显著水平;黄瓜第三片叶叶面积的比例为6:4时最 大，为179.37cm 2,与其他比例的复合基质叶面积差异性均到达极显著水平。综合壮苗指数 来看，菌肥与育苗基质的比例为9:1时壮苗指数最大，最适合黄瓜幼苗的生长。
[0090] 不同菌肥对黄瓜枯萎病的防治效果进行对比，结果见表4和图3,从表4可以看出， 本发明菌肥、芽孢杆菌菌肥、粘帚霉菌肥和木霉菌肥对黄瓜枯萎病的防治效果分别为 70.24%、53.57%、64.29%和50.0%，从图3中也可以看出，使用本发明菌肥对黄瓜枯萎病 的防治效果最佳。
[0091] 表4菌肥对黄瓜枯萎病的防治效果
[0094]七、种衣剂的使用
[0095]将本发明的种衣剂与种子搅拌均匀，使孢子粉剂均匀包衣在种子表面，即完成生 防菌对黄瓜种子的丸化包衣处理，种衣剂与种子的重量比为1: l〇(w/w)。
[0096]将不同的化学药剂对黄瓜细菌性茎软腐病的田间药效进行对比，通过9种化学药 剂和2种生防菌剂对黄瓜细菌性茎软腐病的田间药效看出：本实验所用的生防菌剂和市售 杀菌剂对黄瓜细菌性茎软腐病的防治效果都在65 %以下。其中溴硝醇、噻菌铜、氢溴异氰尿 酸、乙蒜素和芽孢杆菌和本发明的种衣剂防效较高，分别为63.43%、62.67%、63.43%、 61.60%、60· 00%和62.67% (见表5和图4)。
[0097] 表5不同药物对黄瓜细菌性茎软腐病的田间药效
[0099]所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说 明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均 同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包括重量百分比为5~10%的PGPR菌液，所述 菌剂中含有PGPR活菌量不少于I X 101()CFU/ml。2. 根据权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述PGPR菌液为嗜麦芽寡养单胞菌菌 液。3. 根据权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述菌剂由以下重量份的成分组成： PGPR菌液5~10份、食用菌菌糠50~70份、黄粉虫虫粪5~25份、黄腐酸1~5份、FeS〇4 · 7H20 0.01 ~0.02份和ZnS〇4 · 7H20 0.01~0.03份。4. 根据权利要求3所述的生物菌剂，其特征在于，所述食用菌菌糠可以用草炭或生物炭 代替。5. 根据权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述菌剂由以下重量份的成分组成： PGPR菌液50~100份、营养载体6~14份、硅藻土600~800份、羧甲基纤维素钠10~20份、木 质素磺酸钠60~80份、聚乙烯醇10~20份、FeS〇4 · 7H20 1~2份和ZnS〇4 · 7H20 1~3份，所 述营养载体由腐殖酸1~2份、谷氨酸2~5份和玉米粉3~7份组成，所述菌液中含有PGPR活 菌量为 1 ~2 X 101()CFU/ml。6. -种如权利要求3或4所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下 步骤： (1) 首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋白胨 IOg，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4 1 · 5g，K2HPO4 1 · 5g和甘油IOml，pH值7 · 5; ADF培养液配方为： KH2PO4 4.0g，Na2HP〇4 6.0g，MgS〇4.7H2〇 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖0|2.Og，梓檬0|2.Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!1 20 111^，!138031(^8， MnS〇4.H2〇11.19yg，ZnS〇4*7H2〇124.6yg，CuS〇4.5H2〇 78.22yg，Mo〇3lOyg，pH{tS7.2; 所述TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2耶〇4 2.5g，其 pH 值为 7.5; (2) 采集海边盐渍植物的根际土壤，称取Ig根际土放入含50ml PAF培养液的三角瓶中， 25°C或30°C、振荡速度为200r/min的条件下振荡培养24h，然后富集培养4d后，再转移Iml菌 悬液至50ml ADF培养液中，继续25°C或30°C、振荡速度为200r/min条件下振荡培养48h，用 于含ACC脱氨酶活性细菌的分离纯化，梯度稀释ADF培养液中菌悬液，涂布于ADF固体平板 上，在温度为28 °C的恒温箱中培养72h，划线分离，纯化后-80 °C保存； (3) 将纯化鉴定后的PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，温度为28~30°C，振荡速度为 200r/min的条件下振荡培养24h，测定菌悬液OD值达到0.8以上，菌量不少于10 1()CFU/ml后， 用食用菌菌糠吸附，然后再分别加入黄粉虫虫粪、黄腐酸、FeSO4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,并且 将含水量调成60%后用塑料薄膜覆盖进行发酵直到黄粉虫虫粪完全腐熟，用搅拌机搅拌均 匀，装袋，即得生物发酵菌肥。7. -种如权利要求5所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤： (1)首先制备PAF培养基、ADF培养液和TSB液体培养基，所述PAF培养基配方为：蛋白胨 IOg，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4 1 · 5g，K2HPO4 1 · 5g和甘油IOml，pH值7 · 5; ADF培养液配方为： KH2PO4 4.0g，Na2HP〇4 6.0g，MgS〇4.7H2〇 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖0|2.Og，梓檬0|2.Og，硫 酸铵2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!1 20 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和MoO3 10yg，pH值为 7.2;所述TSB液体培养基的配方为:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇4 2.5g，其 pH 值为 7.5; (2)将PGPR菌株接种于TSB液体培养基中，在温度为28~30°C、振荡速度为200r/min的 条件下振荡培养24h，测定菌悬液OD值达到0.8以上、菌量为1~2 X 101()CFU/ml时，用所述营 养载体和灭菌后的硅藻土进行吸附，然后分别加入所述羧甲基纤维素钠粘着剂、木质素磺 酸钠分散剂、聚乙烯醇成膜剂、FeSO 4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均匀后即得种衣剂。8. 根据权利要求7所述生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述种衣剂在使用时与种子 混合搅拌均匀，使种衣剂均匀包裹在种子表面，完成种衣剂对种子的丸化包衣处理，所述种 衣剂与种子的重量比为1:10。9. 权利要求1~5任一项所述的生物菌剂的用途，其特征在于，所述生物菌剂用于防治 黄瓜枯萎病、黄瓜炭疽病、黄瓜细菌性角斑病和/或黄瓜细菌性茎软腐病。
【文档编号】A01P1/00GK105950509SQ201610362310
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】贺字典, 高玉峰
【申请人】河北科技师范学院