微生物的检查方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物的检查方法，特别是涉及适于检测包含在压载水等中而存活的浮游生物等微生物的微生物的检查方法。
【背景技术】
[0002]未搭载货物的船舶为了使该船舶稳定而搭载压载水航行，在搭载货物的海域将上述压载水排出。
[0003]压载水通常在与搭载的海域不同的海域排出，因此有可能将该压载水所含有的浮游生物、细菌等微生物搬运至原来的栖息地以外的海域，引起破坏生态系等问题。
[0004]为了解决这样的问题，制定与压载水的限制有关的国际规则，通过了“用于限制并管理船舶的压载水及沉殿物的国际条约(压载水管理条约)”。
[0005]就与上述压载水管理条约相关的“关于压载水采样的指标(G2)”而言，在“压载水排出基准(D-2)”中，将从船舶排出的压载水所含有的存活的微生物的允许个体数根据所述微生物的最小尺寸区分而规定的，例如，关于最小尺寸50μπι以上的微生物(以下，称为“L尺寸生物” ο)，规定为10个/m3以下，关于最小尺寸为ΙΟμ??以上且小于50μηι的微生物(以下，称为“S尺寸生物”。)，规定为10个/mL以下。
[0006]目前为止，作为排出上述压载水时用于确认是否满足上述排出基准的方法，已知如下微生物检查装置:专利文献1所记载的使以送水栗抽取的海水通过流动池而测量图像的微生物检查装置专利文献2所记载的使以送水栗抽取的海水通过网眼不同的滤波器单元，使滤波器上的微生物发光，计算微生物的微生物检查装置等。
[0007]上述专利文献1所记载的微生物检查装置，包含:染色部，在使液体检测物流动的同时，使存在于该检测物中具有活细胞的生物染色;浓缩部，在使所述经施行染色的检测物流动的同时，进行浓缩，以提高所述生物的浓度;个体测量部，取得所述经浓缩的检测物中包含所述生物的个体的图像信息；及控制机构，根据由所述个体测量部输出的所述个体的图像信息，测定该生物。
[0008]由此，可以以流动方式进行检测物液体中生物的染色工序、液体中生物的浓缩工序，液体中生物的信息获取的工序等，因此与以分批方式进行各方式的方法相比，能够大幅缩短一个工序结束的检测物的一部分进展至下一个工序为止的待机时间，或使其为0，防止在待机时间染色的状态劣化，从该意义来讲，具有能够稳定取得生物生死的信息的优点。
[0009]然而，上述专利文献1所记载的微生物检查装置，使由送水栗抽取的海水依次通过各种工序，从而存在装置庞大、且制造成本高的问题。此外，虽然依次通过各种工序而缩短待机时间，但存在直到测定结束为止至少需耗费数小时这样的问题。
[0010]此外，上述专利文献2所记载的微生物检查装置的特征在于，具备如下工序:使海水通过将网眼不同的3种滤波器串联配置而成的滤波器单元的工序;产生由滤波器捕获且存活的微生物造成的发色、发光及荧光中任一者的工序;及检测发色、发光及荧光中任一者，利用图像分析计算压载水或海水中的微生物数的工序。
[0011]由此，能够实现阶段性地捕捉每一尺寸的微生物，其结果，具有能够迅速测定是否满足按每一尺寸的基准限制的允许残存基准这样的优点。
[0012]然而，专利文献2所记载的微生物检查装置也与专利文献1同样，使以送水栗抽取的海水依次通过各种工序，从而具有装置庞大、制造成本高的问题。
[0013]在此，鉴于上述问题，本申请人通过专利文献3提出一种微生物的检查方法，该微生物的检查方法通过利用分批式的测定池，能够简便地且在短时间内，并以高精度测定压载水中微生物的量。
[0014]本申请人提出的微生物的检查方法具备:搅拌混合工序，在分批式的试样容器内，将试样中添加有荧光染色试剂的试样溶液搅拌、混合;激发工序，在搅拌所述试样溶液的同时，对所述试样容器的被照射面照射激发光;受光工序，对通过所述激发光而荧光发光的微生物的荧光进行计数;及微生物数推定工序，根据通过该受光工序检测的发光数，计算试样容器中试样所含有的微生物量。
[0015]由此，具有如下作用、效果:能够在极短时间内使微生物明亮地发光，简便地且在短时间内测量压载水中微生物的量，且由于荧光发光的厚度部分薄，因此背景与微生物的荧光发光的光量差非常明确，能够提高微生物荧光发光的检测精度。
[0016]作为上述微生物的检测原理，例如图6所示，利用光电增倍管，以电信号检测荧光染色的浮游生物等微生物，将连续检测到的例如约0.9V的电压的背景成分与存活的浮游生物通过的荧光强度进行比较，能够根据浮游生物通过时荧光强度的峰的高度、即电压的高度，与背景成分区别。在此，所谓背景成分，是指样品水本身的荧光即自身的荧光、染色剂在样品水中自然分解而发出荧光。
[0017]然而，就上述提出的方案而言，存在随着背景成分增大，干扰成分也变大的倾向，其结果，背景成分增大后S/N比降低，存在对检测精度造成影响这样的问题。
[0018]现有技术文献
[0019]专利文献
[0020]专利文献1:日本特开2009 — 85898号公报
[0021]专利文献2:日本特开2007 —135582号公报
[0022]专利文献3:日本特开2014 — 042463号公报
【发明内容】
[0023]发明所要解决的课题
[0024]鉴于上述问题，本发明的技术课题在于提供一种微生物的检测方法，其能够减少背景成分的荧光发光而提高检测精度。
[0025]用于解决课题的方法
[0026]根据本发明的微生物的检查方法，用于测定试样中的微生物量，所述试样中的微生物量的测定包括:将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序;及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，所述试样调制工序包括:将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序;将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序;及以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液的稀释工序。
[0027]在所述荧光染色工序中，可以向试样容器投入该试样容器整体容积的1?10%容量的试样，且向所述试样容器中投入相对于所述试样1容量为1%容量的荧光染色试剂，并搅拌、混合。进而，作为所述荧光染色试剂，也可以使用Π)Α，并添加至其在稀释前试样中的浓度为0.0lmM。
[0028]根据本发明的微生物的检查方法，用于测定试样中的微生物量，所述试样中的微生物量的测定包括:试将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序;及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，所述试样调制工序包括:将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序;将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序;及向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂的pH调节工序。在所述pH调节工序中，也可以在所述荧光染色工序的溶液的pH为8.0时，在该pH调节工序中添加pH调节剂，以使pH为6.0。
[0029]发明的效果
[0030]根据本发明的微生物的检查方法，首先，在荧光染色工序中将荧光染色试剂与少量的试样搅拌、混合，接着，在静置工序中静置溶液一定时间，进而在稀释工序中以不发出荧光的液体稀释。由此，在所述荧光染色工序中搅拌、混合少量的试样中所含有的微生物与荧光染色试剂，以几乎没有不均的状态确实染色，在所述稀释工序中添加稀释液时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。在此，如果在所述荧光染色工序中，向试样容器中投入该试样容器整体容积的1?10%容量的试样，且向所述试样容器中投入相对于所述试样1容量为1%容量的荧光染色试剂，并搅拌、混合，则能够进一步提高检测精度。进而，作为荧光染色试剂，使用FDA，并添加至其在稀释前试样中的浓度为0.0lmM时有效。
[0031]此外，本发明的微生物的检查方法中，所述试样调制工序包括:将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序;将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂的pH调节工序，例如在荧光染色工序中试样的pH若为弱碱性，则试样中所含有的微生物与荧光染色试剂被搅拌、混合，以几乎没有不均的状态确实染色，在该pH调节工序中添加pH调节剂而试样的pH为弱酸性时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。此时，如果在所述pH调节工序中，在所述荧光染色工序的溶液的pH为8.0时，在该pH调节工序中添加pH调节剂，以使pH为6.0，则能够进一步提尚检测精度。
【附图说明】
[0032]图1是第1实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
[0033]图2是第2实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
[0034]图3是应用于微生物的检查方法的检查装置的概略图。
[0035]图4(a)?(b)是显示背景成分中，未稀释者的一例的电压波形图。
[0036]图5(a)?(b)是显示背景成分中，稀释者的一例的电压波形图。
[0037]图6是显示比较以往的背景成分与存活的浮游生物通过的荧光强度的电压波形图。
【具体实施方式】
[0038]图1是第1实施例的微生物的检查方法的概略工序图，图2是第2实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
[0039]如图1及图2所示，微生物的检查方法包括:试样调制工序，采集压载水作为试样，将该试样与荧光染色试剂搅拌、混合，调制试样;及微生物量计算工序，使用微生物检查装置1，根据对试样调制工序调制的试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数，计算微生物量。
[0040]本发明的第1实施例中，所述试样调制工序包括:荧光染色工序，将一定量的试样及该荧光染色试剂搅拌、混合;静置工序，将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间；及稀释工序，以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液。
[0041]此外，在第2实施例中，所述试样调制工序包括:荧光染色工序，将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合;静置工序，将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间；及pH调节工序，向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂。
[0042]参照图1说明第1实施例的试样调制工序。操作人员预先准备例如容积为100ml的试样容器2，该试样容器2由例如玻璃、石英、丙烯酸树脂等透射光的